Name: 一个视神经挤压伤的小鼠模型，研究视网膜神经节细胞生存 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习视神经挤压伤小鼠模型，通过荧光染料逆行标记视网膜神经节细胞，利用荧光显微镜分析细胞存活与凋亡。该方法为研究青光眼等视神经病变提供了可靠的实验框架。

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我们的研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所的院内研究计划资助。

所有使用的仪器和试剂均为无菌。所有动物实验均经国家眼科研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准（动物研究方案编号 NEI-570），并依照美国国立卫生研究院（NIH）的指南与规定进行。
1. 第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记
本实验的目的是在小鼠视神经 crush 损伤前 3 天，将神经示踪染料注射到上丘，从而逆行标记视网膜神经节细胞。该染料可被视网膜神经节细胞逆行摄取，作为存活 RGCs 的标记物（图 1）。该方法可稳定地标记存活的 RGCs，个体间差异较小1-5。
<ol>
 <li>对小鼠进行深度麻醉。清理头部上方的毛发，将小鼠置于小型立体定位仪中。在双眼涂抹保护性软膏，并分别使用碘伏和70%酒精擦拭消毒头部皮肤各三次。</li>
 <li>切开皮肤以暴露颅骨，并使用3%过氧化氢保持术区干燥清洁。</li>
 <li>确定并标记前囟位置，在每侧半球前囟后方2.9 mm、中线外侧0.5 mm处钻孔7。钻孔过程中需向钻孔部位滴加生理盐水，以防止继发性热损伤。</li>
 <li>利用立体定位测量装置和哈密尔顿注射器，将FluoroGold神经示踪染料（1 μl 含3% Fluorochrome的生理盐水溶液）缓慢注入每侧上丘，进针深度为颅骨表面下1.6 mm。</li>
 <li>缝合切口，并皮下注射布托啡诺以镇痛。</li>
 <li>将小鼠转移至温暖干燥的环境中，持续观察直至其能够自主维持直立姿势，然后将其放回原饲养笼。标记操作后的前三天内，每天两次给予全身性镇痛药（如布托啡诺）及局部抗生素软膏，并密切监测小鼠状态。</li>
</ol>
2. 第4天视神经 crush 损伤
在此操作中，我们将对视神经施加挤压损伤，以造成轴突的原发性损伤（图2），这将导致视网膜神经节细胞逐渐死亡。
<ol>
 <li>在示踪染料注射后第三天，对小鼠进行深度麻醉。使用解剖显微镜，用弹簧剪刀在一只眼睛的结膜约4点钟位置做切口。</li>
 <li>轻柔地拨开眶内肌肉并将其移至一侧，暴露视神经自眼球后方穿出的白色部分。操作过程中需格外小心，避免损伤任何血管。</li>
 <li>借助交叉作用镊子，在距离眼球约2 mm处对视神经施加约3秒的压榨性损伤。操作时须特别注意避免损伤眼动脉，以防出血。</li>
 <li>完成压榨损伤后，缝合切口。</li>
 <li>在小鼠苏醒前，皮下注射布托啡诺以提供镇痛。</li>
 <li>将小鼠转移至温暖干燥的区域进行监测，直至其能够自主维持直立姿势，随后将其放回原饲养笼。在压榨损伤手术后的前三天内，每天两次给予全身性镇痛药（如布托啡诺）和局部抗生素软膏，并对小鼠进行密切观察。</li>
</ol>
3. 在第11天收获视网膜并分析视网膜神经节细胞存活情况
本实验的目的是获取视网膜，以分析视网膜神经节细胞的存活情况。
<ol>
 <li>在第11天（视神经钳夹损伤后第7天），通过注入CO2并行颈椎脱位处死小鼠。</li>
 <li>使用镊子对眼眶施加压力，摘除眼球。</li>
 <li>将眼球置于4%多聚甲醛溶液中固定2小时，随后用PBS洗涤三次。分离视网膜。视网膜分离的操作步骤此前已于2010年由Gustmann, S. et al.6在JoVE上发表，因此本文不再赘述。</li>
 <li>使用荧光显微镜在视网膜的特定区域拍摄存活的视网膜神经节细胞图像，并可计数视网膜神经节细胞密度。图3展示了经荧光标记的视网膜神经节细胞在有或无视神经钳夹损伤情况下的代表性结果。</li>
</ol>
4. 典型结果：
为分析视网膜神经节细胞的存活情况，在视神经 crush 损伤后第 7 天取视网膜组织，固定、展平并封片。使用荧光显微镜拍摄视网膜图像。与未受伤的正常视网膜（左侧，正常）相比，视神经 crush 损伤后的视网膜中存活的 RGC 数量（绿色，由注射至上丘的 FluoroGold 神经示踪染料逆行标记）显著减少（右侧，ONC）（图 3）。
<img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig1.jpg" alt="视神经至皮层的神经通路示意图；视觉信号流向及大脑处理过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 视网膜神经节细胞的基础逆行标记 
为了在视神经 crush 损伤后的不同时间点计数存活的视网膜神经节细胞，需在视神经（红色）损伤前3天，向大脑中的上丘注射一种神经示踪染料（绿色），从而逆行标记视网膜神经节细胞。由于视网膜神经节细胞的轴突终止于上丘，示踪染料将被这些细胞逆行摄取，从而标记出存活的视网膜神经节细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig2.jpg" alt="神经通路示意图，视神经与视网膜连接，视觉处理分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 视神经 crush 损伤 
为分析视网膜神经节细胞存活状态，需对视神经（红色）施加 crush 损伤，以造成轴突的原发性损伤。这将导致视网膜神经节细胞逐渐死亡。在示踪染料（绿色）注射后三天，对小鼠进行麻醉。切开单侧眼睛的结膜，拨开眼眶肌肉并将其移开，暴露视神经自眼球出口处。使用交叉动作镊子在距眼球约 2 mm 处对视神经施加约 3 秒的 crush 损伤。
<img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig3.jpg" alt="细胞样品的荧光显微镜图像，正常组与视神经 crush 损伤组对比，显示蛋白表达差异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 视神经 crush 损伤前后荧光标记的视网膜神经节细胞 
为分析视网膜神经节细胞的存活情况，在视神经 crush 损伤后第七天取材视网膜，固定、展平并封片。使用荧光显微镜拍摄视网膜图像。与未受伤的正常视网膜（左侧，正常）相比，视神经 crush 损伤后的视网膜（右侧，ONC）中存活的 RGC 数量显著减少（绿色，由注射至上丘的神经示踪染料 FluoroGold 逆行标记）（图 3）。比例尺：50 μm

<ol><li>Yoles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1+reduces+injury-induced+metabolic+deficits+and+degeneration+in+the+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).</li>
<li>Fisher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+for+neuroprotection+in+the+mouse+optic+nerve%3A+implications+for+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies.</a> J Neurosci. 21, 136-142 (2001).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGC+death+in+mice+after+optic+nerve+crush+injury%3A+oxidative+stress+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+inhibits+apoptosis+via+VEGFR-1-mediated+suppression+of+the+expression+of+BH3-only+protein+genes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).</li>
<li>Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+effect+of+PDGF-CC+rescues+neurons+from+apoptosis+in+both+brain+and+retina+by+regulating+GSK3beta+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).</li>
<li>Gustmann, S., Dunker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-like+organotypic+murine+retinal+wholemount+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

视神经 crush 损伤小鼠模型可用于研究视网膜神经节细胞（RGC）死亡与存活的过程。该模型也常用于探讨不同试剂和基因对 RGC 凋亡及存活的影响。此模型的一个优点是具有高度的可重复性，且个体间差异极小。
然而，该模型中的多个步骤需要特别注意。首先，在制造视神经挤压损伤时，必须避免使用过大的力量或挤压时间过长，因为这可能导致眼动脉受损，进而引发视网膜缺血。此外，在暴露视神经的过程中，应格外小心，避免损伤小鼠眼球周围其他血管。

<table><tbody><tr><td>立体定位仪</td><td>ASI Instruments</td><td>SAS-4100</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PZMIV-BS</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>15号手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>微型钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>缝合针</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>16144-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>88400</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Office Depot</td><td>674889</td><td></td></tr><tr><td>荧光染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>70%</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>3%</td></tr></tbody></table>

一种用于研究视网膜神经节细胞存活的视神经 crush 损伤小鼠模型

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

视神经损伤可导致轴突变性，随后引起视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐死亡，从而造成不可逆的视力丧失。人类中此类疾病的例子包括外伤性视神经病变和青光眼中的视神经变性。其特征为视神经乳头的典型改变、进行性视神经变性和视网膜神经节细胞的丢失，若不加以控制，最终将导致视力丧失和失明。
视神经钳夹（ONC）损伤小鼠模型是研究外伤性视神经病变、青光眼等疾病的重要实验模型。在该模型中，视神经受到钳夹损伤后，会导致视网膜神经节细胞逐渐发生凋亡。该疾病模型可用于研究神经元死亡与存活的普遍过程和机制，这对于治疗策略的开发至关重要。此外，可在此模型中应用药理学和分子生物学方法，识别并验证潜在的治疗试剂，以治疗不同类型的视神经病变。
本文提供了以下步骤的逐步演示：（I）第1天对视网膜神经节细胞（RGCs）进行基线逆行标记，（II）第4天实施视神经 crush 损伤，（III）第11天获取视网膜并分析RGC存活情况，以及（IV）代表性结果。

本方案展示了如何逆行标记视网膜神经节细胞，以及随后如何制造视神经 crush 损伤，以分析视网膜神经节细胞的存活与凋亡情况。该模型是一种用于研究不同类型视神经病变（包括青光眼）的实验性疾病模型。

视神经损伤可导致轴突变性，随后视网膜神经节细胞（RGCs）逐渐死亡，从而引起不可逆的……

本实验方案演示了在小鼠模型中进行视神经 crush 损伤及随后对视网膜神经节细胞存活情况的分析。该方法通过将荧光染料注射至上丘实现。在第一天，DI 逆行运输至视网膜神经节细胞，从而标记该细胞群体，作为第二步操作。在第四天进行视神经 crush 损伤，以诱导视神经变性，进而导致视网膜神经节细胞逐渐死亡。在第11天，解剖视网膜以检测视网膜神经节细胞的存活情况。该实验结果通过荧光显微镜对Fluoro Gold标记的视网膜神经节细胞进行计数，显示存活的视网膜神经节细胞数量。您好，我来自美国国立卫生研究院国家眼科研究所的 Dr.Lab。现在我将向您演示如何进行小鼠视神经 crush 损伤模型的操作。该技术的主要优势在于，它能够提供一种简单、稳定且高效的方法来标记视网膜节细胞，并用于研究视神经 crush 损伤后细胞的存活或退变情况。该方法可帮助解答视神经研究领域的一些关键问题，例如青光眼。如果我们在视神经损伤前或同时施加某些治疗措施，如生长因子或某些受体激动剂或抑制剂，则该技术的应用前景可延伸至治疗领域。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，初学者常出现出血问题，因为视神经区域含有可见的血管。因此，该方法的可视化演示至关重要，因为视神经沟部分较难掌握。然而，通过练习会变得更容易。在使用批准的麻醉剂对小鼠进行深度麻醉后，剃除头部切口区域周围的毛发。将小鼠小心地放入立体定位仪中，并确保头部稳定。使用碘酒和70%酒精溶液交替对头皮进行三次消毒，每种溶液各使用三次。使用无菌手术刀在头皮上做矢状切口，以暴露颅骨。用3%过氧化氢清洁颅骨。然后确定颅骨上矢状缝与冠状缝交汇处的bregma位置。从此点向后测量2.9毫米，向外侧测量0.5毫米至rema。仔细标记该点，并在第二个标记点处小心钻出一个小孔。钻孔过程中，需向钻孔部位滴加生理盐水，以防止继发性热损伤。钻出合适的小孔后，将 Hamilton 注射器置于该孔上方。确保针头顺利穿过脑膜，并将注射器针尖降至距脑表面1.6毫米的深度。然后以每分钟0.2微升的缓慢流速，向视上丘注射1微升的氟金神经示踪染料。让针头原位留置5分钟，以防止氟金沿针道向上扩散。接下来，小心拔出针头，并用缝线闭合切口部位。然后将小鼠从立体定位仪中取出。皮下注射布托啡诺以进行镇痛。将小鼠转移至温暖、干燥的区域。持续观察动物，直至其能够维持直立姿势。然后在标记操作后的前三天内将其放回原饲养笼中。全身性镇痛药和局部抗生素软膏每日给予两次，并密切监测小鼠状态。示踪染料注射后三天，使用批准的麻醉剂对小鼠实施深度麻醉。将小鼠置于解剖显微镜下，并调整位置以便观察小鼠眼部。使用一对弹簧剪在左眼四点钟位置剪开结膜。接下来，轻柔地分离眼眶肌肉并将其移向一侧，注意不要损伤任何血管。在视神经从眼球后部穿出处暴露白色的视神经。然后使用交叉动作镊子，在距离眼球2毫米处夹伤视神经，施加压力持

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