成年斑马鱼腹腔注射

本实验的总体目标是将溶液注入成年斑马鱼的腹膜腔。在本示例中，我们将在实验室中注射葡萄糖。我们利用该操作研究血糖滞留情况。

首先通过称量鱼的体重，以确定每克体重需要注射的溶液量，从而完成该操作。实验的第二步是用冷水将鱼麻醉。第三步是将鱼转移至显微镜载物台上并进行注射。

该实验步骤的最后一步是将鱼放回水箱中以恢复。最终，可通过测量血糖水平获得显示葡萄糖稳态变化的结果。大家好，我是来自芝加哥大学有机体生物学与解剖学系 Victoria Prince 实验室的 Mary Kinkle。

我是来自Prince实验室的Stephanie Ames。今天我们将向您展示一种对成年斑马鱼进行腹腔注射的操作方法。在我们的实验室中，利用该方法研究血糖稳态的调控机制。

下面我们开始。准备用于注射的鱼类时，首先将鱼转移到干净的水族箱中，并禁食。禁食24小时以排空肠道囊内容物，禁食72小时以使血糖降至基础水平。

本方案中使用的密度为每9升水箱饲养10至12条混合性别的鱼类，水箱中放置三层弹珠，弹珠可隔离鱼卵，防止其被吃掉。通过虹吸法每天移除鱼卵和废物。

接下来，配制Cortland盐溶液：将124.1毫摩尔氯化钠、5.1毫摩尔氯化钾、2.9毫摩尔焦磷酸钠、1.9毫摩尔七水合硫酸镁、1.4毫摩尔二水合氯化钙、11.9毫摩尔碳酸氢钠、4克聚乙烯酮以及1000 USP单位肝素溶于去离子水中，定容至100毫升，过滤除菌后于4摄氏度保存。随后，将5克葡萄糖溶解于10毫升Cortland盐溶液中，配制成0.5毫克/微升的葡萄糖溶液，过滤除菌后于4摄氏度保存。

然后准备手术台：将一块软质海绵切割至平面高度约为20毫米，在其中切出一个深10至15毫米的切口，用于固定注射时的鱼体。将海绵放入直径60毫米的培养皿中，并将装有海绵的培养皿置于P200移液器吸头盒的盖子上。

接下来，用塑料薄膜和纸巾覆盖显微镜底座以进行保护。若发生液体溢出，将手术台置于纸巾上方。通过观察手术台并对准海绵来预先调节焦距。

将手指放在海绵上方，并专注于该位置，以便在鱼被放置于手术台后尽量减少进一步的焦距调整。称重时，先用鱼类养殖用水将一个500毫升的烧杯装至约三分之一满，然后将鱼连同少量多余的水一起用网转移到天平上的烧杯中，记录重量。将每条称重后的鱼转移至一个标明标签的透明水箱中。

根据体重计算注射体积。在此示例中，我们将注射浓度为每克体重0.5毫克的葡萄糖溶液，该溶液溶解于Cortland生理盐水中。由于我们的溶液浓度为每微升0.5毫克，因此计算方法为：鱼的体重（克）乘以1，即为需注射的体积（微升）。准备好注射器及相关注射设备。

本方案使用30G斜面钢针、超微泵和Micro Four处理器，以及10微升NanoFil微量注射器进行葡萄糖注射。将葡萄糖溶解于Cortland盐溶液中，配制成浓度为0.5毫克/微升的溶液，并注入注射器。务必从注射器中完全排除所有气泡，然后将注射器安装到超微泵上，并通过Micro Four处理器上的数字小键盘输入以纳升为单位的注射体积，设定第一条鱼的注射量。最后，通过粉碎由鱼类养殖用水制成的足够量冰块，制备冰麻醉剂。

为了装满冰桶，将手术台放入较大的容器中，例如一个2.4升的橡胶制食品储存盒。将一些温的实验用水倒入外层容器和手术台中。在附近准备一个备用的温实验用水储水罐。

将温度计连接到麻醉外容器上。将麻醉外容器及手术台放置在显微镜旁。将装有冰屑的桶放在附近。

开始加入冰块，直到水温降至17摄氏度。此步骤中水温不得低于17摄氏度。使用网具将鱼转移到外层容器中。

在17摄氏度或略低温度下，鱼类通常会将胸鳍水平展开，出现喘息及心房快速运动。数分钟内逐渐向容器中加入冰屑，使温度降至12摄氏度。随着温度下降，鱼类游动速度逐渐减慢，最终停止游动。

最终，鱼的鳃盖运动将停止，心房活动也会减慢。当鱼对操作无反应时，即可进行注射。达到所需温度后，按压海绵使其充分浸透。

将手指充分浸在冷水中，以免手指温度升高而使鱼体升温，导致其从麻醉状态中苏醒。用冰冷的手指轻轻将鱼转移到海绵的凹槽中，使鱼腹部朝上，鳃部置于凹槽内。

迅速将手术台转移到显微镜载物台上。操作需迅速且谨慎地调整针头位置，使针尖朝向头侧，且距离骨盆带比肛门更近。将针头插入腹鳍之间的中线位置。

当针头穿过腹壁时，你应该能够感觉到阻力的变化。进针时，可以感受到腹壁的突破感。当针头进入腹腔后，使用微量注射器注入适当体积的液体。

使用脚踏板，按每克鱼体重注射一微升的剂量进行注射。注射后，取出针头，并立即将鱼放回其温水水箱中恢复。在水箱水面上方将鱼从海绵上松开，检查显微镜下的针头，偶尔会有鱼鳞附着，应在下一次注射前将其清除。

经过适当的时间后，继续进行下游检测。我们发现，在注射前需要进行 72 小时的禁食，以使血糖降低至基线水平。在本图中，以绿色显示的未注射对照组数据，其血糖值与此处以红色显示的载体注射对照组相比，无显著差异。

然而，蓝线显示了注射葡萄糖后斑马鱼的血糖值，反映了循环葡萄糖的上升与下降。随着时间推移，注射葡萄糖组和注射载体组的动物在注射过程中均处于手术麻醉状态，而未注射的对照组则未接受手术麻醉。我们刚刚向您展示了如何对成年斑马鱼进行腹腔注射。

在我们的实验室中，我们研究腹腔注射葡萄糖溶液后不同时间点血糖浓度的变化。然而，我们刚刚向您展示的这种技术可用于注射您感兴趣的溶液。在进行该操作时，请记住要缓慢麻醉斑马鱼，并轻柔地进行操作。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。