条块索玛的神经元和轴突的一个微流体设备制造

欢迎来到 Dr.Newly John 的实验室。John 实验室专门从事用于生物应用的微流体平台工程。在本视频中，我们将演示用于原代神经元区室化和培养的微流体装置的生产和使用。

该神经元设备于 2005 年 8 月首次发表在 Nature Methods 上。自推出以来，神经元设备已被世界各地的合作者广泛使用。神经元器件由一块铸造在硅晶片上的 PDMS 组成，其中包含该器件的 SUA 图案，该图案以前是通过光刻创建的。

该设备具有三个主要特点，四个直径为 8 毫米的储液器，两个宽 1.5 毫米的主通道，长 7 毫米，高 100 微米，以及连接两个主通道的 10 微米宽和 3 微米高的微槽。微槽的长度可以从 150 微米到 900 微米不等，但选择的标准长度为 450 微米。观察设备，使主通道和微槽垂直，我们可以看到凹槽左侧的储液槽是通过主通道连接的，右侧的储液槽也是如此。

此功能允许液体流经主通道，这是一项重要功能，可以加载传感器和更换介质。与传统组织培养平台相比，该神经元设备具有三大优势。一，它允许细胞体或胞体和轴突的 com 区室化 使用神经元装置，可以获得纯轴突组分。

微槽的大小和长度允许轴突穿过另一个主通道，同时防止锯体交叉。第二，由于设备的设计并利用静水压力，只需保持设备一侧的体积和储液器高于另一侧，就可以对设备的细胞侧和/或轴突侧进行单独的处理。第三，该设备的纯轴突部分可以通过真空抽吸切割，使研究人员能够研究和观察轴突再生。

研究人员 Hina Lee 现在将演示如何准备微流体神经元设备。使用具有 SU 8 图案的三 Ang 硅晶片通过光刻技术铸造聚二甲基 Sloane PDMS 微流体模具。我们将 SUA 型硅片称为母模或简称母模。

PDMS 与固化剂以 10 比 1 的重量比混合。也就是说，例如，每 15 克固化剂中含有 1.5 克 PDMS。然后将 PDMS 充分混合并倒入硅晶片上。

硅晶片包含在 10 厘米的聚苯乙烯培养皿中。大约需要 12 克到 15 克 PDMS 才能覆盖厚度约为 4 毫米的 MA。然后将带有 PDMS 的母版放入真空干燥中，盖上培养皿的盖子并施加真空。

这样做是为了帮助去除在搅拌固化剂期间引入的 PDMS 中的气泡。去除气泡大约需要 15 分钟。在真空干燥中 15 分钟后，将带有 PDMS 的主泵从干燥液中取出。

PDMS 主站上仍有一些剩余的气泡。使用带有 0.45 微米过滤器的气枪去除任何残留的气泡。然后将母版放在 80 度的热板上 1 小时固化。

如果没有真空干燥剂，可以将母板在室温下放置几个小时。气泡最终会自行消散。如果没有可用的热板，PDMS 将在 24 小时后在室温下固化。

确保母版是水平的很重要 在固化过程中。一旦 PDMS 在 The master 上固化，就会使用手术刀片将其带到干净的罩子中。在设备的周边切一个圆圈。

重要的是，当将刀片插入 PDMS 以与硅晶片接触时，但不要对晶片施加太大压力，否则母版会在器件周围切出一个圆圈，从而破裂。每个 3 英寸硅主站有四个器件。小心地将 PDMS 从主站上提起。

这可以通过在手术刀片插入先前的切口时轻轻扭动手术刀片来开始。模具上的 PDMS 器件真的很薄。使用 8 毫米组织活检打孔器将面朝上的储液器打入设备中。

用杆将留在打孔器中的碎屑推出。然后将设备切成四等份，并修剪掉多余的 PDMS，以便设备能够整齐地安装在康宁盖板上。1 号玻璃尺寸为 24 毫米 x 40 毫米，氮气用于吹走多余的碎屑。

也可以使用 3M Scotch Brand 4 7 1 乙烯基胶带去除顽固碎屑。清洁设备现在可以进行等离子键合。使用 Herrick 等离子清洁器将神经元设备短暂地粘合到盖玻片上。

将设备和盖玻片放在托盘上，然后将托盘放入等离子清洁器和用于从腔室中抽出空气的真空泵中。请务必注意，PDMS 设备正面朝上放置。也就是说，设计面朝上，以便它们会暴露在等离子气体中。

真空压力达到 300 后，毫托功率转到电线圈并设置为高。门上的所有东西都开裂了，让一点空气进入腔室，这将有助于产生等离子体。设备和盖玻片经过 2 分钟的等离子处理。

注意腔室中的紫色。这就是实际的等离子体。电线圈产生等离子体，等离子体是一种由电子、离子和中性 atos 或分子组成的部分电离气体。

等离子体在玻璃和器件表面产生反应性物质，当它们放在一起时，将形成永久键。等离子体还使表面变得亲水，这有助于促进液体的添加。等离子清洁器还可以对设备进行消毒。

等离子体处理 2 分钟后，真空中的电源关闭，空气进入腔室。玻璃和微流体装置的等离子体处理服务在洁净的工作台中相互接触组装。然后将这些设备放入无菌的 60 毫米培养皿中。

玻璃的等离子处理表面与器件形成紧密的不可逆粘合。在等离子体键合后 10 分钟内，将装置添加到玻璃多元醇赖氨酸中。10 分钟后，设备的亲水性会降低。

使 PLL 难以进入器件。添加 PLL 后检查器件中的气泡很重要。去除气泡的一种简单方法是使用装满 100 微升液体的 P 200 移液器。

在这种情况下，PLL 将尖端直接放在主通道的开口处，然后用力按下 P 200。这可能需要重复几次，但最终移液器的力会将气泡排出。含有 PLL 的装置可以在 37 度和 5% CO 2 的标准组织培养箱中孵育过夜。

用 PLL 孵育 24 小时后，用高压灭菌去离子水快速冲洗装置两次。在此过程中，液体永远不会从主通道中完全排出，而只会从储液罐中排出。从主通道中去除液体会引入气泡。

快速冲洗两次后，再次将设备装满高压灭菌器去离子水，然后放回培养箱中至少三小时或过夜。第二天，在设备与水一起孵育过夜或至少三个小时后，它们再次被带入生物安全柜，并用去离子水冲洗两次。然后将含有必要补充剂、B 27 和谷氨酸的神经基础培养基添加到装置中，用于培养原代大鼠神经元。

然后将设备放回培养箱中以备将来使用。这些设备现在已准备好让神经元坐下。在本视频中，我们演示了软光刻技术，我们用它来制造神经元设备。

这些设备可用于培养神经元和其他感兴趣的细胞类型。这些设备的主要优点是能够将设备一侧的神经元细胞体培养与设备另一侧的纯轴突部分分开和分隔。在下一个视频中，我们将向您展示我们如何制备 E 18 胎架皮质神经元，以及如何将细胞加载到设备中。

以上是 John Lab 的内容。感谢收看。