Name: 眼内容剜除小鼠玻璃体和视网膜蛋白质组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: 学习小鼠眼内容剜除技术，通过解剖前段、镊子固定和锋利刀片切口分离玻璃体、视网膜和晶状体，利用离心过滤装置进行组织分离，为神经科学和眼科学蛋白质组学研究提供可靠的样本制备方法。

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资金由“为视力而战”和“预防失明研究”提供。

1. 前节解剖。
<ol>
	<li>用0.22有齿镊夹住角巩膜缘后部的巩膜组织，以稳定眼球。</li>
	<li>使用显微手术刀从一侧角巩膜缘至另一侧角巩膜缘在角膜上做一线性切口。</li>
	<li>然后用0.12 Colibri镊子夹住切口处的角膜。</li>
	<li>随后用Weck-Cel外科棉签吸收前房内的液体。</li>
</ol>
2. 晶状体摘除术。
<ol>
	<li>使用一把0.12 Colibri镊子夹住角膜，以固定眼球。</li>
	<li>将精细的弯头针持（或弯头敷料镊）插入晶状体后方，朝向眼球后部。部分闭合针持，并向前牵拉。同时，用镊子在巩膜外表面施加压力，推动晶状体通过角膜切口向前移出，而保持眼球壁完整。玻璃体呈半透明凝胶状，部分与晶状体粘连。</li>
	<li>随后将晶状体-玻璃体组织置于含有20 µL蛋白酶抑制剂混合液（Roche）的PBS溶液的滤芯离心管中。</li> 
</ol>
3. 视网膜剜出。
<ol>
	<li>继续用0.12 Colibri镊子夹住角膜切口，以稳定眼球。</li>
	<li>将细小的弯头持针器（或弯头敷料镊）尽可能向眼球后部移动，靠近视神经处。持针器部分闭合后向前牵拉，同时用镊子对外部巩膜表面施加压力，推动视网膜通过角膜切口向前移出。玻璃体呈现为附着在视网膜上的透明凝胶状物质，视网膜则表现为黄色、带血管的组织。任何条状的色素组织可用镊子剥离去除。</li>
	<li>随后将视网膜-玻璃体组织放入含有晶状体-玻璃体组织的滤过离心管中。</li>
</ol>
4. 过滤离心。
<ol>
	<li>将滤过的离心管放入台式离心机中，在14,000 × g 条件下离心12分钟。</li>
	<li>从下室中吸出流出液，即为玻璃体液。视网膜保留在上室中。这些样品可用于蛋白质研究。</li>
</ol>
5. 代表性结果
玻璃体样本通过SDS-PAGE进行分析（图2）。样本还用于酶活性测定（图3）。
<img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="人眼与小鼠眼结构对比；晶状体和玻璃体解剖结构示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠眼球示意图。人眼与小鼠眼球的横截面示意图显示，由于小鼠的晶状体较大，其玻璃体腔体积相对较小。
<img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="SDS-PAGE蛋白质电泳结果，玻璃体与视网膜泳道，可见分子量标记物。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠玻璃体与视网膜的一维SDS-PAGE分析。小鼠玻璃体（泳道1，13.6 mg/mL）和视网膜（泳道2，11.35 mg/mL）的蛋白质谱。凝胶电泳在150 kV下进行45分钟，使用Flamingo荧光凝胶染色剂染色，并通过VersaDoc成像系统（BioRad，Hercules，CA）进行可视化。
<img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="显示视网膜活性的柱状图；阳性与阴性对照比较；实验结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 小鼠和人玻璃体中超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性。采用比色法测定总SOD活性（SOD活性比色检测试剂盒，#AB65354，Abcam, Inc, Cambridge, MA），样本来源于DBA和白化小鼠摘除眼球后获取的玻璃体和视网膜。将结果与死后人供体眼球获取的人玻璃体核心及人视网膜中的SOD活性进行比较，以确定相对活性水平。未稀释的玻璃体核心样本使用23号针头手动抽吸获取11，视网膜则通过展开眼球并将组织从RPE/脉络膜复合体上切割分离获得。尽管该检测方法无法区分SOD的不同亚型，但玻璃体中的SOD活性很可能反映的是SOD3，因为它是唯一的细胞外亚型12。视网膜中的SOD活性则可能反映全部三种SOD亚型：胞内的SOD1、线粒体内的SOD2以及细胞外的SOD312。对于包括本SOD检测在内的高灵敏度酶学检测，存在蛋白质交叉污染的可能性，需进一步研究加以验证。误差线表示标准误（SEM）。

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
<li>Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+abnormalities+in+transgenic+mice+harboring+mutations+in+the+type+II+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene.</a> Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).</li>
<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

动物实验均按照眼科与视觉研究中动物使用声明的规定，由眼科研究协会执行。

转基因小鼠是研究视网膜及玻璃体视网膜疾病的重要模型。6-10 然而，由于小鼠眼球的晶状体较大，其玻璃体占眼球总体积的比例显著小于人类玻璃体。5 这使得小鼠玻璃体的分离与纯化较为困难。了解增殖性糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎及视网膜脱离等疾病过程中玻璃体内蛋白质的变化，有助于揭示这些疾病的进展机制。本可视化实验方案提供了一种获取并纯化小鼠玻璃体的方法，同时最大限度地提高蛋白质得率，以用于酶学和蛋白质组学分析。

<table><tbody><tr><td>15&amp;#x00B0;，BD Beaver 显微手术刀片</td><td>BD Biosciences</td><td>374881</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>0.22 Fine-Castroviejo 缝合镊</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E1805</td><td></td></tr><tr><td>0.12 Colibri 镊子</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>2/132</td><td></td></tr><tr><td>Microcon 离心过滤器 Ultracel YM-100 或 YM-50</td><td>EMD Millipore</td><td>42412, 42415</td><td></td></tr><tr><td>SOD 活性比色法检测试剂盒</td><td>Abcam</td><td>Ab65354</td><td></td></tr><tr><td>Weck-Cel 外科棉签</td><td>Medtronic Inc.</td><td>0008680</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Flamingo 荧光凝胶染色剂</td><td>Bio-Rad</td><td>161-04910</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠玻璃体和视网膜的摘除用于蛋白质组学分析

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

尽管小鼠视网膜已成为研究遗传性视网膜疾病的重要遗传模型，但小鼠玻璃体仍尚未被充分探索。玻璃体是一种高度含水的细胞外基质，覆盖于视网膜上方，在疾病过程中会积聚眼内及眼外来源的蛋白质1-3。玻璃体与视网膜之间的异常相互作用是多种疾病的基础，例如视网膜脱离、增殖性糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎以及增殖性玻璃体视网膜病变1,4。由于小鼠晶状体几乎占据其眼球体积的75%，小鼠玻璃体的相对体积显著小于人类玻璃体（图1）5。这使得对小鼠玻璃体进行生化研究具有挑战性。在本视频文章中，我们介绍一种从小鼠视网膜中分离和提取玻璃体的技术，该技术将有助于利用转基因小鼠模型更清晰地界定该细胞外基质在玻璃体视网膜疾病发生发展中的作用。

该解剖技术展示了从小鼠眼球中摘除玻璃体、视网膜和晶状体，通过离心法进行分离，并利用蛋白质检测进行表征。

尽管小鼠视网膜已成为研究遗传性视网膜疾病的重要遗传学模型，但小鼠玻璃体仍待深入探索。玻璃体是……

人眼中充满一种称为玻璃体的液态细胞外基质，小鼠眼中的情况也是如此。这一空间大部分被晶状体占据。为了分离玻璃体和视网膜，我们首先需要解剖前房部分，用镊子固定眼球，并使用超锐利的刀片在角膜上做一次切口。钝的刀片可能会撕裂角膜，需要多次切割。使用 WEX 细胞海绵吸收前房中的液体。箭头指示了我们将用镊子挤压晶状体和玻璃体并将其挤出的位置，部分闭合镊子后向前牵拉。晶状体呈透明球状，其后方为玻璃体凝胶。在此示例中，玻璃体仍附着于晶状体后部，为分离视网膜，将视网膜镊置于靠近视神经的更后方，轻轻挤压后向前牵拉。视网膜呈现为黄色胶冻样物质。在某些情况下，视网膜、玻璃体和晶状体会作为单一组织被取出。下一步是使用滤膜离心装置分离并分离这三种组织。将滤膜放入离心管的上部，然后加入一些磷酸盐缓冲液。每种组织分离后，将其置于含有滤膜的上方上层小室中。左上角的镜头以及右下角的视网膜玻璃体。将离心管放入微量离心机中，在14,000 ×g 条件下离心12分钟。玻璃体会旋转至离心管底部，而视网膜将留在上层。我们将使用镊子将晶状体与视网膜分离，然后从上层液体中分离出视网膜。所有这些组织均可置于离心管中，随后进行蛋白质组学分析。

evisceration-of-mouse-vitreous-and-retina-for-proteomic-analyses

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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