iCLIP - 全转录组，蛋白质与RNA相互作用的映射与个别核苷酸分辨率

以下实验的总体目标是获得RNA结合蛋白在单个核苷酸分辨率下的全转录组结合位点图谱。该目标通过紫外照射活细胞实现，以在体内将蛋白质与RNA共价交联作为第二步。随后在严格条件下通过免疫纯化RNA结合蛋白，从而回收交联的RNA片段。

接下来，逆转录生成的cDNA通常会在连接的肽段处发生截断，从而保留RNA中交联位点的信息。通过对cDNA文库进行高通量测序，可以获得转录组内所有结合位点的结果。该方法有助于回答RNA生物学中的关键问题，例如不同RNA结合蛋白之间的相互作用如何调控RNA的加工过程。该技术的主要优势在于，我们提高了全转录组范围内蛋白质-RNA相互作用图谱的性能和分辨率。接下来开始进行紫外交联组织培养细胞的实验步骤。

从一个10厘米的愈合细胞培养皿中移除培养基。加入6毫升预冷的PBS，并将培养皿置于冰上。一个培养皿足以进行三次实验。

取下盖子并照射细胞。在254纳米波长下以150毫焦耳/平方厘米照射后，用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，收集细胞。将两毫升细胞悬液分别转移至三个微量离心管中，以沉淀细胞。在4°C下以最高速度离心10秒。

然后去除上清液，将细胞沉淀在干冰上速冻，并在使用前于负80摄氏度保存。每个实验向新的微量离心管中加入100微升蛋白质和一管Dyna珠。若使用小鼠或山羊来源的抗体，请使用蛋白G Dyna珠。

用裂解缓冲液洗涤磁珠两次，裂解缓冲液可在随附的书面实验方案中找到。将磁珠重悬于100微升裂解缓冲液中，加入2至10微克抗体。室温下旋转孵育管子30至60分钟。

然后用900微升裂解缓冲液洗涤珠子三次，最后一次洗涤后将珠子保留在缓冲液中，直至准备继续后续操作。将Thor细胞在冰上进行免疫沉淀。用一毫升裂解缓冲液重悬，并转移至1.5毫升微量离心管中。

将RNA一进行1:500稀释。然后取10微升与2微升Turbo DNase一同加入细胞裂解液中。将样品在37摄氏度下准确孵育3分钟，以每分钟1,100转的速度振荡，随后立即转移至冰上。

然后在 4°C、22,000 × g 条件下离心样品 20 分钟，离心后小心收集上清液，留下约 50 微升裂解液与沉淀物，用于免疫沉淀珠。去除洗涤缓冲液，然后加入制备好的细胞裂解液。在 4°C 下旋转孵育样品 2 小时。

弃去上清液，并用900 µL高盐缓冲液将磁珠洗涤两次，高盐缓冲液的配方见随附的书面实验方案。最后，用900 µL洗涤缓冲液将磁珠再洗涤两次。随后进行去磷酸化反应，并在RNA的3'末端连接接头。

在聚甲基丙烯酸甲酯防护罩后操作，对RNA的5'端进行标记。除去接头连接反应最后一次洗涤的上清液，将磁珠重悬于8 µL热PNK混合液中。在37°C下孵育5分钟。

移除热的PNK混合物并重复使用。将磁珠悬浮于20 µL的1×新PAGE上样缓冲液中，然后在70 °C的恒温混匀仪中孵育10分钟。

立即将样品置于磁铁上，以沉淀空珠。根据制造商的说明，将样品上样至4%至12%的Biss凝胶上。

同时，加入5 µL预染蛋白质分子量标记物。在180伏电压下电泳50分钟。根据制造商说明书，使用NOVA湿转装置将凝胶中的蛋白质-RNA复合物转移至硝酸纤维素膜上。

转膜后，用 PBS 缓冲液冲洗膜。然后用保鲜膜包裹，并在 -80 摄氏度下对胶片曝光。分别进行 30 分钟、1 小时和过夜曝光。

接下来，根据蛋白质-RNA复合物从低RNA区域分离膜部分。使用放射自显影图像作为模板进行实验。通过蛋白酶K消化和酚-氯仿抽提从膜上回收RNA。

使用 AYP 引物之一对 RNA 进行逆转录，以通过凝胶纯化获得 CDNA。将六微升 CDNA 样品与六微升两倍浓度的 TBE 尿素上样缓冲液混合。在将样品上样到凝胶之前立即进行此操作。

将样品在 80 摄氏度下加热 3 分钟。然后将样品与低分子量标记物一起上样至预制的 6% TBE 尿素凝胶中。按照制造商说明，以 180 伏电压电泳运行 40 分钟，利用上层染料和塑料凝胶支架上的标记指导切胶操作。

切取三条片段，长度分别为120至200个核苷酸、85至120个核苷酸以及70至85个核苷酸。注意，arc lip引物和L3序列共同占CLIP序列的52个核苷酸。加入400微升TE缓冲液，并将凝胶切片碾碎成小块。

使用1毫升注射器活塞，将凝胶小块在37摄氏度、1,100转/分钟的振荡条件下孵育两小时。将两个1厘米的玻璃预滤膜放入CoStar SpinX柱中。将样品的液体部分转移至该柱中，在13,000转/分钟的转速下离心一分钟，收集于1.5毫升离心管中。

加入0.5 µL的glyco blue和40 µL pH 5.5的乙酸钠。然后混匀样品。加入1 mL的100%乙醇。

再次混匀，并在零下20摄氏度沉淀样品过夜。最后，将cDNA分子环化，使接头区域连接至5'端。随后按照随附的书面实验方案进行重新线性化和PCR扩增。在对眼夹文库进行测序之前，实验的成功可在两个步骤中进行监测。

在膜转移后蛋白质-RNA复合物的放射自显影图中，以及低RNA样品PCR产物的凝胶图像中，对于高RNA样品，应在蛋白质分子量上方观察到弥散的放射性信号。该放射性信号在接近蛋白质分子量处更为集中。在免疫沉淀中若未使用抗体，则不应检测到任何信号。

为进一步验证免疫沉淀的特异性，还需设置其他重要对照，例如使用发射UVE辐射的光源，或采用不表达目标蛋白的细胞。PCR产物的凝胶图像应显示出与cDNA片段相对应的大小范围。需要注意的是，PCR引物P3 Celexa和P5 Celexa会在cDNA片段的基础上额外引入76个核苷酸。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到相应的PCR产物。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记，64个步骤中的每一步都至关重要，必须以百分之百的准确性执行。ICL数据可与转录组范围的功能分析进行计算整合。例如，这种方法有助于深入了解RNA加工过程中依赖于位置的调控机制。

对于计算数据分析，我们建议参考我们近期与欧洲生物信息学研究所的 Nicholas KA 以及卢布尔雅那大学的 Blaž Zupan 合作发表的论文。现在是您开始自己实验的时候了。祝您实验愉快。