准备在微流体装置E18条块皮质大鼠神经元
October 1st, 2007
在这个视频中，我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。
您好，欢迎来到 Dr.Newly John 的实验室。在之前的视频中，我们演示了如何制造神经元设备，该平台允许研究人员将神经元的细胞体与纯轴突部分分离。软光刻是用于制造器件的技术，包括将 PDMS 铸造和固化到硅晶片上，该硅晶片包含以前使用光刻制造的器件设计。
在本视频中，我们将演示 spro dolly E 18 皮质大鼠神经元的制备，以及如何将神经元加载到神经元装置中。我想向您介绍 Kiana Lee。她今天将进行演示。
在开始之前，请务必将所有必要的培养基和试剂在水浴中加热至 37 度。您可以看到神经基础培养基 0.25% 胰蛋白酶和含有 10% FBS 的 DMEM。重要的是要确保放置在通风橱中用于修复细胞的所有物品都经过消毒并用 70% 乙醇擦拭。
首先，用 70% 乙醇擦拭组织培养罩。接下来，用乙醇喷洒用于固定试管的塑料架。接下来，三条纹工艺中使用的橡胶球用乙醇清洗。
尽早这样做很重要，这样它才有足够的时间干燥。接下来，用乙醇擦拭必要的试剂并移至通风橱。将代表先前解剖的一个大脑的两块 E 18 胎鼠皮层置于含有 1 ml 冰冷、无钙、无镁解剖缓冲液的 15 ml 管中，将 1 ml 0.25% tripsin EDTA 添加到解剖缓冲液中的皮层中，使最终体积达到两个研磨机，最终尝试蛋白浓度为 0.125%然后放置含有皮层的 15 ml 管，现在添加了胰蛋白酶在 37 度的水浴中浸泡 8 分钟，同时胎儿皮层在 37 度的胰蛋白酶中孵育。
三个糊状移液器经过火焰抛光。将玻璃移液器的尖端放在火焰蓝色部分附近的火焰上，然后缓慢旋转，直到开口变为橙色。当它变成橙色时。
请务必不断旋转玻璃移液器，使其不会塌陷。请注意，玻璃移液器的开口逐渐变小。同样重要的是要注意，您不想让开口太小，因为这会导致细胞裂解，在皮层与 37 度下孵育 8 分钟后，将 10 ml 含有 10% FBS 的 DMEM 添加到皮层中以帮助终止胰蛋白酶反应。
将含有皮质和 DMEM 10% FBS 的 15 ml 试管以 2， 500 RPM 离心 2 分钟。在生物安全柜中，使用连接到玻璃移液管的真空抽吸从皮层中取出上清液。小心不要干扰或移开颗粒。
将 1 ml 含有 B 27 和谷氨酸的神经基础培养基加入皮层沉淀中，并轻轻上下移液。上下移液时不要产生气泡非常重要，因为气泡会通过氧化损坏细胞。接下来，火抛光后移液器具有最宽的开口，用于将无菌橡胶球连接到移液器末端并上下移液大约五次，从而对皮层进行三角化。
小心不要引入任何气泡。好。该过程对其他两个玻璃移液器继续进行，每个移液器的开口尺寸都减小了。如前所述，确保在三条纹过程中不会引入气泡非常重要。
您还应该注意到，您不再看到任何可见的块。保持 tri rating 很重要，直到您在媒体中无法再看到皮层的任何块。浸润后，再次将细胞以 2， 500 RPM 离心熔合 2 分钟。
这大约是人们期望从两块皮层中获得的颗粒的大致大小。离心后，再次从细胞沉淀中去除 sup natin。去除超级甩素后，向皮层中加入 1 ml 含有 B 27 和谷氨酸的神经基础培养基，用于复苏悬浮皮层。
再次小心地上下移液细胞沉淀，以避免添加气泡并确保细胞沉淀均匀分布和破碎。向细胞悬液中再添加 1 mil 神经基础培养基，使最终体积达到 2 mil。接下来，通过 BD biosciences 40 微米细胞过滤器过滤重悬的细胞溶液，然后对细胞进行计数并评估活力。
将 60 μL 新鲜神经基础培养基放入无菌微量离心管中。然后将 20 μL 细胞添加到 60 μL 神经基础培养基中，最后，将 20 μL Trian Blue 加入神经基础培养基中的细胞中。trian blue 将对细胞用 trian blue 染色后不再存活的细胞进行染色。
我们将 20 微升移液到血细胞仪上，并在显微镜下观察它们。活细胞看起来透明且半透明，而由于三分蓝，细胞膜被刺破的细胞呈蓝色。通常，我们每个皮层获得大约 250 万个细胞和 800 万个细胞。
我们通常从一个大脑获得两块皮层，细胞以 2 mil 的最终体积重悬。因此，细胞的最终浓度通常在 250 万个细胞/密耳到 800 万个细胞/密耳之间。通常，我们每台设备加载约 20 微升细胞。
这为我们提供了每个设备的单元范围，介于 50， 000 个单元和 160， 000 个单元之间。细胞密度可根据应用而变化。然而，以过低的密度接种原代神经元通常会导致细胞死亡先前制备的含有神经基础培养基的设备被带入生物安全柜以保持无菌。
通过真空切片去除孔中多余的介质。但是，必须小心不要删除所有媒体。主通道中必须有一些介质，只能从储液器中吸出介质。
仅将 20 μL 细胞施加到设备左上角的储液器中。细胞流入器件并附着在 PLL 处理的表面上。在这里，你可以看到细胞流经主通道，并且你会开始看到其中一些细胞实际上附着在玻璃上。
上样后，将含有细胞的设备放回培养箱中约 10 分钟，让细胞附着。在培养箱中放置 10 分钟后，将设备再次带入生物安全柜，储液槽中装满培养基，然后将设备放回培养箱中。根据培养箱和培养基所需的湿度水平，可能需要每两到三天更换一次设备中的一些重要事项。
最好将新鲜培养基放在顶部孔中，并在填充所有储液槽之前让一些新鲜培养基流经装置并进入主通道。神经元在这里用钙可视化，钙是一种细胞渗透染料，可以染色活细胞。在这里，您可以看到包含细胞体、轴突和树突的装置的 so 隔室或细胞侧。
当我们平移设备时，您可以看到轴突生长到设备的另一侧，即轴突侧，其中包含纯轴突部分。用于演示目的。这些荧光标记的细胞将用于说明 ax 耳切手术。
神经元装置的特性之一是它允许研究人员进行验血，即从装置的纯轴突部分切割轴突。为了进行研究，例如研究轴突再生。Keano 现在将演示如何在神经元设备中进行 ex otomy，ex otomy 由真空进行。
将无菌玻璃移液器放置在轴突侧孔的底部开口处，通过真空吸出培养基。所有媒体都从设备的轴突侧完全移除，包括主通道中的媒体。为了在去除培养基后重复该过程，通过将移液器的尖端放在主通道的开口处并用力按下移液器，将 150 μL 培养基压入主通道。
接下来，将真空施加到主通道的开口和装置轴突侧的顶部孔。真空再次用于去除轴突侧的所有介质，包括主通道。通过将移液器的尖端放在主通道的开口处并用力压下移液器，再次将 150 μL 介质压入主通道。
此时，研究人员可以在显微镜下观察该设备，以检查轴突切割的效率。如果轴突没有被充分切割，那么可以根据需要再次重复该过程。在本视频中，我们向您展示了如何制备 E 18 胎架皮质神经元并将其加载到神经元装置中。
这些设备的主要优点是能够将设备一侧的神经元细胞体培养与设备另一侧的纯轴突部分分开和分隔。我们希望您发现此视频内容丰富且有所帮助。这就是 John Lab 的内容。
感谢观看。
概述
此视频演示了E18大鼠皮层神经元的制备，详细说明了确保成功分离神经元并将其装入神经元设备中的必要步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生物学技术
背景
- 神经元的分离对于各种研究应用至关重要。
- 软光刻术用于制造神经元分离设备。
- 适当的消毒和试剂的准备对于细胞活力至关重要。
- 胰蛋白酶用于分离皮层组织以提取神经元。
研究目的
- 演示E18大鼠皮层神经元的逐步制备。
- 确保研究人员能够有效地将神经元装入专门的设备中。
- 强调在整个过程中保持无菌的重要性。
使用的方法
- 制备解剖缓冲液和胰蛋白酶溶液。
- 在胰蛋白酶中孵育皮层组织以进行细胞分离。
- 使用火焰抛光的移液管谨慎处理细胞。
- 使用特拉青染色进行细胞计数和活力评估。
主要结果
- 每个皮层成功分离约2.5到8百万个细胞。
- 使用特拉青染色区分活细胞和非活细胞。
- 细胞被有效地装入设备中进行进一步实验。
- 保持适当的细胞密度对实验成功至关重要。
结论
- 该协议提供了一种准备皮层神经元的可靠方法。
- 在制备过程中注意细节可提高细胞活力。
- 该技术对于推进神经科学研究至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preparing primary cortical neurons for microfluidic compartmentalization enables precise separation of somatodendritic and axonal compartments, supporting mechanistic studies of axonal transport, degeneration, and regeneration. This approach enhances predictive confidence in target validation by isolating axon-specific responses from somatic influences, reducing confounding variables in early discovery. The method supports de-risking of neurodegenerative and neurodevelopmental targets through reproducible, quantitative axonal readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axon-autonomous mechanisms by isolating pure axonal fractions from cell bodies.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation studies through compartment-specific readouts.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on axonal integrity independent of somatic toxicity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized neuronal preparations with quantifiable axonal outgrowth and degeneration metrics.
- Operational Value: Enables reproducible loading of defined cell densities into microfluidic devices for assay consistency.
- Scalability: Supports parallel device loading for medium-format screening of axonal modulators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human axonal pathology in a disease-relevant system using primary rodent neurons.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of axonal responses over days in culture.
- Translational Continuity: Bridges in vitro mechanistic findings to in vivo axonal degeneration models.
Pipeline & Workflow Integration
The neuron preparation workflow fits within early discovery to enable axon-focused assay development prior to lead optimization, providing mechanistic de-risking for targets implicated in axonal transport or structural integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of axon-specific pathways by isolating axonal compartment responses.
- Screening: Delivers axon-enriched fractions for reliable compound screening with reduced somatic interference.
- Analytics: Enables quantitative axonal measurements via fluorescence or biochemical readouts in isolated compartments.
- Translational Research: Aligns with preclinical models of axonal injury through conserved degeneration readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal platform for iterative target interrogation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in axon-specific target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Standardized neuron dissociation and loading protocols improve inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking axon-related mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of targets with strong axonal phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuron culture and aseptic technique.
- Depends on access to microfluidic devices and fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of trypsin dissociation and trypan blue viability assessment across teams.
- Adaptation to human iPSC-derived neurons may require protocol optimization for dissociation efficiency.
- Practical limitation: Neuronal viability declines if cortex storage exceeds 48 hours, necessitating timely processing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
7:26
Loading Cortical Neurons into the Microfluidic Device
4:14
Triturating E18 Fetal Rat Cortex
0:00
Title
0:03
Introduction
9:37
Performing Axotomy for Axonal Regeneration Studies
11:20
Conclusion
8:56
Visualizing Compartmentalized Cortical Neurons
1:46
Trypsinizing E18 Fetal Rat Cortex
0:47
Preparing Tools and Reagents
