Name: 条块索玛的神经元和轴突的一个微流体设备制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学习使用软光刻技术制造PDMS微流控神经元装置，实现神经元胞体与轴突的区室化培养。该方法支持独立处理不同腔室并获取纯净轴突组分，为神经科学研究提供可重复的标准化平台。

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第1部分：微流控神经元装置的制备
<ol>
<li>A&nbsp;使用通过光刻技术在3英寸硅片上制备的SU-8图案来浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控模具。我们将带有SU-8图案的硅片称为母模，或“master”。</li>
<li>PDMS 与固化剂按 10:1 的质量比（w/w）混合，即每 10 克 PDMS 加入 1 克固化剂。</li>
<li>将PDMS充分混合后倒入硅晶圆上。硅晶圆置于一个10 cm的聚苯乙烯培养皿中。覆盖模具并形成约4 mm厚度，大约需要12 g至15 g的PDMS。</li>
<li>将带有PDMS的模具放入真空干燥器中，培养皿盖子打开，施加真空。此步骤旨在帮助去除在搅拌固化剂过程中引入PDMS中的气泡。&nbsp; 去除气泡大约需要15分钟。</li>
<li>将带有PDMS的模具从干燥器中取出。使用带有0.45 μm滤膜的气枪去除任何残留的气泡。</li>
<li>将模具置于80°C的加热板上固化1小时。</li>
</ol>
注意：如果无真空干燥器，可将模具在室温下静置数小时，气泡最终会自行消失。若无加热板，PDMS 在室温下24小时后也可固化。
注意：在固化过程中，还需确保模具处于水平状态。
第二部分：切割神经元微流控装置
<ol>
<li>PDMS在模具上固化后，将其转移至洁净工作台。</li>
<li>使用手术刀沿器件边缘切割出一个圆形。当将刀片插入PDMS时，应注意与硅晶圆接触，但切勿对晶圆施加过大压力，否则会导致模具破裂。</li>
<li>在器件周围完成整圈切割后（每个3英寸硅模具上包含4个器件），小心地将PDMS从模具上剥离。可通过将手术刀插入先前切口并轻轻扭转来开始剥离过程。</li>
<li>接下来，使用8 mm组织活检打孔器在器件上打出储液孔。</li>
<li>随后将器件切成四份，并修剪掉多余的PDMS，以便器件能够整齐地贴合于Corning盖玻片（No. 1，24 mm × 40 mm）上。使用氮气吹除所有多余碎屑。顽固残留物也可用3M Scotch Brand 471乙烯基胶带去除。</li>
</ol>
第3部分：将装置与玻璃盖玻片进行等离子键合。
<ol>
<li>使用等离子清洗机将Harrick神经器件与盖玻片进行键合。简而言之，将器件放入等离子清洗机中，并使用真空泵抽去腔室内的空气。</li>
<li>当真空压力达到300毫托（milliTorr）后，接通电感线圈电源并调至高功率。</li>
<li>电感线圈利用腔室内残留的空气分子产生等离子体——“一种由电子、离子以及中性原子或分子组成的部分电离气体”——<a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a>。等离子体在玻璃和器件表面产生活性基团，当两者接触时可形成永久性键合。等离子体还可使表面变为亲水性，有助于液体的加入。此外，等离子清洗机能对器件进行灭菌。 将含有微流控结构的PDMS器件表面朝上，与玻璃载片一同放入等离子清洗机中。 在洁净台中将经等离子处理的玻璃和微流控器件表面相互贴合&nbsp;，然后置于无菌的60 mm培养皿中。处理后的表面会形成紧密且不可逆的键合。 </li>
<li>在等离子体键合完成后的10分钟内，向器件中加入多聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine, PLL）。10分钟后，器件表面的亲水性会逐渐下降，导致PLL难以进入器件内部。 注意：加入PLL后需仔细检查器件中是否存在气泡。主通道中的气泡应避免，因为其可能导致细胞氧化。去除气泡的一种简便方法是：使用P200移液器吸取150 µL液体（本例中为PLL），将枪头直接对准主通道入口，用力下压排出液体。此操作可能需要重复数次，但最终移液器产生的压力将驱除气泡。 </li>
<li>加入PLL的器件在标准组织培养孵箱中37°C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
<li>次日，用高压灭菌的dH2O快速冲洗器件两次。在此过程中，主通道内的液体不得完全排空，仅可从储液池中移除液体。若主通道排空，将引入气泡。完成两次快速冲洗后，器件中重新充满高压灭菌的dH2O，并放回孵箱中至少静置3小时，或过夜。</li>
<li>再下一日，再次用高压灭菌的dH2O快速冲洗器件两次。随后向器件中加入含B27和GlutaMax等必要添加剂的神经基础培养基，用于原代大鼠神经元的培养。将器件重新放回孵箱中备用。此时器件已准备就绪，可用于神经元接种。</li>
</ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

在本视频中，我们演示了如何制作和准备一种用于培养神经元的PDMS微流控装置。该装置通过微沟道将含有细胞体、树突和轴突混合物的区域与纯轴突区域分隔开，从而获得纯净的轴突组分。这些装置使研究人员能够研究各种处理方法的影响，并提供一个平台，用于对轴突施加物理损伤，进而观察这些处理对神经元产生的效应。此外，该装置在神经元培养中提供了有序性，有助于运输研究的开展。同时，分隔细胞培养区与轴突区的微沟道实现了两个区域之间的流体隔离，使得可以对装置的一侧进行处理，而不会将处理物质直接作用于另一侧。这一特性使研究人员能够研究由处理引发的信号转导和物质运输等效应。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>试剂</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 及固化剂。请咨询 Dow Corning 以查找您附近的供应商</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>工具</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>神经基础培养基</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>神经基础培养基由 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供。</td></tr><tr><td>B27</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 是 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供的专有添加剂。</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax 由 Invitrogen 公司在其 Gibco 细胞培养试剂系列中提供。</td></tr><tr><td>Corning No. 1 盖玻片</td><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>可通过 Fisher Scientific 购买，Fisher 目录编号 12-531D</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>使用 60 mm 聚苯乙烯无菌培养皿来承载固定在玻璃上的装置。</td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml 离心管</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-49A 购买</td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml 离心管</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-70C 购买</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>新项目</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于神经元胞体与轴突区室化培养的微流控装置的制备

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于构建用于培养神经元的微流控装置。此前，已使用SU-8和光刻技术在硅晶圆上制备出神经元微流控装置的设计图案，从而制作出主模具，我们简称为“主模”。接下来，将硅聚合物PDMS浇注在主模表面，然后在80°C下加热1小时使其固化。PDMS由此形成装置的负模。随后小心地将PDMS从主模上切割并剥离下来。在储液池位置打孔，并将装置周围多余的PDMS修剪干净。使用氮气吹除装置表面的任何多余碎屑。此时，装置已准备就绪，可通过等离子灭菌/清洁仪将其与Corning No. 1 盖玻片永久键合，也可通过直接将装置放置在盖玻片上来实现可逆性结合。装置与玻璃的可逆性结合在另一视频中有专门介绍，且需先使用70%乙醇或高压灭菌法对装置进行灭菌处理。等离子处理本身具有灭菌作用，因此无需进一步处理。然而，在进行等离子处理时需注意：必须在处理后10分钟内向装置中加入液体，以确保表面仍保持亲水性。若超过10分钟再加液，液体将难以进入装置内部。神经元培养装置通常采用等离子键合方式固定于盖玻片上，并立即向装置中加入pH 8.5硼酸盐缓冲液配制的0.5 mg/ml多聚-L-赖氨酸（PLL）。PLL孵育时间至少为3小时，期间用去离子水（dH₂O）清洗装置，清洗次数不少于3次，每次间隔至少15分钟。随后吸除水分，并向装置中加入新鲜培养基。此时装置即可投入使用。需要注意的是，切勿将装置中的培养基完全移除，主通道中应始终保留一定量的培养基。

在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于制备用于培养神经元的微流控装置。

在本视频中，我们演示了使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻的技术，该技术用于制造一种微流控装置，以用于……

欢迎来到Newly John博士的实验室。John实验室专注于为生物应用开发微流控平台。在本视频中，我们将演示一种用于初级神经元分隔与培养的微流控装置的制备与使用方法。神经元装置最初于2005年8月发表在《自然·方法》上。自推出以来，全球各地的合作者已广泛使用该神经元装置。该装置由一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成，该材料浇铸于含有所需装置SUA图案的硅片上，而该图案此前通过光刻技术制备而成。该装置具有三个主要特征：四个直径为8毫米的储液池，两条主通道（每条宽1.5毫米、长7毫米、高100微米），以及连接两条主通道的微沟槽（宽10微米、高3微米）。微沟槽的长度可在150微米至900微米之间变化，但通常选择的标准长度为450微米。当观察装置使主通道与微沟槽呈垂直方向时，可以看到沟槽左侧的储液池通过主通道相互连接，右侧的储液池 likewise 也是如此。该功能允许液体流经主通道，这一重要特性使得细胞接种和培养基更换成为可能。与传统的组织培养平台相比，神经元装置具有三大优势。其一，它能够实现细胞体（胞体）与轴突的共区域化分隔。利用该神经元装置，可以获得高纯度的轴突组分。微沟槽的尺寸和长度允许轴突穿过另一主通道，同时阻止胞体通过。第二，由于该装置的设计并利用静水压力，只需使装置一侧的储液池体积高于另一侧，即可独立地对细胞侧和/或轴突侧进行不同处理。第三，可通过真空抽吸切断装置中的纯轴突部分，使研究人员能够研究和观察轴突再生过程。研究人员 Hina Lee 现在将演示微流控神经元装置的制备过程。使用经光刻法在三英寸硅片上制备出 SU-8 图案，以此浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控模具。我们将带有 SU-8 图案的硅片称为母模，或简称为“母模”（masters）。PDMS 与固化剂按重量比10:1混合。例如，每15克PDMS加入1.5克固化剂。将PDMS充分混合后，倒入硅片上。硅片置于一个10厘米的聚苯乙烯培养皿中。覆盖微结构阵列（MAs）所需的聚二甲基硅氧烷（PDMS）量约为12克至15克，厚度约为4毫米。将带有PDMS的模具放入真空干燥器中，培养皿盖子打开，然后施加真空。这样做的目的是帮助去除在搅拌固化剂过程中引入PDMS中的气泡。去除气泡大约需要15分钟。将含有PDMS的模具在真空干燥器中放置15分钟后，从干燥器中取出。PDMS母模上仍残留少量气泡。使用带有0.45微米滤膜的气枪去除残留气泡。随后将母模置于80摄氏度的加热板上固化一小时。如果无法提供真空干燥器，可将模具在室温下静置数小时，气泡最终会自行消失。若无加热板，PDMS 在室温下放置 24 小时后也可固化。在固化过程中，必须确保模具处于水平状态。PDMS在模具上固化后，将其转移至洁净罩中，并使用手术刀沿器件边缘进行环形切割。在将刀片插入PDMS以接触硅片时，必须注意不要对硅片施加过大的压力，否则模具会在器件周围完全切割出一圈裂纹而破裂。每块三英寸的硅模具上含有四个器件。随后小心地将PDMS从模具上剥离下来。插入手术刀片时可轻轻旋转，以开始操作。由于PDMS器件在模具上非常薄，因此需格外小心。使用8毫米组织活检打孔器，在器件上打孔形成向上开口的储液池。用一根棒将打孔器中残留的碎屑推出。然后将装置切成四等份，并修剪掉多余的PDMS，以便装置能够整齐地贴合在康宁盖玻片上。使用24毫米×40毫米的1号玻璃片，并用氮气吹走任何多余的碎屑。顽固的残留物也可使用 3M Scotch Brand 4 7 1 乙烯基胶带去除。清洁后的器件现已准备好进行等离子体键合。使用Herrick等离子清洗机将神经元器件短暂地键合到盖玻片上。将装置和盖玻片放置于托盘上，然后将托盘放入等离子清洗仪中，并使用真空泵抽去腔室内的空气。需要注意的是，PDMS装置应正面朝上放置，即图案面朝上，以便暴露于等离子气体中。当真空压力达到300毫托时，将电源接通至电热线圈并调至高功率。将门上的阀门稍微打开，使少量空气进入腔室，以助于产生等离子体。器件和盖玻片进行等离子体处理两分钟。注意腔室中的紫色。这就是实际的等离子体。电磁线圈产生等离子体，等离子体是一种部分电离的气体，由电子、离子以及中性原子或分子组成。等离子体会在玻璃和器件表面产生活性物质，当两者接触时会形成永久性结合。等离子体还使表面变为亲水性，有助于液体的添加。等离子清洗机还可对器件进行灭菌。等离子体处理两分钟后，关闭真空电源并向腔室内通入空气。在洁净台中将经过等离子体处理的玻璃表面与微流控器件紧密接触并组装在一起。然后将器件置于无菌的60毫米培养皿中。经过等离子体处理的玻璃表面与装置表面会形成紧密且不可逆的结合。在等离子体键合后的10分钟内，需将玻璃多醇赖氨酸加入装置中。10分钟后，装置的亲水性将下降。这使得PLL难以进入装置。加入PLL后，必须检查装置内是否存在气泡。去除气泡的一个简便方法是使用P200移液器，吸取100微升液体进行操作。在此情况下，使用PLL将枪头直接置于主通道的开口处，然后用力按压P200移液器。此步骤可能需要重复数次，但最终移液器产生的压力将驱除气泡。含有PLL的装置置于标准组织培养孵箱中，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。与PLL孵育24小时后，用高压灭菌的去离子水快速冲洗装置两次。在此过程中，液体仅从储液池中完全移除，主通道中的液体则从不完全移除。若将主通道中的液体移除，会引入气泡。经过两次快速冲洗后，再次用高压灭菌的去离子水充满装置，并放回培养箱中孵育至少三小时或过夜。第二天，在装置中用去离子水孵育过夜或至少三小时后，再次将其移入生物安全柜中，用去离子水冲洗两次。然后向装置中加入含有必要添加剂B-27和谷氨酸的神经基础培养基，用于原代大鼠神经元的培养。随后将这些装置放回培养箱中以备后续使用。这些装置现已准备好用于接种神经元。在本视频中，我们展示了用于制造神经元装置的软光刻技术。这些装置可用于培养神经元及其他感兴趣的细胞类型。这类装置的主要优势在于能够将神经元胞体的培养与轴突纯化部分分隔开来，分别位于装置的两侧。在接下来的视频中，我们将向您展示如何制备E18胎鼠大脑皮层神经元，以及如何将细胞接种到装置中。以上就是约翰实验室的全部内容。感谢观看。

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生物学

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为微流控装置中的区室化培养准备E18大鼠皮层神经元

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一种多区室中枢神经系统神经元-胶质细胞共培养微流控平台

本视频展示了使用预组装的塑料微流控芯片对原代大鼠海马神经元进行区室化培养的方法。将神经元接种至微流控芯片的一个区室中，神经元在此附着并生长，并通过芯片中的微沟槽将其轴突延伸至相邻区室。由于微沟槽较窄，可阻止神经元胞体进入，从而实现胞体区室与轴突区室之间的物理分离。...

使用塑料微流控芯片的区室化原代小鼠神经元培养

该视频展示了利用微流控装置对神经干细胞（NSCs）进行分化的过程，该装置包含由微沟屏障分隔的胞体区和轴突区。将神经干细胞引入胞体区并使其贴壁。神经干细胞在胞体区内分化为神经元，并通过微沟屏障将轴突延伸至轴突区。...

使用隔室化微流控装置将神经干细胞分化为神经元

本文描述了用于单神经元微流控阵列化以及芯片内生物材料涂层等离子体图案化水掩模技术的实验方案。利用极少的细胞输入即可制备高度互连的共培养体系。...

单细胞精度神经元共培养体系的制备

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

本方案描述了使用塑料芯片培养和分隔原代小鼠神经元的方法。这些芯片为预组装设计，操作简便，且适用于高分辨率、活细胞及荧光成像。本方案详细说明了如何在这些芯片中接种大鼠海马神经元，并进行流体隔离、轴突切断和免疫染色操作。...

使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

本方案展示了使用环状烯烃共聚物注塑成型的分区化微流控芯片培养由人类干细胞分化而来的神经元。这些芯片为预组装设计，相较于传统的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）分区装置更易于使用。文中描述了多种常见的实验范式，包括病毒标记、流体隔离、轴突切断以及免疫染色。...

人干细胞来源神经元在预组装塑料微流控芯片内的区室化培养

本实验方案描述了在微流控腔室中对神经元线粒体进行接种和染色的方法。这些腔室中的流体压力梯度可实现对轴突内线粒体的选择性处理，从而在不干扰胞体区室的情况下，分析其对药物干预的响应特性。...

微流控辅助选择性去极化轴突线粒体

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

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