用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

本实验的总体目标是制备可变形的基质，用于调控和量化细胞收缩。首先通过活化盖玻片，使其能够锚定基质；实验的第二步是在活化的盖玻片上聚合丙烯酰胺凝胶。

该实验步骤的第三步是将细胞接种到凝胶上，并使其贴附。实验的最后一步是对凝胶进行成像，以获取可用于牵引力显微镜分析的数据。最终，可通过牵引力显微镜获得结果显示细胞对其基质施加了牵引力。

大家好，我是来自芝加哥大学物理系及生物物理动力学研究所Margaret ELL实验室的Yvonne Eons。我是同样来自Guard实验室的Steven Winter。今天我们将向您展示一种用于测量细胞收缩的可变形基质的制备方法。

我们在实验室中使用这些步骤来研究收缩性肌动蛋白-肌球蛋白网络。现在让我们开始。在盖玻片活化之前，预先放置数个 22 × 40 毫米、1.5 号的盖玻片。

将盖玻片置于不锈钢架中，用70%乙醇冲洗，确保盖玻片之间保持间距且不相互接触。在化学通风橱中操作，于方形玻璃皿内用异丙醇配制2%三或微量轮廓三甲基溶液。使用玻璃移液管加入三或微量轮廓三甲基。

由于三甲氧基具有与塑料反应的活性，因此需将盖玻片完全浸入该溶液中，并在通风橱内的搅拌器上搅拌孵育10分钟。浸泡完成后，通过将盖玻片浸入双蒸水中进行清洗。最后一次换水后，共更换四次水。

静置孵育10分钟，并持续搅拌。然后将盖玻片置于约37摄氏度的培养箱中干燥10分钟。干燥后，使其冷却至室温。

将盖玻片浸入双蒸水中含1%戊二醛的溶液中，在搅拌仪上的玻璃方皿中处理30分钟。务必使用洁净的器皿。

否则，溶液之后可能出现浑浊。用双蒸水洗涤盖玻片，每次10分钟，共换液三次，期间持续搅拌。接着，用铝箔覆盖盖玻片以防止灰尘污染，并在室温下干燥。

干燥后，将盖玻片存放于干燥、无尘处，可保存长达两个月。制备聚丙烯酰胺（PAA）凝胶时，首先配制丙烯酰胺双丙烯酰胺储备液，按RI方案所述，使用40%丙烯酰胺和2%双丙烯酰胺配制丙烯酰胺双丙烯酰胺混合液。

将丙烯酰胺溶液置于真空室中脱气 20 分钟。此步骤可减少凝胶中的氧气，从而防止聚合反应发生。同时，配制 10% 过硫酸铵溶液或 PS 溶液。

然后用Rain X擦拭巾擦拭尺寸为1英寸×3英寸的显微镜载玻片，使载玻片表面具有疏水性。使用Kim擦拭巾去除任何灰尘，以确保凝胶表面光滑。用铝箔覆盖载玻片并置于一旁备用。

然后将丙烯酰胺溶液从真空室中取出，并加入荧光微球。为启动凝胶聚合，加入 0.75 µL 的 TM E 和 2.5 µL 的 10% APS。通过上下吹打混匀溶液。接着，取 10 至 12 µL 丙烯酰胺溶液滴加到先前准备好的疏水性显微镜载玻片上。

将一块已活化的 22 × 40 毫米盖玻片置于液滴上方，使凝胶溶液覆盖整个盖玻片。轻轻展平溶液中可能出现的任何气泡。

将凝胶溶液在室温下静置约10分钟，使其充分聚合。聚合完成后，凝胶会从盖玻片边缘收缩脱离。使用镊子的细尖端，小心地将附着有凝胶的盖玻片从显微镜载玻片表面移除。

将凝胶浸入含有双蒸水的培养皿中，以保持凝胶表面湿润，从而将细胞外基质（ECM）蛋白交联至凝胶上。首先，通过将SULF san par粉末溶解于无水二甲基亚砜（DMSO）中，制备40微升的工作分装液。接着，使用盖玻片离心器短暂去除凝胶表面的双蒸水。

使用前注意不要让凝胶立即干燥。将二甲基亚砜中的硫磺Sampa等分试样用双蒸水稀释，并在凝胶表面中央涂布约200微升。然后将凝胶表面置于紫外交联仪中暴露于紫外光下。

紫外线照射后，将盖玻片浸入盛有新鲜重蒸水的烧杯中。使用盖玻片旋转仪去除凝胶表面的任何溶液。然后将盖玻片放入培养皿中，并在盖玻片上加入50微升冷的纤连蛋白溶液。

将盖玻片倒置，使凝胶面朝上置于纤连蛋白上。室温下反应一至两小时，或在4°C下过夜反应。随后在无菌细胞培养通风橱中孵育。

将盖玻片放入含有 PBS 的 6 厘米组织培养皿中，以包被盖玻片。在无菌条件下，用 PBS 多次更换洗涤盖玻片。通过紫外照射处理 30 分钟对盖玻片进行灭菌。

随后，在接种细胞前，将盖玻片置于细胞培养基中孵育30至45分钟。接下来，将22 mm × 30 mm的盖玻片放置于Warner Instruments共聚焦成像室的上部盖玻片支架上，并使用真空脂固定盖玻片。在盖玻片上方放置一个用于形成腔室的橡胶垫圈，以便接入进样口和出样口的聚乙烯管。

这将使顶部盖玻片与凝胶包被的22 × 40毫米盖玻片之间的间距根据所用垫圈的尺寸在150至1000微米之间。然后通过连接套件将装有温热细胞培养基的注射器连接到进样管路，检查培养基是否流经管路并到达顶部盖玻片。在腔室底部涂抹真空脂，将凝胶包被的22 × 40毫米盖玻片（细胞面朝上）放置到位。

将预热的培养基加入细胞中。将顶部盖玻片支架放置在腔室底座上，腔室密封垫应位于支架与包被有凝胶的盖玻片之间。确保腔室底座内的定位销插入顶部盖玻片的定位孔中。

将压力板安装到腔室底座上，并使用压力板扳手拧紧并固定压力板。检查培养基在管路和腔室中的流动情况，以监测腔室内是否存在潜在泄漏，并消除细胞表面任何无培养基区域。

将共聚焦成像腔室安装至显微镜支架内的载物台适配器上，使用共聚焦荧光显微镜对凝胶基质中嵌入的荧光标记蛋白和荧光微珠进行成像，以获取凝胶灌注中未受应变时微珠位置的图像。进行多次实验以使细胞黏附从凝胶上脱离，并在同一成像视野中采集荧光微珠的图像，该视野即为细胞已被去除的区域。若严格按照本方案操作，凝胶表面将相对平坦光滑，且荧光微珠在凝胶中分布均匀。

细胞外基质（ECM）也可通过纤维连接蛋白免疫荧光进行可视化。若需在黏着斑位置测量凝胶收缩，则应在黏着斑的共聚焦光学平面上对凝胶和细胞进行成像。在此，黏着斑通过吸引力实验在表达GFP pxi标记的人骨肉瘤细胞或U2 OS细胞中显示。

通过观察嵌入在凝胶中荧光微珠在黏着斑下方的位移，可以可视化凝胶的收缩。通过比较绿色显示的受力微珠与红色显示的未受力微珠位置，可在此处定量分析凝胶基质在收缩过程中的位移。此为代表性结果，显示一个铺展细胞经胰蛋白酶处理后从凝胶表面脱离。以下为比较受力与未受力微珠位置时的代表性结果。

利用复杂的计算算法，可以得到与微珠位移和凝胶弹性模量相关的牵引力。这些应力在此处通过热图尺度和矢量进行可视化，热图中较暖的色彩以及更大的箭头表示更强的作用力。我们刚刚向您展示了在执行此操作时，如何制备用于测量细胞收缩的可变形基质。

提前规划非常重要，以便能够快速执行对时间敏感的步骤。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。