Name: 投诉矩阵量化细胞收缩的准备工作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学习制备聚丙烯酰胺凝胶基质用于细胞培养，通过牵引力显微镜量化细胞收缩力。该方法可研究细胞外基质刚度对细胞行为的影响，为细胞生物学研究提供重要数据。

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感谢Ulrich Schwarz实验室提供了用于量化细胞牵引力的计算追踪软件（Sabass et al.，2008）。本研究得到了M.L. Gardel获得的Burroughs Wellcome职业奖和NIH主任先锋奖（DP10D00354）以及S.P. Winter获得的医学科学家国家研究服务奖（5 T32 GM07281）的支持。

1. 激活盖玻片表面
<ol>
<li>	盖玻片（#1.5，22×40 mm）按照先前描述的方案（Waterman-Storer, 1998）通过一系列皂液和乙醇清洗步骤进行清洁，以去除灰尘。</li>
<li>	将盖玻片放入不锈钢支架架中，确保盖玻片之间保持间距且不相互接触。</li>
<li>	在化学通风橱内（建议佩戴丁腈手套和护目镜），将纯浓度的3-氨基丙基三甲氧基硅烷用异丙醇稀释至终浓度为2%（2 ml 硅烷 / 100 ml 异丙醇），倒入方形玻璃皿中（约350 ml 体积）。由于该试剂对塑料具有反应性，应使用玻璃巴斯德吸管将3-氨基丙基三甲氧基硅烷加入异丙醇中。</li>
<li>	将步骤1.2中的盖玻片完全浸入该溶液中，在通风橱内的搅拌器上轻轻搅拌，反应10分钟。</li>
<li>	通过将盖玻片浸入去离子水（ddH2O）中进行清洗，共更换4次水。最后一次换水后静置浸泡10分钟，并持续搅拌。含氨基硅烷的溶液应作为危险废物处理。</li>
<li>	在无尘环境中，将盖玻片置于培养箱中于温暖温度（约37°C）下干燥10分钟。</li>
<li>	冷却至室温。</li>
<li>	在通风橱内，将盖玻片浸入盛于玻璃方皿中的1%戊二醛水溶液（ddH2O配制）中，并置于搅拌器上搅拌反应30分钟。</li>
<li>	用去离子水（ddH2O）洗涤3次，每次10分钟，期间持续搅拌。戊二醛溶液应作为危险废物处理。</li>
<li>	在室温下干燥，并用铝箔覆盖，以防止灰尘附着在盖玻片上。</li>
<li>	储存于干燥、无尘环境中，最长可保存2个月。</li>
</ol>
2. 聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的制备
<ol>
<li>	根据表1，从40%丙烯酰胺和2%双丙烯酰胺配制丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合储备液。我们制备了多种储备液，用于优化不同刚度的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶；示例见表1和表2。只要将储备液保存在避光瓶中并在4°C下储存，可保存数年。</li>
<li>	工作液中丙烯酰胺/双丙烯酰胺的最终所需浓度由储备液稀释获得。例如，我们用ddH2O配制7.5%丙烯酰胺/0.10%双丙烯酰胺的工作液，用于制备2.8 kPa的PAA凝胶。</li>
<li>	将丙烯酰胺溶液置于真空室中脱气20分钟，以减少溶液中的氧气，防止PAA聚合受阻。</li>
<li>	配制10%过硫酸铵（APS）溶液（0.5 g/5 mL）。新鲜工作液应在3天内使用完毕。也可将储备液冷冻保存，供日后使用。</li>
<li>	在丙烯酰胺脱气的同时，用力用Rain-X擦拭布擦拭1×3英寸显微镜玻片，使玻片表面具有疏水性。为去除多余的Rain-X，用湿润的Kimwipe纸轻轻擦拭玻片。将玻片盖好，置于一旁备用。</li>
<li>	将丙烯酰胺溶液从真空室中取出，加入荧光微球（体积比1%，表1所列工作液中加入5 μL）。加入0.75 μL TEMED和2.5 μL 10% APS，以启动凝胶聚合反应。用移液器吹打约5秒，充分混匀，同时尽量减少气泡产生。</li>
<li>	取10–12 μL丙烯酰胺溶液滴加至疏水性显微镜玻片（步骤2.4中制备）上，然后将活化的22×40 mm盖玻片覆盖在液滴上。凝胶溶液应覆盖整个盖玻片表面。轻轻排除溶液中可能出现的气泡。室温下静置约10分钟，使凝胶完成聚合。</li>
<li>	可通过将剩余工作液倒置在微量离心管中判断聚合是否完成。此外，聚合完成的凝胶可能会从盖玻片边缘收缩。一旦观察到宏观聚合完成，立即小心分离盖玻片与显微镜玻片。使用镊子尖端或刀片边缘，小心地将附着凝胶的盖玻片从玻片表面取下，并浸入ddH2O中，以保持凝胶水合状态。</li>
</ol>
3. 将细胞外基质（ECM）蛋白偶联到PAA凝胶上
可采用三种不同的方法将细胞外基质（ECM）蛋白连接到聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的上表面（3.1 和 3.2）或将其整合到凝胶内部（3.3）。本文讨论将纤连蛋白偶联到PAA凝胶的方法，以获得与在10 μg/mL纤连蛋白溶液中孵育1小时后吸附在玻璃表面的蛋白量相当的表面配体密度。选择方法时的考虑因素将在讨论部分详细说明。
<ol>
<li>	使用 Sulfo-SANPAH 将 ECM 蛋白交联至 PAA 凝胶表面
通过异双功能交联剂 Sulfo-SANPAH 将蛋白质上的反应性胺基共价连接至 PAA 凝胶表面
<ol>
<li>	通过将 Sulfo-SANPAH 粉末溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中制备 40 μl 的工作分装液（每毫克 Sulfo-SANPAH 使用 20 μl DMSO）。用液氮速冻分装液，并于 -80°C 保存以备后续使用。</li>
<li>	使用盖玻片旋转仪去除凝胶表面的 ddH2O（< 2 秒）。避免使凝胶干燥。</li>
<li>	使用前立即用 ddH2O 稀释 Sulfo-SANPAH-DMSO 分装液至 2 mg/ml（pH 7），并涂覆凝胶表面（约 200 μl）。注意 Sulfo-SANPAH 在水中室温下的反应半衰期较短（约 5 分钟），因此这些步骤应迅速完成。</li>
<li>	将凝胶表面置于紫外交联仪中暴露于紫外光下（8 W，波长 254 nm，距离 2–3 英寸，照射 1.5 分钟）。Sulfo-SANPAH 的颜色将由橙色变为棕色。</li>
<li>	将经紫外处理的盖玻片浸入盛有新鲜 ddH2O 的烧杯中，再用盖玻片旋转仪去除凝胶表面多余水分（< 2 秒）。</li>
<li>	在培养皿内的 Parafilm 上加入约 50 μL 冷的 1 mg/ml 纤连蛋白（FN）溶液（溶于 PBS，pH 7.4）。将盖玻片倒置在 FN 液滴上，使凝胶面接触 FN。</li>
<li>	在室温下反应 1–2 小时，或在 4°C 下过夜。</li>
<li>	在无菌条件下，将盖玻片置于含有 PBS（pH 7.4）的 6 cm 组织培养皿中，液量需足以覆盖盖玻片，操作在组织培养超净台中进行。</li>
<li>	在无菌条件下，用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。</li>
<li>	在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片灭菌 30 分钟。</li>
<li>	在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。</li>
</ol></li>
<li>	使用水合肼将 ECM 交联至 PAA 凝胶表面
利用水合肼将蛋白质上的糖基氧化并偶联至凝胶表面。
<ol>
<li>	按照第 2 节所述方法制备聚丙烯酰胺凝胶。</li>
<li>	在通风橱中，将 PAA 凝胶盖玻片置于塑料培养皿内，戴手套后向每片 PAA 凝胶表面加入约 1 ml 未稀释的水合肼，孵育至少 2 小时，但不超过 24 小时。</li>
<li>	向培养皿中加入 ddH2O；移除水合肼溶液，并作为危险废物妥善处理。</li>
<li>	向培养皿中加入 5% 乙酸以浸没盖玻片。盖上盖子，孵育 1 小时。</li>
<li>	移除乙酸，用 ddH2O 洗涤。在 ddH2O 中孵育 1 小时。此时盖玻片已被活化，可进行氧化纤连蛋白（FN）的交联。</li>
<li>	在避光的微量离心管中，将 10 μl 的 1 mg/ml FN 溶液加入 940 μl 的 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中，终浓度为 10 μg/ml。</li>
<li>	通过将 80 mg 的偏高碘酸钠加入 1 ml 的 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中，制备 20X 偏高碘酸钠储备液。</li>
<li>	向步骤 3.2.6 制备的 FN 溶液中加入 50 μl 的 20X 偏高碘酸钠储备液，使终工作浓度为 10 μg/ml FN 和 4 μg/ml 偏高碘酸钠。在避光离心管中室温孵育 30 分钟。</li>
<li>	使用盖玻片旋转仪去除步骤 3.2.5 制备的活化凝胶表面的多余 ddH2O（< 2 秒）。避免使凝胶干燥。</li>
<li>	向活化凝胶表面加入约 500 μl FN 溶液，室温孵育 1 小时。</li>
<li>	将盖玻片置于含有 PBS（pH 7.4）的培养皿中，液量需足以覆盖盖玻片。</li>
<li>	用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。</li>
<li>	在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片灭菌 30 分钟。</li>
<li>	在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。</li>
</ol></li>
<li>	通过丙烯酰基-X 琥珀酰亚胺酯在 PAA 凝胶本体中进行 ECM 蛋白的共价偶联
该方案在步骤 2.5 之前进行。利用 NHS 酯化学将蛋白质上的反应性胺基偶联至丙烯酰胺单体，随后共聚进入 PAA 凝胶本体。
<ol>
<li>	根据制造商说明书将所选 ECM 蛋白与丙烯酰基-X 偶联。偶联蛋白的储备液应于 4°C 保存。</li>
<li>	计算凝胶制备所需的 PAA 工作液体积（例如，每片盖玻片 10 μL）。</li>
<li>	从表 1 所列工作液配方中扣除 50 μL（例如 10% 体积）的水，并启动聚合反应。</li>
<li>	取出步骤 3.3.2 计算出的体积，加入 ECM/丙烯酰基-X 溶液至总体积的 10%（例如，1 μL ECM/丙烯酰基-X 加入 9 μL PAA 溶液）。此步骤应迅速完成，因凝胶正在聚合。</li>
<li>	按前述方法完成步骤 2.6 和 2.7。</li>
<li>	在无菌条件下，用 PBS（pH 7.4）充分洗涤多次（3–5 次）。</li>
<li>	在组织培养超净台中使用杀菌灯对盖玻片灭菌 30 分钟。</li>
<li>	在接种细胞前，将盖玻片在细胞培养基中孵育 30–45 分钟。</li>
</ol></li>
</ol>
4. 将盖玻片装入共聚焦成像腔
在细胞于ECM包被的凝胶基质上铺展后（约6-12小时），进行以下步骤。组装共聚焦成像室（RC-30WA）时，建议参考Warner Instruments公司网站提供的指导。
<ol>
<li>	将细胞培养基和0.5%或0.25%胰蛋白酶预热，并吸入5 ml或10 ml注射器中。</li>
<li>	使用真空脂将22×30 mm盖玻片固定在Warner Instruments共聚焦成像室（RC-30WA）的上盖玻片支架上，以确保盖玻片位置稳定。</li>
<li>	将用于形成腔室的橡胶垫圈置于盖玻片上方，确保聚乙烯进样管和出样管均可接入。根据所用垫圈的尺寸，可在上盖玻片与涂有凝胶的22×40 mm盖玻片之间形成150–1000 μm的间距。</li>
<li>	通过连接套件将注射器连接至进样管，检查培养基是否顺利流经管道并到达上盖玻片表面，且流路中无气泡产生。</li>
<li>	在腔室底部涂抹真空脂，将涂有凝胶的22×40 mm盖玻片（细胞面朝上）安装到位，并向细胞中加入预热的培养基。</li>
<li>	将上盖玻片支架放置于腔室底座上，中间由腔室垫圈隔开，确保腔室底座内的定位销插入上盖玻片的定位孔中。</li>
<li>	将压力板安装至腔室底座，并使用压力板扳手旋紧并固定压力板。</li>
<li>	检查培养基在管道和腔室中的流动情况，以监测腔室是否存在潜在泄漏，并消除细胞表面的无培养基区域。注意：在灌注培养基的同时，使用细径针头施加轻微负压，有助于消除无培养基区域。</li>
<li>	将共聚焦成像室安装至显微镜支架中的载物台适配器上，进行成像。</li>
<li>	在共聚焦荧光显微镜上对凝胶基质中嵌入的荧光标记蛋白和荧光微球进行成像。</li>
<li>	为获得凝胶内未受应力作用的微球位置图像，灌注胰蛋白酶以解离细胞与凝胶之间的黏附连接，并在同一成像视野中采集细胞脱离后荧光微球的图像。通过比较受力与未受力状态下微球的位置，可量化细胞收缩过程中凝胶基质的位移。</li>
</ol>
代表性结果：
上述方案描述了制备用于研究细胞收缩力的可变形PAA凝胶的实验步骤，如图1所示。采用本方案获得的凝胶表面相对平坦且光滑，荧光微球在整个凝胶中均匀分布（图2A）。

若需在黏着斑位置测量凝胶收缩，应在黏着斑的共聚焦光学平面对细胞（图3A）和凝胶表面（图3B）进行成像。当细胞附着（受力）与脱离（无应力）时，可通过观察凝胶表面嵌入的荧光微球的位移来可视化凝胶的收缩（图3B）。利用计算算法可获得与微球位移相关的牵引力应力以及凝胶相应的弹性模量（图3C和3D）（Sabass 等，2008）。如果成像位置位于凝胶更深的区域，则珠粒位移会更小，无法代表在黏着斑处施加的牵引力。
<img src="/files/ftp_upload/2173/2173fig1.jpg" alt="细胞黏附示意图，显示细胞外基质蛋白与聚丙烯酰胺凝胶的偶联及黏着斑的可视化" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 实验装置示意图。本实验的总体目标是构建可变形的基质，用于研究细胞收缩力。实验的第一步是通过氨基硅烷/戊二醛处理活化盖玻片，以便锚定聚合后的凝胶。第二步是在活化的盖玻片上聚合含有荧光微球的聚丙烯酰胺凝胶。第三步是采用步骤3中列出的三种偶联方法之一，将细胞外配体化学交联至聚丙烯酰胺凝胶表面。随后将细胞接种于凝胶表面，使其黏附并铺展。在细胞主动收缩过程中，嵌入凝胶中的微球发生位移。
<img src="/files/ftp_upload/2173/2173fig2.jpg" alt="用于细胞环境研究的PAA凝胶中的荧光微球及纤连蛋白显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 通过（A）嵌入凝胶中的荧光40 nm微球和（B）纤连蛋白免疫荧光所观察到的PAA凝胶顶面的光学共聚焦切片图像。
<img src="/files/ftp_upload/2173/2173fig3.jpg" alt="细胞黏附分析；GFP-桩蛋白，牵引力显微镜，彩色编码的应力图，矢量场。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 牵引力实验的代表性结果。（A）人骨肉瘤U2OS细胞中的局灶性黏附通过GFP-桩蛋白标记；（B）在受力（绿色）和未受力（红色）状态下，嵌入PAA凝胶中位于局灶性黏附下方的荧光微珠的位置。箭头表示微珠位移的示例。（C）牵引应力矢量，以及（D）通过计算算法（Sabass et al., 2008）从凝胶收缩中推导出的相应牵引应力热图。比例尺 = 5 μm。
表1：
PAA标准溶液和工作溶液示例（表1中的数据最初来自Yeung et. al.，并在我们的实验室中独立验证）。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td colspan="5">聚丙烯酰胺（PAA）储备溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAA凝胶的剪切模量（Pa）</td>
 <td>230</td>
 <td>2833</td>
 <td>8640</td>
 <td>16344</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40% 丙烯酰胺（mL）</td>
 <td>1.25</td>
 <td>3.12</td>
 <td>2.34</td>
 <td>2.50</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2% 双丙烯酰胺（mL）</td>
 <td>0.50</td>
 <td>0.83</td>
 <td>1.88</td>
 <td>0.60</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水（mL）</td>
 <td>3.25</td>
 <td>1.04</td>
 <td>0.78</td>
 <td>1.90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积（mL）：</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td colspan="5">工作用PAA溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>使用的储存液 (Pa)</td>
 <td>230</td>
 <td>2833</td>
 <td>8640</td>
 <td>16344</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>储存液体积 (μL)</td>
 <td>150</td>
 <td>150</td>
 <td>200</td>
 <td>300</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>水 (μL)</td>
 <td>341.75</td>
 <td>341.75</td>
 <td>291.75</td>
 <td>191.75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>微珠 (μL)</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TEMED (μL)</td>
 <td>0.75</td>
 <td>0.75</td>
 <td>0.75</td>
 <td>0.75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% APS (μL)</td>
 <td>2.5</td>
 <td>2.5</td>
 <td>2.5</td>
 <td>2.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总体积 (μL):</td>
 <td>500</td>
 <td>500</td>
 <td>500</td>
 <td>500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最终丙烯酰胺%</td>
 <td>3</td>
 <td>7.5</td>
 <td>7.5</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最终双丙烯酰胺%</td>
 <td>0.06</td>
 <td>0.1</td>
 <td>0.3</td>
 <td>0.15</td>
 </tr>
</tbody>
</table> 
表 2：
不同终浓度丙烯酰胺和双丙烯酰胺的PAA基底的剪切模量
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">12% 丙烯酰胺</td>
 <td> </td>
 <td colspan="2">7.5% 丙烯酰胺</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% 双丙烯酰胺</td>
 <td>剪切模量 (Pa)</td>
 <td> </td>
 <td>% 双丙烯酰胺</td>
 <td>剪切模量 (Pa)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.145</td>
 <td>16344</td>
 <td> </td>
 <td>0.01</td>
 <td>689</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.28</td>
 <td>30067</td>
 <td> </td>
 <td>0.03</td>
 <td>1535</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.45</td>
 <td>34263</td>
 <td> </td>
 <td>0.05</td>
 <td>2286</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.55</td>
 <td>42375</td>
 <td> </td>
 <td>0.075</td>
 <td>2833</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.575</td>
 <td>50873</td>
 <td> </td>
 <td>0.1</td>
 <td>4069</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.6</td>
 <td>55293</td>
 <td> </td>
 <td>0.2</td>
 <td>5356</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>0.3</td>
 <td>8640</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="2">5% 丙烯酰胺</td>
 <td> </td>
 <td colspan="2">3% 丙烯酰胺</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% 双丙烯酰胺</td>
 <td>剪切模量 (Pa)</td>
 <td> </td>
 <td>% 双丙烯酰胺</td>
 <td>剪切模量 (Pa)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05</td>
 <td>430</td>
 <td> </td>
 <td>0.02</td>
 <td>1.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.075</td>
 <td>600</td>
 <td> </td>
 <td>0.04</td>
 <td>54</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1</td>
 <td>1431</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
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<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述牵引力显微镜（TFM）实验的建立方法，结合计算追踪程序的实施（Sabass et al., 2008），可实现对细胞力的量化分析，空间分辨率达到微米级。为优化实验方案，关键在于制备纯度高、均一性好的凝胶基底，并确保细胞外基质（ECM）配体的均匀包被。以下讨论可能存在的技术难点：

凝胶表面不均匀或出现裂纹：
根据我们的经验，有几个步骤对于形成均匀良好的凝胶至关重要。如果凝胶表面出现暗色孔洞，很可能是因为玻璃载片上残留了过多的Rain-X液滴未被彻底清除，导致凝胶聚合时所面对的表面疏水性不均。此外，我们发现对于极软的凝胶（&lt;100 Pa），由于盖玻片表面粘附的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶溶胀受限，凝胶表面会变得高度不平整；减少这一现象的方法之一是用水替换为适当的缓冲液，从而在凝胶聚合至成像过程中维持渗透压稳定。

凝胶表面出现撕裂或裂痕可能由多种因素引起。如果在盖玻片-载玻片夹心结构拆卸前凝胶尚未完全聚合，则可能导致大面积破裂或撕裂。凝胶与载...

<table><tbody><tr><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>40 nm 荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>磺基-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦成像腔室 (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片旋转仪</td><td>自制</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯 CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰基-X, SE (6-((丙烯酰基)氨基)己酸)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>水合肼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>偏高碘酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

细胞与细胞外基质（ECM）之间黏附的调控对于细胞迁移和ECM重塑至关重要。黏着斑是将收缩性F-肌动蛋白细胞骨架与ECM偶联在一起的大分子复合物。这种连接使得细胞内机械力能够通过细胞膜传递到下方的基底。最近的研究表明，ECM的力学特性可调控黏着斑和F-肌动蛋白的形态，以及多种生理过程，包括细胞分化、分裂、增殖和迁移。因此，使用细胞培养基底已成为精确控制和调节ECM力学特性的日益普遍的方法。
为了量化贴壁细胞在黏着斑处的牵引力，需结合使用可变形基底、高分辨率成像技术和计算方法，该技术称为牵引力显微镜（TFM）。该技术依赖于测量细胞收缩所引起的基底局部形变的大小和方向。结合荧光标记蛋白的高分辨率荧光显微镜成像，可将细胞骨架的组织与重塑过程与牵引力相关联。
本文介绍了一种制备二维可变形基质的详细实验方案，旨在构建一种力学刚度明确且可调控的细胞培养基底，适用于细胞收缩力的测量。该方案包括聚丙烯酰胺水凝胶的制备、细胞外基质蛋白在凝胶表面的包被、细胞在凝胶上的接种，以及利用灌流腔室进行高分辨率共聚焦显微镜观察。此外，我们还提供了代表性数据示例，展示如何采用已报道的牵引力显微镜（TFM）技术来测定细胞力的作用位置和大小。

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。

细胞与细胞外基质（ECM）之间黏附的调控对于细胞迁移和ECM重塑至关重要。黏着斑是……

本实验的总体目标是制备可变形的基质，用于调控和量化细胞收缩。首先通过活化盖玻片，使其能够锚定基质；实验的第二步是在活化的盖玻片上聚合丙烯酰胺凝胶。该实验步骤的第三步是将细胞接种到凝胶上，并使其贴附。实验的最后一步是对凝胶进行成像，以获取可用于牵引力显微镜分析的数据。最终，可通过牵引力显微镜获得结果显示细胞对其基质施加了牵引力。大家好，我是来自芝加哥大学物理系及生物物理动力学研究所Margaret ELL实验室的Yvonne Eons。我是同样来自Guard实验室的Steven Winter。今天我们将向您展示一种用于测量细胞收缩的可变形基质的制备方法。我们在实验室中使用这些步骤来研究收缩性肌动蛋白-肌球蛋白网络。现在让我们开始。在盖玻片活化之前，预先放置数个 22 × 40 毫米、1.5 号的盖玻片。将盖玻片置于不锈钢架中，用70%乙醇冲洗，确保盖玻片之间保持间距且不相互接触。在化学通风橱中操作，于方形玻璃皿内用异丙醇配制2%三或微量轮廓三甲基溶液。使用玻璃移液管加入三或微量轮廓三甲基。由于三甲氧基具有与塑料反应的活性，因此需将盖玻片完全浸入该溶液中，并在通风橱内的搅拌器上搅拌孵育10分钟。浸泡完成后，通过将盖玻片浸入双蒸水中进行清洗。最后一次换水后，共更换四次水。静置孵育10分钟，并持续搅拌。然后将盖玻片置于约37摄氏度的培养箱中干燥10分钟。干燥后，使其冷却至室温。将盖玻片浸入双蒸水中含1%戊二醛的溶液中，在搅拌仪上的玻璃方皿中处理30分钟。务必使用洁净的器皿。否则，溶液之后可能出现浑浊。用双蒸水洗涤盖玻片，每次10分钟，共换液三次，期间持续搅拌。接着，用铝箔覆盖盖玻片以防止灰尘污染，并在室温下干燥。干燥后，将盖玻片存放于干燥、无尘处，可保存长达两个月。制备聚丙烯酰胺（PAA）凝胶时，首先配制丙烯酰胺双丙烯酰胺储备液，按RI方案所述，使用40%丙烯酰胺和2%双丙烯酰胺配制丙烯酰胺双丙烯酰胺混合液。将丙烯酰胺溶液置于真空室中脱气 20 分钟。此步骤可减少凝胶中的氧气，从而防止聚合反应发生。同时，配制 10% 过硫酸铵溶液或 PS 溶液。然后用Rain X擦拭巾擦拭尺寸为1英寸×3英寸的显微镜载玻片，使载玻片表面具有疏水性。使用Kim擦拭巾去除任何灰尘，以确保凝胶表面光滑。用铝箔覆盖载玻片并置于一旁备用。然后将丙烯酰胺溶液从真空室中取出，并加入荧光微球。为启动凝胶聚合，加入 0.75 µL 的 TM E 和 2.5 µL 的 10% APS。通过上下吹打混匀溶液。接着，取 10 至 12 µL 丙烯酰胺溶液滴加到先前准备好的疏水性显微镜载玻片上。将一块已活化的 22 × 40 毫米盖玻片置于液滴上方，使凝胶溶液覆盖整个盖玻片。轻轻展平溶液中可能出现的任何气泡。将凝胶溶液在室温下静置约10分钟，使其充分聚合。聚合完成后，凝胶会从盖玻片边缘收缩脱离。使用镊子的细尖端，小心地将附着有凝胶的盖玻片从显微镜载玻片表面移除。将凝胶浸入含有双蒸水的培养皿中，以保持凝胶表面湿润，从而将细胞外基质（ECM）蛋白交联至凝胶上。首先，通过将SULF san par粉末溶解于无水二甲基亚砜（DMSO）中，制备40微升的工作分装液。接着，使用盖玻片离心器短暂去除凝胶表面的双蒸水。使用前注意不要让凝胶立即干燥。将二甲基亚砜中的硫磺Sampa等分试样用双蒸水稀释，并在凝胶表面中央涂布约200微升。然后将凝胶表面置于紫外交联仪中暴露于紫外光下。紫外线照射后，将盖玻片浸入盛有新鲜重蒸水的烧杯中。使用盖玻片旋转仪去除凝胶表面的任何溶液。然后将盖玻片放入培养皿中，并在盖玻片上加入50微升冷的纤连蛋白溶液。将盖玻片倒置，使凝胶面朝上置于纤连蛋白上。室温下反应一至两小时，或在4°C下过夜反应。随后在无菌细胞培养通风橱中孵育。将盖玻片放入含有 PBS 的 6 厘米组织培养皿中，以包被盖玻片。在无菌条件下，用 PBS 多次更换洗涤盖玻片。通过紫外照射处理 30 分钟对盖玻片进行灭菌。随后，在接种细胞前，将盖玻片置于细胞培养基中孵育30至45分钟。接下来，将22 mm × 30 mm的盖玻片放置于Warner Instruments共聚焦成像室的上部盖玻片支架上，并使用真空脂固定盖玻片。在盖玻片上方放置一个用于形成腔室的橡胶垫圈，以便接入进样口和出样口的聚乙烯管。这将使顶部盖玻片与凝胶包被的22 × 40毫米盖玻片之间的间距根据所用垫圈的尺寸在150至1000微米之间。然后通过连接套件将装有温热细胞培养基的注射器连接到进样管路，检查培养基是否流经管路并到达顶部盖玻片。在腔室底部涂抹真空脂，将凝胶包被的22 × 40毫米盖玻片（细胞面朝上）放置到位。将预热的培养基加入细胞中。将顶部盖玻片支架放置在腔室底座上，腔室密封垫应位于支架与包被有凝胶的盖玻片之间。确保腔室底座内的定位销插入顶部盖玻片的定位孔中。将压力板安装到腔室底座上，并使用压力板扳手拧紧并固定压力板。检查培养基在管路和腔室中的流动情况，以监测腔室内是否存在潜在泄漏，并消除细胞表面任何无培养基区域。将共聚焦成像腔室安装至显微镜支架内的载物台适配器上，使用共聚焦荧光显微镜对凝胶基质中嵌入的荧光标记蛋白和荧光微珠进行成像，以获取凝胶灌注中未受应变时微珠位置的图像。进行多次实验以使细胞黏附从凝胶上脱离，并在同一成像视野中采集荧光微珠的图像，该视野即为细胞已被去除的区域。若严格按照本方案操作，凝胶表面将相对平坦光滑，且荧光微珠在凝胶中分布均匀。细胞外基质（ECM）也可通过纤维连接蛋白免疫荧光进行可视化。若需在黏着斑位置测量凝胶收缩，则应在黏着斑的共聚焦光学平面上对凝胶和细胞进行成像。在此，黏着斑通过吸引力实验在表达GFP pxi标记的人骨肉瘤细胞或U2 OS细胞中显示。通过观察嵌入在凝胶中荧光微珠在黏着斑下方的位移，可以可视化凝胶的收缩。通过比较绿色显示的受力微珠与红色显示的未受力微珠位置，可在此处定量分析凝胶基质在收缩过程中的位移。此为代表性结果，显示一个铺展细胞经胰蛋白酶处理后从凝胶表面脱离。以下为比较受力与未受力微珠位置时的代表性结果。利用复杂的计算算法，可以得到与微珠位移和凝胶弹性模量相关的牵引力。这些应力在此处通过热图尺度和矢量进行可视化，热图中较暖的色彩以及更大的箭头表示更强的作用力。我们刚刚向您展示了在执行此操作时，如何制备用于测量细胞收缩的可变形基质。提前规划非常重要，以便能够快速执行对时间敏感的步骤。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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生物工程

投诉矩阵量化细胞收缩的准备工作

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。...

单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

本视频介绍了利用细胞电极基底阻抗传感技术（ECIS）测量主动脉平滑肌细胞（SMC）收缩的方法。ECIS可检测细胞的运动，是测量细胞收缩的可靠方法。...

体外测量平滑肌细胞收缩：利用细胞-基质电容阻抗传感技术评估平滑肌细胞收缩的非侵入性方法

本方案描述了使用微尺度硅悬臂梁作为可变形培养表面，用于测量肌细胞收缩力的方法。 体外细胞收缩引起悬臂弯曲，该弯曲可被测量、记录并转换为力的读数，从而提供一种用于测量收缩功能的非侵入性且可扩展的系统...

利用微尺度硅悬臂梁评估细胞收缩功能 体外

本文介绍了凝胶收缩实验的建立及其应用，用于评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞的收缩功能。...

一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

机械力在调控细胞迁移过程中起着重要作用。本实验方案展示了如何使用可变形的弹性水凝胶，通过玻璃微移液管和显微操作器施加局部刚度梯度，从而刺激细胞并诱导其结构和迁移行为的改变。...

单细胞硬度趋性实验用于评估细胞运动及相关信号事件的力学调控

我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。...

光遗传学调控心肌细胞活性的机电评估

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使用微图案化弹性体进行单细胞收缩力的简化高通量分析

分析人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞收缩功能和细胞完整性的变化，对于非临床药物开发具有重要意义。一种混合式96孔细胞分析系统能够以实时且符合生理条件的方式同时检测这两个参数，从而获得可靠且与人体相关的结果，为安全进入临床阶段提供必要支持。...

用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

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分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

学习制备聚丙烯酰胺凝胶基质用于细胞培养，通过牵引力显微镜量化细胞收缩力。该方法可研究细胞外基质刚度对细胞行为的影响，为细胞生物学研究提供重要数据。

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

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