Name: 富达的RNA病毒和病毒的突变频率的表征的变种的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 10 s
Description: 了解RNA病毒聚合酶保真度变异的分离与表征方法。本技术利用诱变剂筛选和测序分析，帮助研究人员识别影响复制错误率的关键突变，深入理解病毒进化机制。

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本工作获得了巴黎市医学与卫生研究基金、法国国家研究局基金（ANR-09-JCJC-0118-1）以及欧洲研究委员会启动基金RNAvirusPopDivNVax项目（编号242719）的资助。

<ol><li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+%28in%29fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li>
<li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li>
<li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase%3A+fidelity%2C+replication+speed%2C+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li>
<li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li>
<li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li>
<li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li>
<li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribavirin%27s+antiviral+mechanism+of+action%3A+lethal+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li>
<li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li>
<li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li>
<li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li>
<li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect%2C+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li>
<li>Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis%3A+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li>
<li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li>
<li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin%3A+implications+for+error+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

细胞系的选择。 碱基类似物作为RNA诱变剂的效果与其在不同细胞类型中的相对摄取量相关11。如果通常用于病毒传代的细胞系对诱变剂的摄取具有抗性或过于敏感（细胞毒性过高），则可能需要选用另一种能够满足这些要求且仍允许病毒复制的细胞系。一旦分离得到诱变剂抗性变异株，后续的表征工作可在原先首选的细胞系中进行。根据我们的经验，HeLa细胞能高效摄取诱变剂；BHK细胞需要高达10倍的浓度；而Vero细胞则对诱变剂的摄取具有抗性。
诱变剂的选择。 在尝试通过诱变处理分离保真度变异株时，若使用多种不同类型的诱变剂，成功概率会更高。结构不同的碱基类似物诱变剂在复制过程中会被错误地掺入基因组，并在后续复制周期中主要导致特定类型的突变：利巴韦林处理倾向于诱导G→A和C→U的转换突变12；5-氮杂胞苷具有类似的偏向性，此外还可引起C→G和G→C的颠换突变13；5-氟尿嘧啶则优先诱导A→G和U→C的转换突变14。另一种方法是在培养基中添加较高浓度的Mg2+或Mn2+，以提高RNA病毒的整体突变频率，且不具有上述偏向性12。根据病毒的密码子序列以及生成保真度变异株所需的密码子改变，某些条件将比其他条件更有利于该类变异株的出现。对于具有更高保真度的脊髓灰质炎病毒G64S和柯萨奇病毒A372V，利巴韦林处理最易筛选出这些变异株，因为其密码子位点所需的A→G转换突变恰好与利巴韦林主要诱导的突变类型一致。
感染复数与群体大小。 在病毒学中，组织培养感染的实验方案特别关注感染复数（MOI），例如，为避免缺陷型干扰颗粒的积累（低MOI）或促进病毒间的重组（高MOI）。为了在连续传代过程中筛选出新出现的突变事件，还必须考虑病毒群体的大小。由于耐药突变体最初频率较低，最好在每次传代时尽可能转移较大的病毒群体（例如105-106个病毒），以避免在每一轮传代中丢失这些新出现的变异株。如果担心MOI升高，可通过增大培养孔或培养瓶的规模（即增加被感染细胞的数量）来尽量减少MOI的上升。另一方面，在测试病毒对诱变剂敏感性的实验中，通常采用低MOI感染，以增加实验过程中发生的复制周期次数，并防止在共感染细胞中，高适应性基因组通过互补作用“拯救”被诱变的基因组。这一点非常重要，因为在第一轮复制过程中子代基因组上产生的突变并不会立即被检测到。大多数被诱变的RNA仍会被包装进病毒粒子中。只有在下一轮感染时，这些基因组中存在的致死突变才会导致复制周期中止，并引起病毒滴度下降。通常需要经过多轮突变积累后，才能观察到致死性诱变的显著效应。最后，如果在诱变剂存在下连续传代过程中，病毒滴度持续下降直至灭绝，研究人员应尝试在逐渐增加的诱变剂浓度下进行传代（从极低浓度开始）。
从RNA诱变剂抗性群体中分离并获得RNA诱变剂抗性克隆。 RNA诱变剂会在每个基因组中引入多个随机突变，但通过抗性筛选仅能富集（并固定到共识序列中）那些赋予抗性的突变。为了鉴定该突变，我们对诱变剂抗性群体进行测序（即群体的共识序列），而非对单个病毒进行测序。因此，由诱变剂产生的单个随机突变在测序结果中不会被检测到；只有在筛选后导致共识序列发生变化的突变才会被发现。根据我们的经验，通常仅能识别出一到两个此类共识序列变化。一旦获得诱变剂抗性群体并确定了抗性突变，就有必要制备该变异株更纯的毒种。上文已描述了空斑纯化方法。或者，如果目标病毒不能形成易于识别的空斑，则可通过有限稀释法纯化所需变异株。该方法本质上是以96孔板格式进行的TCID50实验，即将病毒原液稀释至感染率低于50%的浓度。采用此稀释度后，参照上述方法，可分离最多10个独立的变异株，并确认其序列。如前所述，在理想情况下，目标病毒株的感染性cDNA克隆是可获得的，此时便无需进行病毒分离。根据我们的经验，复制保真性变异株通常由单个氨基酸替换引起，因此可使用商业化定点突变试剂盒（如Quikchange，Agilent）直接构建。另一种选择是使用亲缘关系较近病毒株的cDNA克隆。然而，若使用近缘病毒株，我们强烈建议同时采用该方法和病毒分离法（例如空斑纯化），因为我们发现同一保真性相关突变在两种近缘病毒中未必产生相同的功能效应。
保真性与复制。 筛选对RNA诱变具有抗性的变异株已成功分离出保真性更高和更低的变异株，其生长特性与野生型对应株相似4,12,15。目前，聚合酶活性速率与保真性之间的关联尚未完全阐明。利用纯化的RNA聚合酶进行的体外生化研究表明，高保真性变异株的加工速率较慢，而低保真性变异株通常具有更快的加工速率1-3,12。在组织培养中，这些差异通常并不明显，提示资源的可利用性而非聚合酶固有的动力学特性是限速步骤。如果保真性变异株的复制动力学与野生型无显著差异，则可直接比较它们的突变频率。若复制动力学存在极为显著的差异，则应对数据进行归一化处理以校正动力学差异，例如通过比较经历相同复制周期数的病毒。根据我们的经验，尽管野生型与高保真性变异株之间在单步生长动力学上未观察到显著差异，但我们发现高保真性变异株的滴度 consistently 更高（在1个数量级内），而其产生的RNA量略少（处于同一数量级），这进一步表明它们产生的基因组含有较少突变，因而具有更强的感染性。
样品制备与测序。 在这些实验方案的所有步骤中，必须使用高保真、具有校读功能的酶进行 PCR 和 RT-PCR，以尽量减少引入额外突变，因为这些人为突变无法与生物学上有意义的突变相区分。待比较的病毒群体必须在相同条件下制备（传代历史、组织培养基、温度、RNA 提取方法、RT-PCR 方案等）。此外，必须确保 RNA 提取获得了足够的起始材料，以便 RT-PCR 能产生清晰的条带。RNA 样品进行 1/100 稀释后也应能检测到 RT-PCR 条带，这表明样品中含有足够数量的 RNA 分子，可避免代表性偏差（即反复扩增同一基因组）。由于突变频率呈分布状态，只要不存在上述偏差，无论群体规模如何，都应获得相似的数值。如图 6 所示，病毒储备液进行 105 倍稀释后所得的突变频率与亲本储备液相比无显著差异。
在确定TopoTA克隆的最佳条件之前，应在蓝白斑筛选后通过菌落PCR确认插入片段的存在，然后再进行测序。为了控制突变噪声（由RT-PCR和测序引入的突变），可克隆含有相同病毒序列的质粒的PCR产物，和/或克隆并测序对应于病毒基因组的体外转录RNA的RT-PCR产物作为对照（需注意不同的体外转录酶具有不同的错误率，可能无法真实反映实验流程中的本底错误水平）。某些病毒序列可能对细菌具有毒性，因此在决定用于突变频率分析的病毒基因组区域之前，必须验证其对细菌的影响。在分析TopoTA获得的序列时，应注意每个克隆应仅包含一个插入片段/序列。若出现双峰信号，提示可能存在混合群体，其原因可能是挑选了两个相邻的细菌菌落。尽管细菌复制过程中的突变频率极低，但也不能完全排除突变是在细菌培养中质粒扩增过程中引入的可能性。在噬斑纯化的群体中，双峰可能源于重叠的噬斑，或病毒在噬斑形成过程中正在获得新突变或发生突变回逆。在分析时应保持一致性，并事先决定是否将此类突变纳入统计。
最后，请注意此处使用的突变频率为相对值。这些数值仅在比较相同条件下培养并在相同区域测序的病毒群体时有效！不应将其视为突变率的绝对值，或整个基因组的突变频率。然而，在实验条件受控的情况下，这些数值确实能够实现对突变分布和频率差异的可重复、定量比较。

<table><tbody><tr><td>利巴韦林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9644-10MG</td><td></td></tr><tr><td>5-氟尿嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6627-1G</td><td></td></tr><tr><td>5-氮杂胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>10351021</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange 定点突变试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>200516</td><td>若已有cDNA感染性克隆</td></tr><tr><td>96孔质粒小提试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740625</td><td></td></tr><tr><td>Lasergene、Sequencher</td><td>DNASTAR</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.dnastar.com">www.dnastar.com&lt;/a&gt; &lt;a href=&quot;http://www.genecodes.com">www.genecodes.com&lt;/a&gt;</td><td>或其他序列比对软件</td></tr></tbody></table>

rna病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA病毒利用依赖RNA的RNA聚合酶复制其基因组。这些酶固有的高错误率是产生极高种群多样性的主要原因之一，从而促进病毒的适应与进化。越来越多的证据表明，通过病毒聚合酶中细微的氨基酸改变，可以调节RNA病毒的内在错误率及其相应的突变频率。尽管已有部分病毒RNA聚合酶的生化检测方法可用于定量测定其保真度，但本文描述了一种测量RNA病毒突变频率的简单方法，该方法在识别影响保真度的突变方面已被证明与生化方法同样准确。该方法采用常规的病毒学和测序技术，可在大多数生物学实验室中完成。根据我们对多种不同病毒的研究经验，我们确定了若干关键步骤，需对其进行优化，以提高分离出保真度变异体的可能性，并获得具有统计学意义的数据。分离和表征影响保真度的突变可为聚合酶的结构与功能提供新的见解1-3。此外，这些保真度变异体还可作为有力工具，用于研究病毒适应与进化机制4-7。

本文描述了分离和鉴定RNA病毒RNA聚合酶保真性变异体所需的步骤，以及如何利用突变频率数据在组织培养中确认保真性的改变。

RNA病毒保真性变异体的分离及病毒突变频率的表征

RNA病毒利用依赖RNA的RNA聚合酶复制其基因组。这些酶固有的高错误率是病毒...

RNA病毒利用病毒编码的RNA聚合酶复制其基因组。这些聚合酶具有内在较高的错误率，使病毒能够快速适应并进化。本视频介绍了一种优化的方法，用于筛选和鉴定其RNA聚合酶发生突变且影响复制过程中错误率或保真度的病毒。首先将诱变剂施加于病毒宿主细胞，以确定在不杀死细胞或抑制病毒的前提下可使用的诱变剂最高浓度。在确定最佳条件后，在RNA诱变剂的选择性压力下对病毒进行传代。随后对获得的诱变剂抗性病毒群体进行测序，以鉴定导致抗性的突变位点。接下来，分离出对诱变剂具有抗性的突变体。监测其复制动力学，结果显示聚合酶保真度的升高或降低，同时伴随着对RNA诱变剂的广泛抗性以及病毒群体突变频率的改变。与使用纯化聚合酶的传统生化保真度方法相比，该技术的主要优势在于其适用于任何能够在组织培养中增殖的RNA病毒。该方法有助于回答病毒学领域的关键问题，例如聚合酶保真度在病毒适应与进化过程中的作用。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，原因是他们所采用的选择压力过强或过弱，且针对目标区域的测序样本量以及克隆数量尚未经过优化以达到足够的统计学效力。开始实验前，需确定在后续实验中可使用的诱变剂浓度范围，以避免导致细胞死亡。吸出含有亚融合胆管细胞单层的六孔板中的培养基，然后每孔加入2毫升添加了诱变剂的培养基，所用的诱变剂包括利巴韦林、5-氟尿嘧啶、5-氮杂胞苷、氯化镁和氯化锰。将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。随后在接下来的2至7天内，每隔24小时取一孔细胞，通过台盼蓝排斥法检测细胞活力。使用血细胞计数板，计算每种诱变剂浓度下的活细胞百分比，包括未处理对照组条件，以感染终点时细胞死亡率低于50%为准。当达到最高滴度时，接下来的步骤是确定诱变剂的浓度，该浓度应施加适当的选择压力，既能有效筛选又不会在适宜浓度下对群体造成过度诱变。每个基因组至少在一个或两个位点发生突变。因此，诱变剂将产生抗性突变，随后在传代过程中被筛选出来。如果引入过多的突变，携带抗性突变的突变体本身将具有致死性。诱变剂会阻碍在六孔板中分离这些突变体，六孔板中接种了我们的细胞，并加入两毫升含诱变剂的培养基，所用浓度范围与之前相同，但排除导致超过50%细胞死亡的浓度。孵育两小时，使诱变剂充分进入细胞。吸除培养基后，在200 µL中以较低感染复数接种病毒，孵育15至60分钟，使病毒侵染细胞，期间定期轻轻摇动培养板，确保接种物均匀覆盖细胞。吸除接种的病毒液，用2 mL PBS洗涤两次，尽可能去除残留的接种物。然后向每孔加入含诱变剂的培养基，将细胞孵育相当于三至六个复制周期的时间，通常为两到七天。从每孔收集病毒，进行标准蚀斑实验或有限稀释法，根据计算出的滴度确定诱变剂对病毒滴度的抗病毒效应。确定与未处理对照感染相比，可使病毒滴度降低0.5至2个对数级且对细胞无明显毒性的诱变剂浓度。理想情况下，为了分离出对诱变剂具有抗性的病毒变异株，首先在HeLa细胞中使用每种诱变剂的最佳浓度传代病毒。在每次传代过程中，可能需要重复进行多达30次的病毒传代操作：每次均需测定病毒滴度，并如图所示重复进行病毒感染及在诱变剂存在下的孵育。经诱变剂处理的样品，其病毒滴度在最初几次传代中应较原始病毒滴度和未处理对照组的病毒滴度有所下降。一旦某一系列病毒的滴度恢复至与未处理对照组相当的水平，则提示该病毒可能已产生抗性。使用能够扩增目标病毒聚合酶或复制基因的引物，通过测序提取病毒RNA。利用逆转录PCR（R-T-P-C-R）生成病毒基因组的cDNA，然后对DNA进行测序。获得序列信息后。使用比对软件将获得的序列与参考共识序列进行比对，并鉴定新出现的点突变。此外，检查色谱图中可能被比对软件遗漏的低比例峰；当突变体占总群体的20%至30%时，仍会表现为一个峰，但峰高过小，标准序列分析难以将其识别为混合核苷酸。为鉴定目标突变，需寻找仅在诱变处理群体中出现、而在相同传代次数的未处理对照群体中不存在的单核苷酸多态性，如图中所示。一旦鉴定到突变，必须从具有感染性的cDNA中重新构建耐药变异体，或通过组织培养分离该变异体，并确认其耐药表型。在此，我们通过噬斑测定法分离已鉴定的突变体。将耐氮样品进行系列稀释，然后加入六孔板中的细胞单层，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时后进行噬斑测定。感染后2至5天加入琼脂糖覆盖层。噬菌斑应清晰可见。理想情况下，其中一个平板应产生10至50个分离良好的噬菌斑。使用记号笔在平板上标记噬菌斑的位置，注意不要移动或错位覆盖层，然后轻轻将P200滤芯吸头穿过琼脂覆盖层。为获取病毒斑块，请小心地将枪头从覆盖层中提起，并将琼脂糖凝胶小块转移至含有250 µL培养基的微量离心管中。无论是否将琼脂糖凝胶小块从枪头释放，通过涡旋混匀该管，均可获得足量病毒用于后续十倍稀释处理。保留部分样品，以便后续扩增活病毒。然后从样品的剩余部分提取RNA，并进行逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），以鉴定含有目标突变的斑块样品。对cDNA进行测序，确保不存在其他额外的突变。然后为此病毒制备更大规模的储备液，用于所有后续研究。接下来验证所鉴定出的突变赋予的抗性。在多种诱变条件下重复进行诱变实验。如果该突变体对多种诱变剂具有抗性，则其保真度可能有所提高。由于影响保真度的突变位于聚合酶基因上，因此重要的是要确认复制动力学未发生显著改变。在测定突变频率之前，应通过至少两种互补的方法来检测复制情况。例如，可在检测RNA合成的方法（如定量RT-PCR或Northern印迹）之外， дополнительно采用检测病毒产量的方法（如空斑试验或TCID50）。接下来，为验证所鉴定的聚合酶突变是否通过改变复制保真度而导致对诱变剂产生耐药性，需测定突变频率。该测定可在具有感染性的病毒群体或总病毒群体中进行。为了确定包含可存活和不可存活变异株在内的整个病毒群体的突变频率，需提取RNA，并通过反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）扩增编码序列中已知存在遗传变异的800至1,200个核苷酸的区域，例如编码结构蛋白的区域。接着，对每个待研究的病毒群体，将其纯化后的扩增产物进行拓扑TA克隆。通过在Xga涂布平板上进行蓝白斑筛选，挑选出96个鉴定为含有阳性插入片段的菌落。通过单菌落PCR验证蓝白斑筛选的有效性。根据上述片段大小和反应条件，约90%的菌落应为阳性。对于每个阳性的白色菌落，使用牙签将菌落转移至96孔板中的1毫升LB培养基中。细菌培养皿在37摄氏度下振荡培养过夜。第二天，以96孔板格式进行质粒小提并制备DNA，对每块板使用足量引物进行测序，以获得克隆片段的最大覆盖度。两个引物覆盖600个碱基应已足够。使用每个群体的参考序列或共识序列，以及能够快速识别单核苷酸多态性的适当比对软件进行序列分析。可向DNA star laser申请man软件。首先使用基因序列剔除质量较差的序列，例如碱基识别错误过多或长度过短的序列。对剩余序列进行比对，并确定在分析中所有序列共同覆盖的核苷酸范围。弃除在此区域未被完全覆盖的克隆。出于比较目的，必须确保同一区域被完全覆盖。鉴定并统计与参考菌株不同的单核苷酸多态性位点。通过将单核苷酸多态性总数除以测序的核苷酸总数来计算突变频率。将该数值表示为每测序10,000个核苷酸的平均突变数。如果同一单核苷酸多态性在大量克隆中出现，请提供两个数值，分别包含或排除这些重复突变。确定突变分布。列出每个群体中携带 0、1、2、3 等突变数的克隆数量的排序列表。可选择对测序区域中的突变进行分析。利用编辑后的序列计算样本内所有可能的成对比较，以获得群体多样性的平均值。此处可使用多种比对程序。分子进化遗传学分析程序（也称为 mega）用于确定筛选 RNA 诱变抗性愈合的最优条件。我们的细胞经不同浓度的利巴韦林处理后，以0.01的感染复数接种野生型Coxsackie AKI B病毒，感染后48小时收获子代病毒，并通过TCID50测定病毒滴度。该图显示了感染后48小时通过台盼蓝染色法测定的位于x轴下方的细胞存活率百分比。结果显示，100 和 200 微摩尔浓度可在不影响细胞活力的情况下，使病毒滴度降低一到两个数量级。为了筛选出对诱变剂具有抗性的病毒群体，将 CHIKV 病毒在存在（灰色柱）或不存在（黑色柱）50 微摩尔利巴韦林的条件下，在 Huh-7 细胞中连续传代，每次传代后，通过 BHK 细胞上的经典蚀斑实验对子代病毒进行定量，结果如图所示。在最初的传代过程中，诱变效应尤为明显，经处理的病毒滴度下降了两个数量级。逐渐地，滴度恢复至未经处理的正常水平。与未经处理组相比，在五种诱变剂处理的种群中未观察到显著差异，表明已筛选出耐药变异株。事实上，测序结果鉴定出在利巴韦林处理过程中病毒种群中出现的独特突变。为确认对不同结构RNA诱变剂的广泛耐药性，将最初在筛选中分离得到的高保真COA病毒B3的A372V变异株，检测其对不同浓度RNA诱变剂利巴韦林、5-氟尿嘧啶和5-氮杂胞苷的敏感性降低情况。在感染后48小时，将细胞用指定浓度的利巴韦林处理，并以0.01的感染复数感染野生型Cox AKI病毒B。收集子代病毒，并通过TCID50测定滴度。此处显示的是野生型和A372V突变株在不同诱变剂浓度下的滴度。A372V突变株的滴度 consistently 高于野生型。在测定病毒产生单步生长动力学的所有测试条件下，我们以感染复数为10，分别用野生型高保真变体A372V或复制缺陷型变体CX64感染细胞，所用病毒为Coxsackievirus B3。在指定时间点，通过冻融法收集细胞及上清中的子代病毒，并采用TCID50法测定滴度。A372V的保真性提高并未伴随在组织培养中可观察到的复制缺陷。而变体CX64则表现出显著的复制动力学延迟，其达到的最高滴度比野生型病毒低1000倍。通过本视频所述方法，每个测序获得的克隆均来源于病毒群体中一个独特的基因组，因此携带独特的突变。该图显示了在去除低质量序列后典型的比对结果，并展示了单核苷酸多态性。统计了病毒群体中全部的单核苷酸多态性，并记录了每个克隆中出现的单核苷酸多态性数量。例如，由横线标出的克隆含有两个独特的突变，而另外八个克隆各含有一个独特的突变。这些数据可用于汇总生成如本表所示的表格。该表格展示了按突变数量对测序克隆进行排序后的分布情况。对排序值进行统计学比较，可以确定一个分布是否与另一个分布存在显著差异。为了便于解释，可将序列分析和统计分析所得的数值数据以图表或直方图形式表示。如图所示，A372V病毒产生的突变少于野生型，其突变频率显著更低，P值小于0.01。相同的鸡贫血病毒群体可产生相似的突变频率，无论使用病毒原液还是十的五次方倍稀释液进行RNA提取。因此，在完成本实验步骤后，您可能希望开展体外生化实验或结晶研究，以更深入地理解该聚合酶变异体在复制保真性方面的机制与结构基础。随着这一进展，该技术为生物学领域的研究人员探索遗传多样性与病毒在体内的适应性之间的关联铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何提高分离RNA病毒保真度变异株的概率，以及如何利用突变频率来鉴定这些保真度差异。

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