RNA病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

RNA病毒利用病毒编码的RNA聚合酶复制其基因组。这些聚合酶具有内在较高的错误率，使病毒能够快速适应并进化。本视频介绍了一种优化的方法，用于筛选和鉴定其RNA聚合酶发生突变且影响复制过程中错误率或保真度的病毒。

首先将诱变剂施加于病毒宿主细胞，以确定在不杀死细胞或抑制病毒的前提下可使用的诱变剂最高浓度。在确定最佳条件后，在RNA诱变剂的选择性压力下对病毒进行传代。随后对获得的诱变剂抗性病毒群体进行测序，以鉴定导致抗性的突变位点。

接下来，分离出对诱变剂具有抗性的突变体。监测其复制动力学，结果显示聚合酶保真度的升高或降低，同时伴随着对RNA诱变剂的广泛抗性以及病毒群体突变频率的改变。

与使用纯化聚合酶的传统生化保真度方法相比，该技术的主要优势在于其适用于任何能够在组织培养中增殖的RNA病毒。该方法有助于回答病毒学领域的关键问题，例如聚合酶保真度在病毒适应与进化过程中的作用。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，原因是他们所采用的选择压力过强或过弱，且针对目标区域的测序样本量以及克隆数量尚未经过优化以达到足够的统计学效力。

开始实验前，需确定在后续实验中可使用的诱变剂浓度范围，以避免导致细胞死亡。吸出含有亚融合胆管细胞单层的六孔板中的培养基，然后每孔加入2毫升添加了诱变剂的培养基，所用的诱变剂包括利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷、氯化镁和氯化锰。

将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。随后在接下来的2至7天内，每隔24小时取一孔细胞，通过台盼蓝排斥法检测细胞活力。使用血细胞计数板，计算每种诱变剂浓度下的活细胞百分比，包括未处理对照组条件，以感染终点时细胞死亡率低于50%为准。

当达到最高滴度时，接下来的步骤是确定诱变剂的浓度，该浓度应施加适当的选择压力，既能有效筛选又不会在适宜浓度下对群体造成过度诱变。每个基因组至少在一个或两个位点发生突变。因此，诱变剂将产生抗性突变，随后在传代过程中被筛选出来。

如果引入过多的突变，携带抗性突变的突变体本身将具有致死性。诱变剂会阻碍在六孔板中分离这些突变体，六孔板中接种了我们的细胞，并加入两毫升含诱变剂的培养基，所用浓度范围与之前相同，但排除导致超过50%细胞死亡的浓度。

孵育两小时，使诱变剂充分进入细胞。吸除培养基后，在200 µL中以较低感染复数接种病毒，孵育15至60分钟，使病毒侵染细胞，期间定期轻轻摇动培养板，确保接种物均匀覆盖细胞。吸除接种的病毒液，用2 mL PBS洗涤两次，尽可能去除残留的接种物。

然后向每孔加入含诱变剂的培养基，将细胞孵育相当于三至六个复制周期的时间，通常为两到七天。从每孔收集病毒，进行标准蚀斑实验或有限稀释法，根据计算出的滴度确定诱变剂对病毒滴度的抗病毒效应。确定与未处理对照感染相比，可使病毒滴度降低0.5至2个对数级且对细胞无明显毒性的诱变剂浓度。

理想情况下，为了分离出对诱变剂具有抗性的病毒变异株，首先在HeLa细胞中使用每种诱变剂的最佳浓度传代病毒。在每次传代过程中，可能需要重复进行多达30次的病毒传代操作：每次均需测定病毒滴度，并如图所示重复进行病毒感染及在诱变剂存在下的孵育。经诱变剂处理的样品，其病毒滴度在最初几次传代中应较原始病毒滴度和未处理对照组的病毒滴度有所下降。一旦某一系列病毒的滴度恢复至与未处理对照组相当的水平，则提示该病毒可能已产生抗性。

使用能够扩增目标病毒聚合酶或复制基因的引物，通过测序提取病毒RNA。利用逆转录PCR（R-T-P-C-R）生成病毒基因组的cDNA，然后对DNA进行测序。获得序列信息后。

使用比对软件将获得的序列与参考共识序列进行比对，并鉴定新出现的点突变。此外，检查色谱图中可能被比对软件遗漏的低比例峰；当突变体占总群体的20%至30%时，仍会表现为一个峰，但峰高过小，标准序列分析难以将其识别为混合核苷酸。为鉴定目标突变，需寻找仅在诱变处理群体中出现、而在相同传代次数的未处理对照群体中不存在的单核苷酸多态性，如图中所示。一旦鉴定到突变，必须从具有感染性的cDNA中重新构建耐药变异体，或通过组织培养分离该变异体，并确认其耐药表型。

在此，我们通过噬斑测定法分离已鉴定的突变体。将耐氮样品进行系列稀释，然后加入六孔板中的细胞单层，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时后进行噬斑测定。感染后2至5天加入琼脂糖覆盖层。

噬菌斑应清晰可见。理想情况下，其中一个平板应产生10至50个分离良好的噬菌斑。使用记号笔在平板上标记噬菌斑的位置，注意不要移动或错位覆盖层，然后轻轻将P200滤芯吸头穿过琼脂覆盖层。

为获取病毒斑块，请小心地将枪头从覆盖层中提起，并将琼脂糖凝胶小块转移至含有250 µL培养基的微量离心管中。无论是否将琼脂糖凝胶小块从枪头释放，通过涡旋混匀该管，均可获得足量病毒用于后续十倍稀释处理。保留部分样品，以便后续扩增活病毒。

然后从样品的剩余部分提取RNA，并进行逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），以鉴定含有目标突变的斑块样品。对cDNA进行测序，确保不存在其他额外的突变。

然后为此病毒制备更大规模的储备液，用于所有后续研究。接下来验证所鉴定出的突变赋予的抗性。在多种诱变条件下重复进行诱变实验。

如果该突变体对多种诱变剂具有抗性，则其保真度可能有所提高。由于影响保真度的突变位于聚合酶基因上，因此重要的是要确认复制动力学未发生显著改变。在测定突变频率之前，应通过至少两种互补的方法来检测复制情况。

例如，可在检测RNA合成的方法（如定量RT-PCR或Northern印迹）之外， дополнительно采用检测病毒产量的方法（如空斑试验或TCID50）。接下来，为验证所鉴定的聚合酶突变是否通过改变复制保真度而导致对诱变剂产生耐药性，需测定突变频率。该测定可在具有感染性的病毒群体或总病毒群体中进行。

为了确定包含可存活和不可存活变异株在内的整个病毒群体的突变频率，需提取RNA，并通过反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）扩增编码序列中已知存在遗传变异的800至1,200个核苷酸的区域，例如编码结构蛋白的区域。接着，对每个待研究的病毒群体，将其纯化后的扩增产物进行拓扑TA克隆。通过在Xga涂布平板上进行蓝白斑筛选，挑选出96个鉴定为含有阳性插入片段的菌落。

通过单菌落PCR验证蓝白斑筛选的有效性。根据上述片段大小和反应条件，约90%的菌落应为阳性。对于每个阳性的白色菌落，使用牙签将菌落转移至96孔板中的1毫升LB培养基中。

细菌培养皿在37摄氏度下振荡培养过夜。第二天，以96孔板格式进行质粒小提并制备DNA，对每块板使用足量引物进行测序，以获得克隆片段的最大覆盖度。

两个引物覆盖600个碱基应已足够。使用每个群体的参考序列或共识序列，以及能够快速识别单核苷酸多态性的适当比对软件进行序列分析。可向DNA star laser申请man软件。

首先使用基因序列剔除质量较差的序列，例如碱基识别错误过多或长度过短的序列。对剩余序列进行比对，并确定在分析中所有序列共同覆盖的核苷酸范围。

弃除在此区域未被完全覆盖的克隆。出于比较目的，必须确保同一区域被完全覆盖。鉴定并统计与参考菌株不同的单核苷酸多态性位点。

通过将单核苷酸多态性总数除以测序的核苷酸总数来计算突变频率。将该数值表示为每测序10,000个核苷酸的平均突变数。如果同一单核苷酸多态性在大量克隆中出现，请提供两个数值，分别包含或排除这些重复突变。

确定突变分布。列出每个群体中携带 0、1、2、3 等突变数的克隆数量的排序列表。可选择对测序区域中的突变进行分析。

利用编辑后的序列计算样本内所有可能的成对比较，以获得群体多样性的平均值。此处可使用多种比对程序。分子进化遗传学分析程序（也称为 mega）用于确定筛选 RNA 诱变抗性愈合的最优条件。

我们的细胞经不同浓度的利巴韦林处理后，以0.01的感染复数接种野生型Coxsackie AKI B病毒，感染后48小时收获子代病毒，并通过TCID50测定病毒滴度。该图显示了感染后48小时通过台盼蓝染色法测定的位于x轴下方的细胞存活率百分比。

结果显示，100 和 200 微摩尔浓度可在不影响细胞活力的情况下，使病毒滴度降低一到两个数量级。为了筛选出对诱变剂具有抗性的病毒群体，将 CHIKV 病毒在存在（灰色柱）或不存在（黑色柱）50 微摩尔利巴韦林的条件下，在 Huh-7 细胞中连续传代，每次传代后，通过 BHK 细胞上的经典蚀斑实验对子代病毒进行定量，结果如图所示。在最初的传代过程中，诱变效应尤为明显，经处理的病毒滴度下降了两个数量级。

逐渐地，滴度恢复至未经处理的正常水平。与未经处理组相比，在五种诱变剂处理的种群中未观察到显著差异，表明已筛选出耐药变异株。事实上，测序结果鉴定出在利巴韦林处理过程中病毒种群中出现的独特突变。为确认对不同结构RNA诱变剂的广泛耐药性，将最初在筛选中分离得到的高保真COA病毒B3的A372V变异株，检测其对不同浓度RNA诱变剂利巴韦林、5-氟尿嘧啶和5-氮杂胞苷的敏感性降低情况。

在感染后48小时，将细胞用指定浓度的利巴韦林处理，并以0.01的感染复数感染野生型Cox AKI病毒B。收集子代病毒，并通过TCID50测定滴度。此处显示的是野生型和A372V突变株在不同诱变剂浓度下的滴度。A372V突变株的滴度 consistently 高于野生型。

在测定病毒产生单步生长动力学的所有测试条件下，我们以感染复数为10，分别用野生型高保真变体A372V或复制缺陷型变体CX64感染细胞，所用病毒为Coxsackievirus B3。在指定时间点，通过冻融法收集细胞及上清中的子代病毒，并采用TCID50法测定滴度。A372V的保真性提高并未伴随在组织培养中可观察到的复制缺陷。而变体CX64则表现出显著的复制动力学延迟，其达到的最高滴度比野生型病毒低1000倍。

通过本视频所述方法，每个测序获得的克隆均来源于病毒群体中一个独特的基因组，因此携带独特的突变。该图显示了在去除低质量序列后典型的比对结果，并展示了单核苷酸多态性。统计了病毒群体中全部的单核苷酸多态性，并记录了每个克隆中出现的单核苷酸多态性数量。

例如，由横线标出的克隆含有两个独特的突变，而另外八个克隆各含有一个独特的突变。这些数据可用于汇总生成如本表所示的表格。该表格展示了按突变数量对测序克隆进行排序后的分布情况。

对排序值进行统计学比较，可以确定一个分布是否与另一个分布存在显著差异。为了便于解释，可将序列分析和统计分析所得的数值数据以图表或直方图形式表示。如图所示，A372V病毒产生的突变少于野生型，其突变频率显著更低，P值小于0.01。

相同的鸡贫血病毒群体可产生相似的突变频率，无论使用病毒原液还是十的五次方倍稀释液进行RNA提取。因此，在完成本实验步骤后，您可能希望开展体外生化实验或结晶研究，以更深入地理解该聚合酶变异体在复制保真性方面的机制与结构基础。

随着这一进展，该技术为生物学领域的研究人员探索遗传多样性与病毒在体内的适应性之间的关联铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何提高分离RNA病毒保真度变异株的概率，以及如何利用突变频率来鉴定这些保真度差异。