Name: iCLIP - 全转录组，蛋白质与RNA相互作用的映射与个别核苷酸分辨率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习iCLIP技术以单核苷酸分辨率全转录组映射RNA结合蛋白结合位点。该方法结合紫外交联与免疫沉淀，通过高通量测序精确定位蛋白-RNA相互作用，为转录后调控机制研究提供高分辨率数据。

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作者感谢Ule、Luscombe和Zupan实验室所有成员在讨论和实验方面提供的帮助。感谢James Hadfield和Nik Matthews提供的高通量测序支持。需要指出的是，本文所述的iCLIP方法与Kirk Jensen和J.U.在Robert Darnell实验室开发的原始CLIP方案共享多个步骤。本研究得到了欧洲研究理事会（European Research Council）授予J.U.的资助项目206726-CLIP以及Human Frontiers Science Program长期博士后奖学金对J.K.的资助支持。

1. 组织培养细胞的紫外交联
<ol>
	<li>吸去培养基，向生长在10 cm培养皿中的细胞加入6 ml预冷的PBS（足够进行三次实验）。</li>
	<li>移去皿盖，将培养皿置于冰上。在254 nm波长下以150 mJ/cm2剂量照射一次。</li>
	<li>使用细胞刮刀刮取细胞，收集细胞。</li>
	<li>将2 ml细胞悬液分别转移至三个微量离心管中。在4°C下以最大转速离心10秒，使细胞沉淀，随后吸去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀在干冰上速冻，并于-80°C保存备用。</li>
</ol>
2. 磁珠准备
<ol>
	<li>每个实验加入 100 μl 蛋白 A Dynabeads（Dynal, 100.02）至新的微量离心管中（若使用小鼠或山羊来源的抗体，则使用蛋白 G Dynabeads）。</li>
	<li>用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 7.4；100 mM NaCl；1% NP-40；0.1% SDS；0.5% 脱氧胆酸钠；1/100 蛋白酶抑制剂混合物 III, Calbiochem）洗涤磁珠 2 次。</li>
	<li>将磁珠重悬于含 2–10 μg 抗体的 100 μl 裂解缓冲液中。</li>
	<li>室温下旋转孵育管体 30–60 分钟。</li>
	<li>用 900 μl 裂解缓冲液洗涤 3 次，最后一次洗涤后保留缓冲液，直至准备进行步骤 4.1。</li>
</ol>
3. 细胞裂解与部分RNA消化
<ol>
	<li>将细胞沉淀重悬于 1 ml 裂解缓冲液中，并转移至 1.5 ml 微量离心管。</li>
	<li>制备 RNase I（Ambion, AM2295）的 1/500 稀释液。向细胞裂解物中加入 10 μl RNase I 稀释液以及 2 μl Turbo DNase（文库构建使用 1/500 的 RNase I 稀释液 [低 RNase]；为验证抗体特异性需使用 1/50 稀释液 [高 RNase]）。</li>
	<li>在 37°C 下振荡孵育样品，转速为 1,100 rpm，精确孵育 3 分钟。随后立即置于冰上。</li>
	<li>在 4°C 下以 22,000 g 离心 20 分钟以澄清裂解物。小心收集上清液（保留约 50 μl 裂解物与沉淀一同）。</li>
</ol>
4. 免疫沉淀
<ol>
	<li>从珠子中移除洗涤缓冲液（来自步骤 2.5），然后加入细胞裂解液（来自步骤 3.4）。</li>
	<li>在 4°C 下旋转孵育样品 2 小时。</li>
	<li>弃去上清液，并用 900 μl 高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1 M NaCl；1 mM EDTA；1% NP-40；0.1% SDS；0.5% 脱氧胆酸钠）将珠子洗涤 2 次。</li>
	<li>用 900 μl 洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；10 mM MgCl2；0.2% Tween-20）洗涤 2 次。</li>
</ol>
5. RNA 3'末端去磷酸化
<ol>
	<li>弃去上清液，将磁珠重悬于20 μl PNK反应液中（15 μl水；4 μl 5x PNK pH 6.5缓冲液[350 mM Tris-HCl, pH 6.5; 50 mM MgCl2; 25 mM 二硫苏糖醇]；0.5 μl PNK酶；0.5 μl RNasin [Promega]）。</li>
	<li>在37°C孵育20分钟。</li>
	<li>加入500 μl洗涤缓冲液，用高盐缓冲液洗涤1次。</li>
	<li>用洗涤缓冲液洗涤2次。</li>
</ol>
6. 连接子连接至RNA 3'末端
<ol>
	<li>小心移除上清液，并将磁珠重悬于 20 μl 连接反应体系中（9 μl 水；4 μl 4x 连接缓冲液 [200 mM Tris-HCl; 40 mM MgCl2; 40 mM 二硫苏糖醇]；1 μl RNA 连接酶 [NEB]；0.5 μl RNasin [Promega]；1.5 μl 预腺苷化接头 L3 [20 μM]；4 μl PEG400 [81170, Sigma]）。</li>
	<li>在 16°C 下孵育过夜。</li>
	<li>加入 500 μl 洗涤缓冲液，随后用 1 ml 高盐缓冲液洗涤两次。</li>
	<li>用 1 ml 洗涤缓冲液洗涤两次，并将第二次洗涤后的缓冲液保留 1 ml。</li>
</ol>
7. RNA 5'端标记
<ol>
	<li>去除上清液，将珠子重悬于 8 μl 热的 PNK 混合液中（0.4 μl PNK [NEB]；0.8 μl 32P-γ-ATP；0.8 μl 10x PNK 缓冲液 [NEB]；6 μl 水）。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>去除热的 PNK 混合液，将珠子重悬于 20 μl 1x Nupage 上样缓冲液（Invitrogen）中。</li>
	<li>在 70°C 的恒温混匀仪中孵育 10 分钟。</li>
	<li>立即置于磁力架上以沉淀空珠，将上清液上样至凝胶（见步骤 8）。</li>
</ol>
8. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及膜转移
<ol>
	<li>根据制造商说明，将样品上样至 4-12% NuPAGE Bis-Tris 凝胶（Invitrogen）。使用 0.5 l 的 1x MOPS 电泳缓冲液（Invitrogen）。同时上样 5 μl 预染蛋白质分子量标记物（例如 PAGE Ruler Plus，Fermentas，SM1811）。</li>
	<li>在 180 V 条件下电泳 50 分钟。</li>
	<li>切下凝胶前缘并作为固体废弃物丢弃（含有游离的放射性 ATP）。</li>
	<li>使用 Novex 湿转装置，根据制造商说明将蛋白质-RNA 复合物从凝胶转移至硝酸纤维素膜（Invitrogen，30 V 转移 1 小时）。</li>
	<li>转膜完成后，用 PBS 缓冲液冲洗膜，然后用保鲜膜包裹，并于 -80°C 下对 Fuji 胶片曝光（在膜旁放置一个荧光贴纸，以便后续对齐胶片与膜；分别曝光 30 分钟、1 小时和过夜）。</li>
</ol>
9. RNA 提取
<ol>
	<li>使用8.5步骤的放射自显影图作为模板，从低RNase实验中分离蛋白质-RNA复合物。将膜切成若干小片，放入1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>向膜碎片中加入200 μl PK缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4；50 mM NaCl；10 mM EDTA）和10 μl蛋白酶K（Roche, 03115828001）。在37°C下以1,100 rpm振荡孵育20分钟。</li>
	<li>加入200 μl PKurea缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.4；50 mM NaCl；10 mM EDTA；7 M尿素），在37°C下孵育20分钟。</li>
	<li>收集溶液，并与400 μl RNA酚/氯仿（Ambion, 9722）一起加入2 ml Phase Lock Gel Heavy管（713-2536, VWR）中。</li>
	<li>在30°C下孵育5分钟，以1,100 rpm振荡。在室温下以13,000 rpm离心5分钟，分离各相。</li>
	<li>将水相转移至新管中（注意移液枪头勿接触凝胶）。加入0.5 μl glycoblue（Ambion, 9510）和40 μl 3 M乙酸钠pH 5.5，混匀。然后加入1 ml 100%乙醇，再次混匀，并在-20°C下过夜沉淀。</li>
</ol>
10. 逆转录
<ol>
	<li>在 15,000 rpm 和 4°C 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，并用 0.5 ml 80% 乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于 7.25 μl RNA/引物混合液中（6.25 μl 水；0.5 μl Rclip 引物 [0.5 pmol/μl]；0.5 μl dNTP 混合液 [10 mM]）。每个实验或重复使用含有不同条形码序列的 Rclip 引物（见步骤 14）。</li>
	<li>在 70°C 孵育 5 分钟，随后冷却至 25°C。</li>
	<li>加入 2.75 μl 反转录（RT）混合液（2 μl 5x RT 缓冲液；0.5 μl 0.1 M DTT；0.25 μl Superscript III 反转录酶 [Invitrogen]）。</li>
	<li>在 25°C 孵育 5 分钟，42°C 孵育 20 分钟，50°C 孵育 40 分钟，80°C 孵育 5 分钟，随后冷却至 4°C。</li>
	<li>加入 90 μl TE 缓冲液、0.5 μl glycoblue 和 10 μl 乙酸钠（pH 5.5），混匀。然后加入 250 μl 100% 乙醇，再次混匀，并在 -20°C 过夜沉淀。</li>
</ol>
11. cDNA 的凝胶纯化
<ol>
	<li>离心收集并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于6 μl水中。</li>
	<li>加入6 μl 2x TBE-尿素上样缓冲液（Invitrogen）。上样前将样品在80°C加热3分钟。</li>
	<li>将样品上样至预制的6% TBE-尿素凝胶（Invitrogen），按照制造商说明在180 V下电泳40分钟。同时加载低分子量标记物以用于后续切胶（见下文）。</li>
	<li>切取三个条带：120–200 nt（高）、85–120 nt（中）和70–85 nt（低）。利用凝胶上部的染料前沿及塑料凝胶支架上的标记辅助切割（见图3）。注意Rclip引物和L3序列共占CLIP序列的52 nt。</li>
	<li>加入400 μl TE缓冲液，用1 ml注射器推杆将凝胶切块碾碎成小片。在37°C、1,100 rpm条件下振荡孵育2小时。</li>
	<li>将两个1 cm玻璃预滤膜（Whatman, 1823010）放入Costar SpinX离心柱（Corning Incorporated, 8161）中。将样品的液体部分转移至该离心柱中，以13,000 rpm离心1分钟，收集滤液至1.5 ml离心管中。</li>
	<li>加入0.5 μl GlycoBlue和40 μl pH 5.5乙酸钠溶液，混匀样品。再加入1 ml 100%乙醇，再次混匀，并于-20°C过夜沉淀。</li>
</ol>
12. 将引物连接到 cDNA 的 5'端
<ol>
	<li>离心收集并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于8 μl连接反应体系中（6.5 μl水；0.8 μl 10x CircLigase Buffer II；0.4 μl 50 mM MnCl2；0.3 μl CircLigase II [Epicentre]），在60°C孵育1小时。</li>
	<li>加入30 μl寡核苷酸退火体系（26 μl水；3 μl FastDigest Buffer [Fermentas]；1 μl cut_oligo [10 μM]）。在95°C孵育1分钟，随后每20秒降低1°C，直至温度降至25°C。</li>
	<li>加入2 μl BamHI（Fast Fermentas），在37°C孵育30分钟。</li>
	<li>加入50 μl TE缓冲液和0.5 μl GlycoBlue，混匀；再加入10 μl乙酸钠（pH 5.5），混匀，随后加入250 μl 100%乙醇。再次混匀后，在-20°C过夜沉淀。</li>
</ol>
13. PCR 扩增
<ol>
	<li>离心并洗涤样品（参见10.1），然后将沉淀重悬于19 μl水中。</li>
	<li>配制PCR反应液（19 μl cDNA；1 μl Solexa P5/P3引物混合物，各10 μM；20 μl Accuprime Supermix 1酶[Invitrogen]）。</li>
	<li>运行以下PCR程序：94°C 2分钟，[94°C 15秒，65°C 30秒，68°C 30秒]25-35个循环，68°C 3分钟，4°C保存。</li>
	<li>取8 μl PCR产物与2 μl 5x TBE上样缓冲液混合，上样至预制的6% TBE凝胶（Invitrogen）。用Sybrgreen I（Invitrogen）染色，并使用凝胶成像系统分析。</li>
	<li>Rclip引物中的条形码允许在提交高通量测序前对不同样品进行多重混合。提交15 μl文库用于测序，其余部分保存备用。</li>
</ol>
14. 连接子和引物序列
预腺苷酸化的3'接头DNA：
[我们从 IDT 公司订购 DNA 接头，然后将其分装为 20μM 的储存液。]
<img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="静态平衡：带有条形码的逆转录酶引物、DNA测序方法、序列列表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="DNA">
15. 代表性结果：
在对iCLIP文库进行测序之前，实验的成功与否可在两个步骤中进行监测：蛋白质-RNA复合物在膜转移后的放射自显影结果（步骤8.5）以及PCR产物的凝胶图像（步骤13.4）。在低RNase处理样品的放射自显影图中，应在蛋白质分子量上方观察到弥散状的放射性信号（图2，样品4）。而对于高RNase处理的样品，该放射性信号则更集中于接近蛋白质分子量的位置（图2，样品3）。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到任何信号（图2，样品1和2）。为进一步验证免疫沉淀的特异性，其他重要的对照实验可选择省略紫外线照射步骤，或使用不表达目标蛋白的细胞14。
PCR产物的凝胶图像（步骤13.4）应显示与步骤11.4中纯化的cDNA组分（高、中或低分子量）相对应的大小范围（图4，泳道4-6）。请注意，PCR引物P3Solexa和P5Solexa会使cDNA长度额外增加76个核苷酸。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到相应的PCR产物（图4，泳道1-3）。引物二聚体产物的大小约为140个核苷酸。
有关高通量测序及后续生物信息学分析的代表性结果，请参见14。
<img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="RNA-蛋白质相互作用图谱；紫外交联；实验示意图；测序，凝胶电泳" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. iCLIP 实验流程示意图。蛋白质-RNA 复合物通过共价交联固定 体内 使用紫外照射进行交联（步骤1）。目的蛋白与其结合的RNA一同被纯化（步骤2-5）。为实现逆转录的序列特异性引物延伸，在RNA的3'端连接一个RNA接头，同时对5'端进行放射性标记（步骤6和7）。通过SDS-PAGE及膜转移，将交联的蛋白-RNA复合物与游离RNA分离（步骤8）。利用蛋白酶K消化蛋白，从膜上回收RNA，仅在交联核苷酸处保留一段多肽（步骤9）。逆转录（RT）在残留的多肽处发生截断，并引入两个可切割的接头区域及条形码序列（步骤10）。通过大小筛选去除游离的RT引物后进行环化。随后的线性化处理生成适用于PCR扩增的模板（步骤11-15）。最后，高通量测序产生的读段中，条形码序列紧接cDNA的最后一个核苷酸（步骤16）。由于该核苷酸位于交联核苷酸上游一个位置，因此可高分辨率地推断出结合位点。
<img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="hnRNP C 蛋白-RNA 复合物分析、电泳结果、kDa 标记、膜区高亮显示。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用变性凝胶电泳和膜转移法检测交联的 hnRNP C-RNA 复合物的放射自显影结果。hnRNP C-RNA 复合物从细胞提取物中通过抗 hnRNP C 抗体（α hnRNP C，样品 3 和 4）进行免疫纯化。RNA 使用低（+）或高（++）浓度的 RNase 进行部分消化。可观察到从蛋白质大小（40 kDa）向上迁移的复合物条带（样品 4）。当使用高浓度 RNase 时，迁移现象较不明显（样品 3）。在免疫沉淀中未使用抗体时，放射性信号消失（样品 1 和 2）。
<img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="显示DNA按大小分离的凝胶电泳图，包含泳道标记、浅蓝色和深蓝色染料。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 用于指导iCLIP cDNA产物切取的6% TBE-尿素凝胶（Invitrogen）示意图。将凝胶在180 V电压下电泳40分钟，使cDNA和染料（浅蓝色和深蓝色）在凝胶中形成可重复的迁移模式。使用剃刀沿红线切取高（H）、中（M）和低（L）分子量的cDNA组分。首先从浅蓝色染料的中部开始切割，并紧邻塑料凝胶盒上的标记线处进行。将中分子量和低分子量组分分开，并在浅蓝色染料上方约1 cm处修剪高分子量组分。利用加样孔位置和染料条带作为参考，进行垂直切割以分离不同泳道（本示例中为1-4）。标记物泳道（m）可在切割后染色并成像，以检测各片段大小。右侧标注了片段大小。
<img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="cDNA 凝胶电泳、引物及扩增的 cDNA 条带；蛋白质结合分析比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 利用凝胶电泳分析PCR扩增的iCLIP cDNA文库。从膜上回收的RNA（图1）经逆转录后，通过变性凝胶电泳进行片段大小纯化（图2）。回收了三种不同大小的cDNA片段（高[H]：120–200 nt，中[M]：85–120 nt，低[L]：70–85 nt），随后进行环化、重新线性化并进行PCR扩增。由于输入片段大小不同，PCR产物呈现出不同的大小分布。由于PCR引物为cDNA添加了76 nt，因此高、中、低片段的产物大小范围应分别为196–276 nt、161–196 nt和146–161 nt。在免疫沉淀过程中未使用抗体时，PCR产物缺失（泳道1–3）。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

由于iCLIP实验方案包含多种酶促反应和纯化步骤，当实验失败时并不总是容易确定问题所在。为了控制所鉴定出的RNA交联位点的特异性，应在整个实验过程及后续的计算分析中设置一个或多个阴性对照。这些对照可包括无抗体样本、未交联的细胞，或来自基因敲除细胞或组织的免疫沉淀样本。理想情况下，这些对照实验不应纯化出任何蛋白-RNA复合物，因此在SDS-PAGE凝胶上应无信号，PCR扩增后也应无可见产物。对这些对照文库进行高通量测序应仅获得极少量的唯一序列。不建议使用基因敲低细胞作为测序对照，因为所获得的序列仍对应于同一种蛋白的交联位点，而该蛋白仅是以较低丰度从敲低细胞中被纯化出来的。
还应采取预防措施，避免受到先前实验PCR产物的污染。最大限度减少此类问题的最佳方法是将PCR前和PCR后操作在空间上分开进行。理想情况下，PCR产物的分析及所有后续步骤均应在独立的房间内完成。此外，实验室每位成员都应使用各自独立的缓冲液和其他试剂，以便更易于识别污染来源。

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

<table><tbody><tr><td colspan="4">对于凝胶电泳和膜转移，我们推荐使用 XCell SureLock&amp;#174; Mini-Cell 和 XCell II&amp;#226; Blot Module Kit CE 标志（Invitrogen，EI0002），该系统与本实验方案中指定的各种预制小型凝胶兼容。实验中所用所有材料的品牌和货号均在方案中注明。本方案中所用酶的列表如下表所示。</td></tr><tr><td>Protein A Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>若使用小鼠或山羊抗体，请改用 protein G</td></tr><tr><td>核糖核酸酶 I（RNase I）</td><td>Ambion</td><td>AM2295</td><td>活性可能因批次不同而变化</td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 I（T4 RNA ligase I）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td> </td></tr><tr><td>多核苷酸激酶（PNK）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td> </td></tr><tr><td>蛋白酶 K（proteinase K）</td><td>Roche Group</td><td>03115828001</td><td> </td></tr><tr><td>Superscript III 逆转录酶（reverse transcriptase）</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td> </td></tr><tr><td>Circligase II</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL9021K</td><td> </td></tr><tr><td>FastDigest&amp;#174; BamHI</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td> </td></tr><tr><td>AccuPrime&amp;#8482; SuperMix I</td><td>Invitrogen</td><td>12342010</td><td>该 PCR 混合液在我们实验中效果最佳</td></tr></tbody></table>

iclip——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-rna 相互作用图谱绘制

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

转录本上RNA结合蛋白（RBPs）的独特组成和空间排列指导着转录后调控的各个方面1。因此，要从分子水平上理解转录本的调控机制，关键的一步是获取RBPs结合位点的位置信息2。
蛋白质与RNA相互作用可通过生物化学方法进行研究，但这些方法无法在RNA天然的细胞环境中研究其结合情况。早期在细胞环境中研究蛋白质-RNA复合物的尝试采用了亲和纯化或免疫沉淀结合差异显示或微阵列分析（RIP-CHIP）3-5。这些方法容易鉴定出间接或非生理性的相互作用6。为了提高特异性和定位分辨率，研究人员提出了一种称为CLIP（紫外线交联和免疫沉淀）的策略7,8。CLIP将蛋白质与RNA分子的紫外线交联与严格的纯化流程相结合，包括变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结合高通量测序技术，CLIP已被证明是一种在全基因组范围内研究蛋白质-RNA相互作用的强大工具（称为HITS-CLIP或CLIP-seq）9,10。最近，又发展出PAR-CLIP技术，该技术利用光反应性核糖核苷类似物进行交联11,12。
尽管所获得的数据具有很高的特异性，CLIP实验常常产生序列复杂性有限的cDNA文库。这部分是由于共纯化的RNA量有限，以及文库构建过程中所需的两次RNA连接反应效率较低所致。此外，引物延伸实验表明，许多cDNA在交联核苷酸处提前截断13。这类截短的cDNA在标准CLIP文库构建流程中会丢失。我们近期开发了iCLIP（单核苷酸分辨率CLIP），通过将一个低效的分子间RNA连接步骤替换为更高效的分子内cDNA环化，从而捕获这些截短的cDNA（图1）14。重要的是，对截短cDNA进行测序可提供交联位点在核苷酸水平上的精确定位信息。我们已成功应用iCLIP在全基因组范围内研究hnRNP C颗粒的组织结构，并评估其在剪接调控中的作用14。

RNA结合蛋白在转录本上的空间排布是转录后调控的关键决定因素。因此，我们开发了单核苷酸分辨率的紫外交联免疫沉淀技术（iCLIP），可实现RNA结合蛋白结合位点的精确全基因组定位。

iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

RNA结合蛋白（RBPs）在转录本上独特的组成和空间排列调控转录后调控的多个方面……

以下实验的总体目标是获得RNA结合蛋白在单个核苷酸分辨率下的全转录组结合位点图谱。该目标通过紫外照射活细胞实现，以在体内将蛋白质与RNA共价交联作为第二步。随后在严格条件下通过免疫纯化RNA结合蛋白，从而回收交联的RNA片段。接下来，逆转录生成的cDNA通常会在连接的肽段处发生截短，从而保留RNA中交联位点的信息。通过对cDNA文库进行高通量测序，可以获得转录组内所有结合位点的结果。该方法有助于回答RNA生物学中的关键问题，例如不同RNA结合蛋白之间的相互作用如何调控RNA的加工过程。该技术的主要优势在于，我们提高了全转录组范围内蛋白质-RNA相互作用图谱的性能和分辨率。接下来开始进行紫外交联组织培养细胞的实验步骤。从一个10厘米的愈合细胞培养皿中移除培养基。加入6毫升冰冻的磷酸盐缓冲液，并将培养皿置于冰上。一个培养皿足以进行三次实验。取下盖子并照射细胞。在254纳米波长下以150毫焦耳/平方厘米照射后，用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下，收集细胞。将两毫升细胞悬液分别转移至三个微量离心管中，以沉淀细胞。在4°C下以最高速度离心10秒。然后去除上清液，将细胞沉淀在干冰上速冻，并于-80摄氏度保存备用。每个实验向新的微量离心管中加入100微升蛋白质及一份dyna磁珠。若使用小鼠或山羊来源的抗体，则应使用蛋白G dyna磁珠。用裂解缓冲液洗涤磁珠两次，裂解缓冲液可在随附的书面实验方案中找到。将磁珠重悬于100微升裂解缓冲液中，加入2至10微克抗体。室温下旋转孵育管子30至60分钟。然后用 900 µL 裂解缓冲液洗涤磁珠三次，最后一次洗涤后将磁珠保留在缓冲液中，直至准备进行下一步操作。将 Thor 细胞在冰上进行免疫沉淀。重悬于 1 mL 裂解缓冲液中，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。将RNA一进行1:500稀释。然后取10微升与2微升Turbo DNA酶一同加入细胞裂解液中。将样品在37摄氏度下准确孵育3分钟，以每分钟1,100转的速度振荡，随后立即转移至冰上。然后在 4°C、22,000 × g 条件下离心样品 20 分钟，离心后小心收集上清液，留下约 50 微升裂解液与沉淀物，用于免疫沉淀珠。去除洗涤缓冲液，然后加入制备好的细胞裂解液。在 4°C 下旋转孵育样品 2 小时。弃去 SUP 试剂，用 900 µL 高盐缓冲液将磁珠洗涤两次，高盐缓冲液的配方见随附的书面实验方案。最后用 900 µL 洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次。随后进行去磷酸化反应，并在 RNA 的 3' 末端添加接头。在聚甲基丙烯酸甲酯防护罩后操作，对RNA的5'端进行标记。除去接头连接反应最后一次洗涤的上清液，将磁珠重悬于8 µL热PNK混合液中。在37°C下孵育5分钟。移除热的PNK混合物并重复使用。将磁珠悬浮于20 µL的1×新PAGE上样缓冲液中，然后在70 °C下于恒温混匀仪中孵育样品10分钟。立即将样品置于磁铁上，以沉淀空珠。根据制造商的说明，将样品上样至4%至12%的Biss凝胶上。同时，加入5 µL预染蛋白质分子量标记物。在180伏电压下电泳50分钟。使用NOVA湿转装置，按照制造商说明书将凝胶中的蛋白质-RNA复合物转移至硝酸纤维素膜上。转膜后，用 PBS 缓冲液冲洗膜。然后用保鲜膜包裹，并在 -80 摄氏度下曝光至胶片。分别进行 30 分钟、1 小时和过夜曝光。接下来，根据蛋白质-RNA复合物从低丰度RNA中分离膜区域。使用放射自显影图像作为模板进行实验。通过蛋白酶K消化和酚-氯仿抽提从膜上回收RNA。使用 AYP 引物之一对 RNA 进行逆转录，以凝胶纯化 cDNA。将六微升 cDNA 样品与六微升两倍浓度的 TBE 尿素上样缓冲液混合。在将样品上样到凝胶之前立即进行此操作。将样品在 80 摄氏度下加热 3 分钟。然后将样品与低分子量标记物一起上样至预制的 6% TBE 尿素凝胶中。按照制造商的说明，以 180 伏电压电泳运行 40 分钟，利用上层染料和塑料凝胶支架上的标记来指导切胶操作。切取三条条带，分别为120至200个核苷酸、85至120个核苷酸以及70至85个核苷酸。请注意，arc lip引物和L3序列共同占CLIP序列的52个核苷酸。加入400微升TE缓冲液，并将凝胶切片碾碎成小块。使用1毫升注射器活塞，将凝胶小块在37摄氏度下以每分钟1,100转的速度振荡孵育两小时。将两个1厘米的玻璃预滤器放入CoStar SpinX柱中。将样品的液体部分转移至该柱中，在13,000转/分钟的条件下离心一分钟，收集至1.5毫升离心管中。加入0.5 µL甘油蓝和40 µL pH 5.5的乙酸钠。然后混匀样品。加入1 mL 100%乙醇。再次混匀，并在 -20 摄氏度下沉淀样品过夜。最后，将 cDNA 分子环化，使接头区域连接至 5' 末端。接着，重新线性化并根据随附的书面实验方案进行 PCR 扩增，在对眼夹文库进行测序之前，实验的成功可在两个步骤中进行监测。在膜转移后，低RNA样品的蛋白-RNA复合物自显影图中，PCR产物的凝胶图像显示放射性信号应弥散分布在蛋白分子量以上的区域；而对于高RNA样品，该放射性信号则更集中于接近蛋白分子量的位置。在免疫沉淀过程中若未使用抗体，则不应检测到任何信号。为进一步验证免疫沉淀的特异性，还需设置其他重要对照，例如使用发射UVE辐射的光源，或采用不表达目标蛋白的细胞。PCR产物的凝胶图像应显示出与cDNA片段相对应的大小范围。需要注意的是，PCR引物P3 Celexa和P5 Celexa会在cDNA片段的基础上额外引入76个核苷酸。若在免疫沉淀过程中未使用抗体，则不应检测到相应的PCR产物。在进行该实验操作时，重要的是要牢记，64个步骤中的每一步都至关重要，必须以百分之百的准确性执行。ICL数据可与转录组范围的功能分析进行计算整合。例如，这种方法有助于深入了解RNA加工过程中依赖于位置的调控机制。对于计算数据分析，我们建议参考我们近期与欧洲生物信息学研究所的 Nicholas KA 以及利雅那大学的 bla zupan 合作发表的论文。现在是您开始自己实验的时候了。祝您实验愉快。

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iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

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