Name: 人类血管周围干细胞用于骨再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解人类血管周围干细胞（PSC）在骨再生中的应用，学习从脂肪组织分离PSC并结合定制支架促进体内骨形成的方法。该视频展示异位和原位骨分化模型的实验技术，为干细胞生物学和组织工程研究提供重要参考。

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本工作得到了CIRM早期转化II类研究奖TR2-01821、美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）资助项目R21 DE0177711和RO1 DE01607、加州大学发现计划资助项目07-10677的支持。AWJ和RKS获得了T32培训奖学金（5T32DE007296-14），JNZ获得了CIRM培训奖学金（TG2-01169）。

1. 血管周围干细胞的分离
这在M. Corselli撰写的相邻文章《从人白色脂肪组织中分离血管周围干细胞》中有详细描述。 等
2. 支架制备
<ol>
	<li>支架根据已发表的方案定制，采用聚（乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA，Burmingham Polymer）制备，并涂覆羟基磷灰石4-6采用溶剂浇铸和颗粒沥滤法制备由85/15 PLGA制成的磷灰石涂层PLGA支架。支架可制成球形（直径2 mm），用于肌肉袋植入；盘状（直径4 mm），用于颅骨植入；或圆柱形（直径4 mm，长度6 mm），用于股骨节段性缺损。</li>
	<li>简而言之，将PLGA/氯仿溶液与蔗糖混合（聚合物/蔗糖质量比为5/95），浇铸至200-300-μm 直径Teflon模具以制备定制的支架结构。在冷冻干燥过夜后，将支架从Teflon模具中取出并浸入ddH₂O中。2O以溶解蔗糖。支架通过浸入70%乙醇中消毒30分钟，随后用ddH₂O冲洗三次。2O.</li>
	<li>为了进行磷灰石涂层，通过依次溶解 CaCl₂·2H₂O 和 Na₂HPO₄·2H₂O，制备模拟体液（SBF）溶液。2，MgCl2•6H2O, NaHCO₃3，以及 K2HPO4•3H2ddH₂O 中2O. 加入 1 M 盐酸将溶液 pH 降至 6，以提高溶解度。Na2SO4，加入 KCl 和 NaCl，并将最终 pH 值调节至 6.5（SBF 1）。</li>
	<li>Mg2+ 和 HCO3- 通过添加 CaCl₂ 制备无蛋白质 SBF（SBF 2）2 和 K2HPO4•3H2ddH₂O 中2O₂ 并将 pH 调至 6。加入 KCl 和 NaCl，最终 pH 调整至 6.8。所有溶液均通过无菌滤膜过滤 0.22 μm PES 膜（Nalgene）。在涂覆过程开始前，需立即对干燥的 PLGA 支架进行辉光放电氩等离子体刻蚀处理（Harrick Scientific），以改善润湿性和涂覆均匀性。</li>
	<li>蚀刻后的支架在 SBF 1 中孵育 12 小时，随后更换为含 Mg2+ 和 HCO3- 在无 SBF 2 的条件下继续孵育 12 小时 37 °C 在温和搅拌下进行。用ddH₂O洗涤包被的支架2O 以去除多余的离子，并在进一步研究前进行冻干处理。</li>
</ol>
3. 肌肉囊模型植入
<ol>
	<li>在植入前立即向基于PLGA的球形植入物上轻轻滴加100 μl PBS（磷酸盐缓冲液）中的PSC悬液。细胞已通过慢病毒插入萤光素酶（Firefly luciferase）进行预标记，以便植入后进行活体追踪。细胞密度为每植入物2.5 × 105。</li>
	<li>使用6周龄的SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠。动物通过吸入异氟烷麻醉，并以布托啡诺（buprenorphine，Bedford Labs）进行术前给药。常规使用聚维酮碘（Betadine）准备后，在后肢做双侧切口（纵向，长度2 mm）。</li>
	<li>沿股二头肌肌纤维长轴方向，通过钝性分离切开肌内 pockets。每只小鼠植入一个含PSCs的基于PLGA的植入物，并用5-0 Vicryl（Ethicon）缝合覆盖肌肉的筋膜。</li>
	<li>随后以5-0 Vicryl采用皮下缝合方式关闭皮肤。动物术后接受布托啡诺治疗48小时，以及TMP/SMX（甲氧苄啶/磺胺甲噁唑；Trimethoprim/Sulfamethoxazole；Qualitest）治疗10天。</li>
</ol>
4. 颅骨缺损模型植入
<ol>
	<li>按照方案，对12至14周龄的SCID小鼠进行异氟烷麻醉后，剪除毛发并用聚维酮碘消毒皮肤。</li>
	<li>沿小鼠颅骨矢状缝做8 mm的皮肤切口，随后用棉签轻轻去除颅骨骨膜。</li>
	<li>接着，使用金刚石涂层 trephine 钻头在高速牙科钻上制备4 mm的顶骨缺损。该缺损为全层厚度，但需注意避免损伤下方的硬脑膜。</li>
	<li>然后将含有植入PSCs的定制PLGA基植入物轻柔地放置于缺损部位，每个植入物的细胞密度为2.5 × 105。最后用6-0 Vicryl缝合皮肤。术后动物接受丁丙诺啡镇痛治疗48小时，并给予TMP/SMX治疗10天。</li>
</ol>
5. 股骨节段性缺损模型植入
<ol>
	<li>在异氟烷吸入麻醉下，对12-14周龄的无胸腺大鼠进行麻醉。按照标准程序使用聚维酮碘对股骨进行消毒准备（图1）。</li>
	<li>在股骨前外侧区域做一条27-30毫米的纵向切口。通过分离股外侧肌和股二头肌暴露股骨干（图2）。</li>
	<li>为最大程度保证骨再生的一致性，随切除的股骨节段一并完全去除覆盖在股骨缺损区的骨膜。</li>
	<li>将一块聚乙烯板（长度23毫米，宽度4毫米，高度4毫米）置于股骨前外侧表面。该板上设有六个预钻孔，用于固定直径0.9毫米的带螺纹克氏针（Zimmer）。以该板为模板，将六根带螺纹克氏针穿过钢板并贯穿双侧皮质（图3）。</li>
	<li>随后，使用小型摆动锯片（Stryker, MI）制造一个6毫米的股骨中段骨干缺损。通过插入按协议负载细胞的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）基植入物来处理节段性缺损（图4）。</li>
	<li>用4-0 Vicryl可吸收缝线缝合覆盖的肌肉和筋膜，以固定植入物，并缝合皮肤。</li>
</ol>
6. 体内 评估
<ol>
	<li>采用高分辨率 X 射线（XR）和高分辨率 μCT（微型计算机断层扫描）进行纵向放射学评估。μCT 分析（Skyscan 1172F）的扫描分辨率为 19.73 μm（使用 100 kV 和 100 mA 的辐射源，配备 0.5 mm 铝滤膜）。图像分析使用 DataViewer、Recon、CTAn 和 CTVol 软件完成。</li>
	<li>通过连续进行的生物发光成像评估细胞移植后的植入、存活、增殖情况，并排除细胞从植入部位迁移的可能性。生物发光成像使用 IVIS Lumina II 设备（Caliper Life Sciences）完成。光输出量通过 Living Image 软件（Xenogen）进行定量，总光输出以 光子/秒/平方厘米/球面度（photons/second/sq cm/steradian）记录。</li>
	<li>组织学与组织形态计量学分析在动物死亡后进行。常规染色方法包括 Masson 三色染色、苯胺蓝染色、五色染色以及苦味酸-天狼星红染色。使用苯胺蓝或五色染色可方便地进行组织形态计量分析，其中类骨质分别呈深蓝色和黄色。高倍视野下的像素数量通过 Adobe Photoshop 中的魔棒工具进行计算。</li>
</ol>
7. 代表性结果
由于颅骨和股骨缺损均为临界尺寸，若不使用生长因子或外源性干细胞进行治疗，不应期待有显著的愈合。
在手术操作方面，肌肉袋分离应沿筋膜平面进行，因此出血量应极少。尽管肌肉袋模型为双侧操作，小鼠在术后第1天应能轻松行走。对于颅骨缺损模型，可能会有出血，可用棉签吸除。需格外注意避免损伤下方的硬脑膜，否则将干扰正常愈合过程。在FSD模型中，应注意避免损伤主要血管，以防止大量出血，同时避免损伤股神经以预防神经损伤。使用克氏针钻孔时应施加轻柔压力，避免在此过程中损伤皮质骨。
<img alt="组织表面纹理、显微图像、生物样本分析、细胞结构研究" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1."> 
图 1. 裸鼠股骨节段性缺损（FSD）术前准备。雄性大鼠（12–14 周龄）通过吸入异氟烷进行麻醉。按照标准操作规程，使用聚维酮碘对股骨区域进行清洁和消毒处理。
<img alt="兽医手术中显示肌肉解剖结构的手术切口，突出显示组织层次。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2。"> 
图 2. 股骨节段性缺损（FSD）造模的手术暴露。在股骨前外侧做一长度为 27–30 mm 的纵行切口。通过分离股外侧肌和股二头肌暴露股骨干的外侧部分。
<img alt="外科植入实验，图像显示软组织中的医用固定装置。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3。"> 
图3. 股骨节段性缺损（FSD）构建的固定方法。将一块聚乙烯板（长度23 mm；宽度4 mm；高度4 mm）置于股骨前外侧表面。该板上设有六个预钻孔，用于插入直径0.9 mm的带螺纹克氏针。以该板作为模板，将六根带螺纹克氏针穿过板及股骨双侧皮质。随后，创建一个6 mm的骨干中段缺损。完成此步骤后，直接植入定制支架，该支架与缺损部位完全匹配（图中未显示）。
<img alt="口腔黏膜活检图像，显示用于医学诊断分析的组织病理学特征。" src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4。"> 
图4. 颅骨缺损术后示例。在无胸腺小鼠的右侧顶骨上创建一个直径4 mm的圆形颅骨缺损。此处显示的是术后8周植入多能干细胞（PSCs）的缺损部位。请注意缺损区域内有新骨形成。

<ol><li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li>
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</ol>

K.T.、B.P. 和 C.S. 是来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）提交的血管周围干细胞相关专利的发明人。K.T. 和 C.S. 博士是 Scarless Laboratories 公司的创始人，该公司从加州大学校董会获得血管周围干细胞相关专利的分许可。Chia Soo 博士 also 是 Scarless Laboratories, Inc. 的管理人员。

多能干细胞（PSCs）的分离方法在其他文献中已有详细描述1-3，包括一篇专门提交的 JoVE 文章，重点介绍 PSC 分离方案与方法。本文的具体目的是描述并演示三种 PSC 分离方案 体内 骨形成/再生应用。SCID小鼠肌肉袋模型是常用于异位人骨形成的模型7在骨组织研究中，异位模型与原位（缺损）模型之间存在重要差异，包括与宿主成骨细胞的旁分泌相互作用8 以及骨骼缺损微环境中存在的大量成骨信号因子。本文介绍了两种缺损模型：颅骨缺损和股骨节段性缺损4两者均有充分文献记载为临界尺寸缺损（即无法自行愈合）。 
颅骨缺损与股骨缺损之间存在显著差异。首先，异种移植的PSCs与内源性细胞之间的细胞-细胞相互作用截然不同。在颅骨缺损中，PSCs会与下方的硬脑膜（脑膜的最外层）以及环绕缺损区域的成骨细胞和骨膜细胞发生相互作用。重要的是，移植细胞与周围成骨细胞8之间的相互作用，或移植细胞与下方硬脑膜之间的相互作用（Levi et al.，待发表）对于干细胞介导的正常成骨过程至关重要。而在股骨节段性缺损（FSD）中，异种移植的PSCs所处的细胞和细胞因子环境则完全不同。例如，FSD部位包含骨髓及其伴随的间充质干细胞，以及骨内膜、骨膜和长骨成骨细胞。理论上，每种细胞对损伤都有其独特的反应，并且每种细胞都可能与PSC异种移植物发生细胞-细胞相互作用。
颅骨缺损与股骨缺损之间还存在其他明显差异。颅骨最初通过膜内成骨形成，而长骨则通过软骨中间阶段（软骨内成骨）形成。此外，损伤后的修复过程也模仿了这些发育起源。股骨缺损术后（FSD后）可观察到软骨痂的形成，而在顶骨缺损中则不会形成软骨中间阶段。最后，颅骨的胚胎起源可能与长骨不同。大部分颅骨（包括头部整个区域的血管周围细胞——周细胞）来源于神经嵴（中胚外胚层），而附肢骨骼则来源于轴旁中胚层9。这些差异可能导致PSC介导的骨修复在不同部位产生显著差异。
 与传统的脂肪来源基质细胞（ASCs）相比，PSCs 的使用具有多项优势。PSCs 无需体外培养，且为纯化的细胞群体，不包含其他不参与成骨分化、甚至可能负向调控成骨分化的基质细胞，例如内皮细胞10。相比之下，例如对 ASCs 的克隆分析表明，仅有一部分亚群能够在体外进行成骨分化in vitro11。最终，骨骼组织工程策略很可能会将具有成骨能力的干细胞（如 PSCs）、外源性生长因子以及成骨传导性支架（如本方法中使用的 HA-PLGA）相结合，以实现骨骼缺损的最佳修复。

使用人血管周围干细胞进行骨再生

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

人类血管周围干细胞（PSCs）可从多种组织中分离获得足够数量，用于骨骼组织工程1-3。PSCs 是通过 FACS 分选获得的“周细胞”（CD146+CD34-CD45-）和“外膜细胞”（CD146-CD34+CD45-）的混合群体，我们此前已报道这两类细胞均具有间充质干细胞的特性。与间充质干细胞（MSCs）类似，PSCs 能够进行成骨分化，并分泌促成骨细胞因子1,2。在本实验方案中，我们通过多种动物模型展示了 PSCs 的成骨能力，包括在 SCID（严重联合免疫缺陷）小鼠中进行肌肉袋植入、SCID 小鼠颅骨缺损模型以及无胸腺大鼠的股骨节段性缺损（FSD）模型。大腿肌肉袋模型用于评估异位骨形成能力。颅骨缺损位于顶骨中央，标准直径为 4 mm（临界尺寸）8。FSD 为贯穿皮质骨的缺损，使用聚乙烯条和克氏针进行固定4。所描述的 FSD 同样属于临界尺寸缺损，无法自行实现显著愈合4。相比之下，若在缺损部位植入干细胞或生长因子，则可观察到明显的骨再生。PSC 异种移植的总体目标是验证该细胞类型在异位和原位骨再生模型中的成骨潜能。

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

人类血管周围干细胞（PSCs）可从多种组织中分离获得足够数量，用于骨骼组织工程1-3。PSCs是...

以下实验的总体目标是观察血管周围干细胞在异位和原位骨分化模型中植入后的效应。首先利用fax技术从脂肪组织中分离干细胞，然后制备定制支架，为细胞在异位或原位环境中的分化提供表面支持。为了检测PSC介导的骨形成，可采用裸鼠肌肉袋模型、裸鼠颅骨模型或无胸腺大鼠股骨节段性缺损模型来构建骨骼缺损，并将移植的支架材料植入缺损部位。放射学、组织学及生物化学分析结果表明，血管周围干细胞的分化可在体内显著促进骨形成。与其它传统干细胞来源相比，使用血管周围干细胞（PSCs）的主要优势在于，PSCs或称血管周围干细胞具有更高的群体均一性，从而提高了干细胞纯度，增强了营养因子的分泌，并可能进一步促进骨形成。首先，按照随附的手稿中所述方法构建支架。通过向支架中加入细胞悬液，为其植入做好准备。对于小鼠肌肉袋或颅骨缺损模型，在麻醉后使用每100 µL含250,000个细胞的密度。使用异氟烷和丁丙诺啡对六周龄的skid小鼠进行麻醉。在后肢进行标准的聚维酮碘消毒。接着，做一个两毫米长的纵向双侧切口，并用钝性分离法在股二头肌中切出四毫米深的口袋状切口。与肌纤维平行方向仅有少量出血。植入经PSCs移植的移植物。使用5-0 Vicryl缝线，以简单的连续缝合方式缝合覆盖于肌肉上的筋膜。接着，使用5-0 Vicryl缝线以皮下缝合方式关闭皮肤。术后给予动物布托啡诺治疗48小时，并给予三甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑（T-M-P-S-M-X）治疗10天。小鼠术后第1天应能自如行走。对一只12至14周龄的skid小鼠进行异氟烷麻醉。对颅骨区域进行标准的碘伏消毒准备。从小鼠颅骨矢状缝处开始，做一个8毫米长的皮肤切口。接下来，使用棉签轻轻去除颅骨骨膜，并用棉签吸去出血。现在，使用连接到高速牙科钻的金刚石涂层环钻钻头，制作一个4毫米的顶骨缺损。缺损应贯穿骨全层，但需格外小心，避免损伤下方的硬脑膜，以免干扰愈合过程。将植入物与PSCs移植材料轻柔地放置于缺损部位。最后，使用6-0 Vicryl缝线缝合皮肤。术后给予动物布托啡诺治疗48小时，并给予复方新诺明（T-M-P-S-M-X）治疗10天。首先，对一只已使用异氟烷麻醉的12至14周龄雄性大鼠的股骨进行刷洗和准备，采用标准的聚维碘酮消毒方案。在股骨前外侧区域做一道27至30毫米的纵向切口。接下来，通过分离股外侧肌和股二头肌暴露股骨干，以避免大量出血。操作时需注意保护主要血管。为最大程度地保证骨再生的一致性，需彻底完成上述步骤。去除覆盖在股骨缺损区域及切除的股骨节段上的骨膜。注意避免损伤股神经，以防造成神经损伤。随后将一块聚乙烯板放置于股骨前外侧表面。钢板上有六个预钻孔，用于容纳直径为 0.9 毫米的带螺纹克氏针。以钢板作为模板，通过钢板及两侧皮质骨钻入六根带螺纹克氏针。使用小型摆动锯片，制作一个 6 毫米的中段骨缺损。然后将PSC和移植支架植入缺损部位。使用4-0 Vicryl可吸收缝线缝合覆盖的肌肉和筋膜。为确保植入物固定到位，术后给予大鼠为期两天的镇痛处理，并在肌肉袋植入后四周内监测伤口裂开情况。在引入颅骨缺损后八周内，通过微计算机断层扫描（micro CT）和X射线（XR）分析观察到，随着PSC移植，骨体积和骨矿物质密度呈逐渐增加趋势；在无支架组中，由于缺损为临界尺寸，未观察到骨愈合；在有支架但无细胞组中，仅观察到约20%的轻微愈合，符合预期。在接种细胞的支架组中，可见缺损区域骨化程度逐渐增加。主要骨化发生在两周内。在引入股骨缺损后八周达到完全骨化。当缺损处使用BMP-2处理时，骨化逐渐增加，最早在四周时部分动物已观察到骨愈合，到八周时所有动物均实现愈合。相比之下，未使用支架、或使用无细胞或无重组蛋白的支架时，均未观察到骨愈合现象。观看本视频后，您应能充分了解如何分离血管旁干细胞，如何将分离所得的血管旁干细胞与PLGA成骨诱导支架联合使用，以及最终如何将此类支架与细胞复合产品用于三种不同的组织工程技术。在尝试按本视频所述方法执行各项操作时，需牢记若干关键要点。首先，在颅骨缺损模型中，必须精确保护硬脑膜，以确保实现正常的愈合过程。其次，对于大鼠股骨节段性缺损模型，重要的是尽量减少对周围神经和血管的损伤。一旦掌握本文所述的特定手术技术，预计每次肌肉袋植入操作约需20分钟完成，而每次颅骨缺损和股骨节段性缺损的规范操作可能需要长达30分钟。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

人类血管周围干细胞用于骨再生

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本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

我们提出了一种研究维生素C和1,25-二羟基维生素D[1,25-(OH)2D3]诱导的骨膜来源细胞（PDCs）中mRNA表达生物标志物的实验方案。此外，我们评估了PDCs向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。...

从人牙槽骨膜中分离间充质干细胞及维生素D对骨膜来源细胞成骨活性的影响

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

了解人类血管周围干细胞（PSC）在骨再生中的应用，学习从脂肪组织分离PSC并结合定制支架促进体内骨形成的方法。该视频展示异位和原位骨分化模型的实验技术，为干细胞生物学和组织工程研究提供重要参考。

使用人血管周围干细胞进行骨再生

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