Name: 小鼠神经嵴干细胞的培养鸡胚提取物的生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习从11日龄鸡胚制备高质量鸡胚提取物（CEE）的标准化方法，用于体外培养小鼠神经嵴干细胞。本方案涵盖胚胎分离、研磨、离心和过滤等关键步骤，确保提取物的纯度和产量，为神经科学和干细胞生物学研究提供可靠的技术支持。

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Markus Pajtler 和 Robert Bohrer 在本实验方案的可视化方面提供的支持与建议极为宝贵。

作者声明，动物实验严格遵循欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并依照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验操作中动物护理与使用的指南，以及德国杜伊斯堡-埃森大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）所制定的规定进行。

第1部分：准备工作（视频中未展示）
准备材料与溶液（在将卵从培养箱中取出之前）
<ul>
<li>鸡蛋需在37°C（100°F）的加湿培养箱中孵育11天。</li>
<li>70%乙醇喷雾、洁净培养皿、精密洁净镊子、置于冰上的4°C（40°F）无菌DMEM培养基，以及60 mL无菌注射器</li>
<li>需将50 mL无菌Corning离心管装入一半体积的4°C冷DMEM培养基，用于以1:1的比例（匀浆组织:DMEM）混合匀浆后的胚胎。一旦将鸡蛋从培养箱中取出，应立即开始鸡胚解剖。</li>
<li>解剖工具须通过高压灭菌器灭菌，或在解剖当天将工具浸入70%乙醇中20分钟。</li>
</ul>
第2部分：鸡胚胎的解剖（视频演示）
<ol>
<li>用70%乙醇喷雾湿润已孵育的鸡蛋，至少持续30秒，并用洁净的软纸巾小心擦干，注意不要过度摇晃鸡蛋。 
注意：建议同时解剖的鸡胚不超过60个。</li>
<li>通过将蛋壳轻击锋利边缘小心打开，谨慎取出胚胎，避免破坏卵黄囊或鸡胚本身。</li>
<li>迅速找到脐带起始位置，小心撕开透明包裹膜，避免损伤卵黄囊或细小血管，然后使用精确洁净的镊子解剖脐带。</li>
<li>将胚胎从卵黄囊中取出。 
注意：应迅速将胚胎断头处理（视频中未展示）。</li>
<li>将胚胎收集至4°C的最低必需培养基中。</li>
</ol>
第3部分：鸡胚胎的解离
<ol>
<li>从一个 60 mL 无菌注射器中取出活塞。</li>
<li>将约 10 个胚胎转移至一个 60 mL 注射器中。</li>
<li>小心地将活塞重新插入注射器，以免损失匀浆材料。</li>
<li>通过下压活塞进行匀浆处理。</li>
<li>将匀浆后的组织收集到预先准备好的 Corning 管中，管内已加入半满的 DMEM，匀浆物与 DMEM 的体积比为 1:1。使用 10 个胚胎时，可获得约 25 mL 的混合液。</li>
<li>将混合液置于摇床中，在 4°C 下振荡 45 分钟。</li>
</ol>
第4部分：鸡胚-DMEM悬浮液的离心
<ol>
<li>将鸡胚-DMEM悬浮液转移至离心管中。</li>
<li>加入无菌透明质酸酶，浓度为每25 mg胚胎加入1 mg。</li>
<li>精确去皮重离心管。 
注意：此步骤需谨慎操作，因离心过程使用极高的离心力，若使用不平衡的离心管，可能导致材料或离心机损坏。应使用高精度天平，通过向DMEM中添加缺失的量，使所有离心管在小数点后三位数值上保持一致。</li>
<li>将离心机温度降至4°C。 
注意：离心转子也应于前一晚存放于冷藏室或冰箱中。</li>
<li>至少离心6小时，离心力为180,000 × g × h。注意：为获得更优的各相分离效果，建议使用266,000 × g × h。如条件允许，使用真空调节功能。</li>
</ol>
第5部分：鸡胚提取物的过滤
离心后可见三个相：上层为含有脂肪碎片的浑浊液体，中间为澄清的液体相，底部为离心管中的沉淀。注意：必须严格避免摇动或剧烈移动离心后的混合物，否则会导致中间澄清液体相丢失，从而破坏离心步骤的结果。
注意：以下所有步骤均须在层流空气净化台内无菌条件下进行：
<ol>
<li>用移液器将澄清的液体相转移至孔径为 0.45 μm 的滤器系统中，然后开启连接的真空泵。 
注意：切勿触碰底部的沉淀物，否则会导致提取物污染以及滤器系统堵塞。</li>
<li>将预提取液转移至孔径为 0.22 μm 的滤器系统中，并再次开启连接的真空泵。</li>
<li>将获得的鸡胚提取液分装至无菌的 15 mL Corning 管中。</li>
<li>迅速将分装样品储存于 -80°C (-62°F)。注意：若保存在 -80°C，CEE 可稳定保存长达两年。</li>
</ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本方案基于以往报道过的实验方法的改进10,11。与先前发表的文献相比，本文更详细地展示了该流程的各个独立步骤，有助于实验人员掌握关键细节，确保操作正确并获得可靠的结果。此外，由于解剖过程是鸡胚提取（CEE）的关键环节，本文对从卵黄囊中取出胚胎的操作进行了详尽描述。以下将讨论若干需要注意的重要事项。
孵化结束后应尽快开始鸡胚的解剖。解剖前已死亡的胚胎不得用于本方案的任何步骤，因为酶的激活和蛋白质降解可能对结果产生不利影响。
在开始之前，应进行一些动手训练，因为解剖过程的每一步都必须快速且准确地完成。为确保整个操作的成功，必须避免卵黄污染，因为卵黄含有大量具有显著负干扰作用的蛋白质。胚胎从卵黄囊中取出后，应迅速进行去头处理（视频中未展示）。
离心机的温度以及转子的转速也非常重要。为避免酶被激活以及NCSCM所需因子在质和量上的减少，应将离心机和转子的温度降至4°C。离心步骤完成后，上清液中央透明的液体层即为关键的预提取物，其中含有NCSCM所需的关...

<table><tbody><tr><td>孵化11天的鸡胚</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒喷雾</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器（60 ml）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌离心管（50 ml；15 ml）</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液器吸头</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶 IV-S 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore 无菌滤器（0.45；0.22 &amp;mu;l）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管（25 ml；10 ml；5 ml）</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 L5-50</td><td>转子型号 Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

制备鸡胚提取物以培养小鼠神经嵴干细胞

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

神经嵴在胚胎发生过程中起源于神经外胚层，且仅暂时存在。早期实验已证实，多能前体细胞是神经嵴的重要组成部分。1表型上，神经嵴干细胞（NCSC）在其从神经嵴迁移过程中，通过同时表达 p75（低亲和力神经生长因子受体，LNGFR）和 SOX10 进行定义。2,3,4,5这些前体细胞可分化为平滑肌细胞、嗜铬细胞、神经元和胶质细胞，以及黑色素细胞、软骨和骨6,7,8,9. 培养NCSC 体外需要一种特殊的神经嵴干细胞培养基（NCSCM）10NCSCM 中最复杂的部分是鸡胚提取物（CEE）的制备，CEE 是神经嵴干细胞（NCSC）以及其他类型神经外植体所需生长因子的重要来源。除 CEE 外，NCSCM 的其他成分均可从商业途径获得。使用实验室常规设备制备 CEE 时，了解分离、研磨、离心和过滤等关键步骤中的技术难点至关重要。本方案中，我们详细描述了获得最大产量且高纯度、高质量 CEE 的精确技术。

体外培养神经嵴干细胞（NCSC）需要使用特殊的培养基（NCSCM）。NCSCM的关键成分是鸡胚提取物（CEE）。本文详细描述了制备最大产量的高纯度、高质量CEE的准确技术，包括分离、匀浆、离心和过滤等步骤的具体操作细节。

神经嵴在胚胎发生过程中起源于神经外胚层，且仅暂时存在。早期实验已证实其具有多能性……

大家好，我是来自德国埃森大学儿童医院儿科肿瘤学系伊卡·埃加尔教授实验室的Anaa。今天我们将向您展示一种制备11天龄产前鸡胚胎提取物的操作方法。将DMEM置于冰上，冷却至至少4°C。我们使用 GIBCO 提供的 DMEM 谷氨酸，将其装入无菌管中至半满。用 MEM 洗涤已在湿度控制的培养箱中于 100 华氏度孵育 11 天的卵，洗涤时使用 70% 乙醇。务必确保乙醇至少吸收 30 秒。小心操作后，用柔软的纸巾将卵擦干。用乙醇清洁塑料或玻璃载片。打开卵。小心地将胚胎放入培养皿中。避免破坏内皮细胞（EC）或任何微小血管。使用锋利且洁净的精密镊子分离胚胎。首先，寻找脐带。再次强调，在寻找脐带时，切勿损伤羊膜囊或任何细小血管。一旦找到脐带，应追踪其起始端并进行解剖。打开覆盖在胚胎上方的透明包膜后，小心地将胚胎从卵壳（EC）中取出，注意不要破坏胚胎。将胚胎置于冰上的无菌最低必需培养基中。我们使用gyp公司提供的DMEM谷氨酸盐培养基。从无菌的60毫升注射器中取出活塞。每次将约10个胚胎放入细径吸管中。将推杆插入细径吸管。通过下压推杆使胚胎成熟。注意不要施加过大的压力，否则会导致成熟材料丢失。按照一个胚胎对应10个MEM胚胎的比例，将成熟的胚胎收集到已准备好的试管中。最终体积约为25毫升。将胚胎与 EMEM 按 1:1 的比例混合，在 4 摄氏度下震荡 45 分钟。小心将混合液转移至离心管中。加入 rile hyaluronidase 天数。我们使用 Sigma 公司提供的 R 培养基，来源于牛睾丸。使用专用的高精度电子天平撕开离心管。称量时务必精确到小数点后三位。它们必须相等，否则由于离心混合物需要高速运转，可能导致离心机出现问题。如有必要，可通过移液补足缺失量的 MEM 来调整不平衡。转子应提前一晚置于冰箱或冷却室中，使其冷却至四摄氏度。离心管必须拧紧。否则，您可能会在取出转子时遇到问题。离心后，将转子装入离心管，并提前将其拧紧。将离心机冷却至四摄氏度。在任何情况下均需使用真空。等待转子达到最终转速。如果发生任何异常情况，请立即停止离心机。按下刹车按钮以终止离心过程。这是在TI I 45转子以每分钟45,000转的速度连续运行六小时后的情况。小心取出试管，切勿摇晃，以免导致试管内上层浑浊液体层增加。注意观察三个相层。顶部是带有脂肪块的浑浊液体，中间是澄清的液体，底部可见沉淀物。吸取时需格外小心，避免触碰管底沉淀，仅收集位于管中段的澄清相。切勿触碰沉淀，以免导致提取物污染以及过滤系统的堵塞。首先，使用连接至真空泵的0.45微米滤膜进行过滤；第二步，将所得液体通过0.22微米滤膜再次过滤，该滤膜同样连接至真空泵。随后将提取物注入收集管中。最后将试管保存在负80摄氏度。

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