Name: 准备在微流体装置E18条块皮质大鼠神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习制备E18大鼠皮层神经元并加载至微流体装置的标准化流程。本方法采用胰蛋白酶消化组织分离细胞，通过台盼蓝染色评估细胞活力，确保获得高纯度轴突组分用于神经科学研究。

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为E18胎鼠皮层神经元的区室化培养做准备
开始实验前，务必将所有必需的培养基和试剂预热至 37°C。
同样重要的是&nbsp;对用于细胞制备的所有物品（如橡胶吸头、试管架、培养基瓶等）进行灭菌处理，以及后续使用的相关器具&nbsp;被放置&nbsp;在通风橱中&nbsp;用70%乙醇擦拭。
<ol>
<li>将两份E18胎鼠大脑皮层组织（来自一个先前已解剖的大脑）放入含有1 ml冰冻无钙无镁解离缓冲液的15 ml离心管中。</li>
<li>向含有皮层组织的解离缓冲液中加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使终体积达到2 ml，终浓度为0.125%胰蛋白酶。</li>
<li>将15 ml离心管置于37°C水浴中孵育8分钟。</li>
<li>在此期间，在生物安全柜中对3支玻璃巴斯德吸管进行火焰抛光，使其尖端开口依次变小，以保持无菌状态。</li>
<li>皮层组织孵育8分钟后，向其中加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，以终止胰蛋白酶反应。</li>
<li>将含有皮层组织和DMEM/10% FBS的15 ml离心管在2500 rpm条件下离心2分钟。</li>
<li>在生物安全柜中，使用连接真空负压装置的玻璃巴斯德吸管小心吸除上清液，注意不要扰动或移走沉淀物。</li>
<li>向皮层组织沉淀中加入1 ml NMB培养基，轻轻吹打混匀。吹打过程中必须避免产生气泡，因为气泡可通过&nbsp;氧化作用损伤细胞。</li>
<li>使用开口最宽的火焰抛光巴斯德吸管，将其末端连接无菌橡胶吹球，上下吹打5次以 triturate（机械解离）皮层组织，再次注意避免引入气泡。随后依次使用另外两支开口更小的玻璃吸管继续该过程&nbsp;。</li>
<li>完成解离后，再次以2500 rpm离心&nbsp;细胞2分钟。</li>
<li>离心结束后，再次小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于2 ml NBM培养基中。</li>
<li>将重悬的细胞悬液通过45 µm细胞滤网过滤。</li>
<li>用台盼蓝染色细胞，进行计数后加载至实验装置中。通常每装置加载20 µl细胞悬液。</li>
</ol>
注意：细胞的终浓度通常介于 250 万细胞/ml 至 800 万细胞/ml 之间
加样细胞
细胞计数完成后，即可将细胞加载到装置中：
<ol>
<li>将先前制备好的含有NBM的装置移入生物安全柜中，以保持无菌状态。 </li>
<li>用真空抽吸法去除孔中的过量培养基，但注意避免将所有培养基完全吸除——&nbsp;主通道中必须有一些培养基。 </li>
<li>将20 μl细胞加入装置的左上方储液池中（如有需要，请参见示意图）。细胞流入装置并附着于PLL处理的表面。 </li>
<li>加样后，将含有细胞的装置放回培养箱中孵育10分钟，以使细胞贴壁。 </li>
<li>10 分钟后，向储液槽中加入培养基，并将装置放回培养箱中。 </li>
</ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

细胞密度可根据具体应用进行调整。然而，原代神经元接种密度过低通常会导致细胞死亡。根据培养箱及湿度水平的不同，可能需要每2至3天更换一次装置中的培养基。更换培养基时，从储液池中移除培养基后，切勿从主通道中移除培养基。此外，建议先将新鲜培养基加入上方孔中，使部分新鲜培养基流经装置并进入主通道，然后再填满所有储液池，这是一种良好的操作实践。

<table><tbody><tr><td>NBM</td><td>培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>神经基础培养基（Neural Basal Media）由 Invitrogen 公司通过其 Gibco 细胞培养试剂系列提供。</td></tr><tr><td>E18 大鼠胚胎</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>来源于妊娠的 Sprague Dawley 大鼠。通过处死妊娠大鼠，解剖获取 E18 胎鼠大脑皮层组织。</td></tr><tr><td>CMFM 解剖缓冲液 HBSS</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>基于冰冻的无钙无镁 HBSS 解剖缓冲液。</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-70C 购得。</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#730;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>玻璃材质</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>培养基</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>血清，在 DMEM 中使用浓度为 10%</td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td><td>设定为 2500 rpm</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>用于活/死细胞计数</td></tr><tr><td>BD Falcon 细胞滤网 40 µm</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon cat# 352340</td><td>可通过 Fisher Scientific 购得，Fisher 目录号 08-771-1</td></tr><tr><td>B27</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 是 Invitrogen 公司 Gibco 细胞培养试剂系列中的一种专有添加剂。</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax 由 Invitrogen 公司通过其 Gibco 细胞培养试剂系列提供。</td></tr></tbody></table>

为微流控装置中的区室化培养准备e18大鼠皮层神经元

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

在本视频中，我们演示了E18大鼠皮层神经元的制备过程。E18大鼠皮层神经元来源于先前已解剖并准备好的E18胎鼠皮层组织。皮层组织在解剖后需立即解离为单个神经元。E18皮层组织可在含有B27的Hibernate E缓冲液中于4°C保存最多一周后再进行解离，但细胞活力会有所下降。通常情况下，我们使用新鲜获取的E18皮层组织。组织运输至实验室时，置于冰上预冷的无钙无镁解剖缓冲液（CMFM）中。到达后，向皮层组织中加入胰蛋白酶，使其终浓度为0.125%。随后将组织在37°C孵育8分钟。加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基以终止消化反应。将组织在2500 rpm下离心2分钟。弃去上清液，加入2 ml含2% B27（v/v）和0.25% Glutamax（v/v）的神经基础培养基（NBM），并通过反复吹打使沉淀重新悬浮。接下来，使用经火焰抛光的玻璃移液管对组织进行吹打解离，移液管口径依次减小。吹打完成后，再次以2500 rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀用2 ml含B27和Glutamax的NBM重新悬浮。细胞悬液随后通过40 µm尼龙细胞滤网过滤。接着对细胞进行计数。此时神经元已准备好用于接种至神经元微流控装置中。

在本视频中，我们演示了E18大鼠皮层神经元的制备方法。

为微流控装置中的区室化培养准备E18大鼠皮层神经元

在本视频中，我们演示了E18大鼠皮层神经元的制备。E18大鼠皮层神经元取自先前的E18胎鼠皮层……

您好，欢迎来到Newly John博士的实验室。在之前的视频中，我们展示了如何制备神经元装置，该装置可使研究人员将神经元的胞体与纯轴突组分分离开来。该装置采用软光刻技术制备，具体方法是将PDMS浇铸并固化在硅晶圆上，而该硅晶圆上已通过光刻技术预先制备好装置的设计结构。在本视频中，我们将演示如何制备Sprague Dawley大鼠E18皮层神经元，以及如何将神经元加载至神经元装置中。请允许我向您介绍Kiana Lee，她将负责今天的操作演示。开始操作前，务必将所有必需的培养基和试剂在水浴中预热至37摄氏度。您可以看到神经基础培养基、0.25%胰蛋白酶以及含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM。重要的是，确保所有将要放入超净台内用于细胞处理的物品均已灭菌，并用70%乙醇擦拭干净。首先，用70%乙醇擦拭组织培养罩。然后，用于放置试管的塑料架用乙醇喷洒消毒。接着，三重划线操作中使用的橡胶吸头用乙醇清洁。这一步应尽早进行，以确保有足够的时间使其充分干燥。接下来，将所需的试剂用乙醇擦拭后移入通风橱中。取两份之前已分离的E18胎鼠大脑皮层组织（代表一个脑组织），放入含有1 ml冰冷的无钙、无镁分离缓冲液的15 ml离心管中，向该离心管中的皮层组织加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使最终体积达到2 ml，最终胰蛋白酶浓度为0.125%。将加入胰蛋白酶后的含皮层组织的15 ml离心管置于37°C水浴中孵育8分钟，在此期间胎鼠皮层组织在胰蛋白酶中于37°C下进行孵育。将三支玻璃巴斯德吸管进行火焰抛光。将玻璃吸管的尖端置于火焰蓝色区域附近，轻轻接触火焰，并缓慢旋转，直至管口刚刚变为橙色。当其变为橙色时。务必持续旋转玻璃移液管，以防止其塌陷。注意玻璃移液管的开口依次变小。还需注意的是，开口不宜过小，否则可能导致细胞裂解。在皮质组织于37°C与胰蛋白酶孵育8分钟后，加入10 mL含有10% FBS的DMEM以终止胰蛋白酶反应。将含有皮质和含10% FBS的DMEM的15 ml离心管在2,500 RPM下离心2分钟。在生物安全柜中，使用连接玻璃移液管的真空抽吸装置去除皮质上方的上清液，注意不要扰动或移动沉淀物。向含有B27和谷氨酸的1 ml神经基础培养基中加入皮质沉淀，并轻轻吹打混匀。吹打过程中切勿产生气泡，因为气泡可通过氧化作用损伤细胞。接下来，使用火焰抛光的末端移液管（管口最宽）进行皮质组织的消化处理：将无菌橡胶吸头连接至移液管末端，上下吹打约五次。注意不要引入任何气泡。好的。该过程继续使用另外两根玻璃移液管进行，每根移液管的开口尺寸均有所减小。如前所述，在三重拉制过程中，确保不引入气泡非常重要。您还应注意到，此时已不再看到任何可见的组织块。持续振荡至在培养基中完全看不到皮层组织块为止，这一点非常重要。离心后，细胞再次以2,500 RPM转速离心两分钟。这大致是两块皮层组织离心后所预期得到的沉淀物大小。离心后，再次从细胞沉淀中移除上清液。去除上清液后，向皮层组织中加入1 ml含有B27和谷氨酸的Neurobasal培养基，用于重悬皮层组织。再次小心地用移液器将细胞沉淀上下吹打，避免产生气泡，并确保细胞沉淀均匀分散并完全解离。向细胞悬液中再加入1 mL神经基础培养基，使最终体积达到2 mL。接着，将重悬的细胞溶液通过BD生物科学公司的40微米细胞滤网过滤，随后进行细胞计数和活力检测。将60微升新鲜的神经基础培养基加入无菌的微量离心管中。然后将20微升细胞加入60微升神经基础培养基中，最后向神经基础培养基中的细胞加入20微升台盼蓝。台盼蓝将对细胞进行染色，染色后可标记出已失去活性的细胞。我们将20微升样品用移液器滴加到血细胞计数板上，并在显微镜下观察。活细胞呈透明和半透明状，而细胞膜被刺穿的细胞由于台盼蓝染色而呈蓝色。通常情况下，每 cortex 可获得约250万个细胞和800万个细胞。我们通常从一个大脑中获取两份皮层组织，将细胞重悬于最终体积为2 mL的溶液中。因此，细胞的最终浓度通常介于每毫升250万个至800万个细胞之间。一般情况下，每个装置我们加载约20微升细胞悬液。这使得每个装置的细胞数量在 50,000 个细胞到 160,000 个细胞之间。细胞密度可根据具体应用进行调整。然而，在密度过低的情况下接种原代神经元通常会导致细胞死亡。预先准备并含有神经基础培养基的装置被移至生物安全柜中以维持无菌状态。使用真空装置移除孔中的过量培养基。但需注意，不可将所有培养基完全移除。仅从储液池中吸取培养基，主通道中必须保留部分培养基。仅将 20 微升细胞加入装置左上方的储液池中。细胞流入装置并附着在经 PLL 处理的表面。此处可见细胞流经主通道，您将开始看到部分细胞实际附着在玻璃表面。加载后，含有细胞的装置会被放回培养箱中，静置约10分钟，以使细胞充分贴壁。在培养箱中孵育10分钟后，将装置再次移入生物安全柜中，向储液池中加入培养基，随后将装置重新放回培养箱。需要注意的是，根据培养箱条件以及培养基对湿度的要求，可能需要每两到三天更换一次装置中的培养基。建议先将新鲜培养基加入上方小孔中，并让部分新鲜培养基流经装置并进入主通道，然后再填充所有储液池。此处神经元通过钙离子染料进行可视化，该染料可穿透活细胞并对其染色。在此可以看到装置的胞体侧或细胞侧，其中包含细胞体、轴突和树突。当我们平移观察该装置时，可以看到轴突穿过微沟结构到达装置另一侧，即轴突侧，该区域含有纯轴突组分。为演示目的，这些荧光标记的细胞将用于说明轴突切断（axotomy）操作过程。神经元装置的一个特性是允许研究人员进行轴突切除术，即从装置的纯轴突部分切断轴突，以便开展诸如轴突再生研究等实验。接下来，Keano 将演示如何在神经元装置中进行轴突切除术，该操作通过负压完成。将无菌玻璃移液管置于小室轴突侧底部的开口处，通过真空抽吸去除培养基。完全移除装置轴突侧的所有培养基，包括主通道中的培养基。在移除培养基后若需重复此操作，可将移液管尖端置于主通道的开口处，用力按压移液管，将 150 µL 培养基注入主通道。接下来，对主通道的开口以及装置轴突侧顶部孔的开口施加真空。再次使用真空将轴突侧（包括主通道）的所有培养基完全移除。随后，将移液枪头置于主通道的开口处，用力按压移液器，将 150 微升培养基注入主通道。此时，研究人员可在显微镜下观察装置，以检查轴突切割的效率。如果轴突切割不充分，可根据需要重复该过程。在本视频中，我们已向您展示了如何制备 E 18 胎鼠大脑皮层神经元，并将其加载到神经元装置中。这些装置的主要优势在于能够将神经元胞体的培养与装置另一侧的纯轴突组分分离开并分隔培养。希望本视频对您有所启发和帮助。以上就是John实验室的全部内容。感谢观看。

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生物学

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