Name: 人类承认免疫失衡的早期国家禁止作为筛检工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 了解如何使用体外抑制实验评估调节性T细胞功能，以识别1型糖尿病高风险人群的免疫失衡状态。该方法通过测量T细胞增殖反应，为早期预测自身免疫疾病提供可靠工具。

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本研究由威斯康星医学院麦克斯·麦吉青少年糖尿病国家研究中心和威斯康星儿童研究所资助。资助方在研究设计、数据收集与分析，以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 在建立抑制实验之前，需用抗人CD3抗体（克隆号UCHT1，终浓度 1μg/ml用于细胞刺激，随后通过建立实验检测磁珠是否被有效包被 体外 使用人T细胞的增殖实验
<ol>
<li>从原瓶中取出1 ml M-450 甲苯磺酰活化珠，置于磁力架上，静置直至所有珠子吸附至管壁一侧。保持管子在磁力架上，吸除缓冲液。将管子从磁力架上取下，加入1 ml 缓冲液1，再次将管子放入磁力架，待珠子吸附后，在管子仍处于磁力架中时吸除缓冲液1；用1 ml 缓冲液1重悬珠子，然后加入 40μl 抗人CD3，振荡处理 37°C 15分钟时，加入0.1%（w/v）BSA，继续振荡16小时。</li>
<li>用缓冲液2洗涤珠子，每次5分钟，共洗两次，温度为2-8°C 并在缓冲液3中于2-8℃下孵育5分钟8°C 使用磁力架，操作如上所述；弃去缓冲液，将磁珠重悬于1 ml缓冲液2中；磁珠数量为4×10⁸8/ml 终浓度，可直接使用。</li>
<li>在96孔板中，每孔分别加入50,000和25,000个PBMC，设三个复孔，并加入不同数量的CD3包被磁珠（4×108beads/ml，CD3 1μg/ml，例如每个细胞1、2、3、4、5个磁珠），以确定每个细胞的最佳磁珠数量。培养72小时后，加入 1μCi [3H] 胸腺嘧啶脱氧核苷并继续在 37°C 继续培养16小时。使用Multiscreen收获板（Millipore）收集细胞，加入闪烁液，用Top Count NXT（Packard, CT）检测每孔每分钟计数（cpm）。当cpm值高于5000但低于15000时，采用微珠与细胞的比例（beads/cell ratio），以避免调节性T细胞（Tregs）过度刺激而丧失抑制功能。通常，每细胞3个微珠的比例可有效刺激迄今测试的所有受试组中的反应性T细胞和Treg细胞。1-4.</li>
</ol>
2. 从健康供体的全血、人白细胞浓缩液或通常来自健康志愿者并可从当地血液中心免费获得的血沉棕黄层（BC）中分离外周血单个核细胞（PBMC）（图1）
<ol>
<li>用 PBS 将 BC（约 50 ml）按 1:6 比例稀释（加入 250 ml），总体积现为 300 ml。将 25 ml 稀释后的 BC 缓慢地加至已装有 15 ml Ficoll-Paque PLUS 的 50 ml Falcon 管上层，注意不要搅动液层。在 4°C 条件下，以 800×g（Sorvall 离心机配 SH-3000 摇桶转子，转速 1400 rpm）离心 30 分钟，关闭刹车。</li>
<li>小心收集 PBMC 层（中间相），转移至新的 50 ml Falcon 管中。用 DPBS 将管内液体补至 50 ml 以洗涤 PBMC。将 2 个细胞沉淀合并至同一管中。在 4°C 条件下，以 400×g 离心 10 分钟。重复洗涤步骤两次，每次均将 2 个细胞沉淀合并至同一管中。最后将所有细胞沉淀合并至一个 50 ml 管中。</li>
<li>使用台盼蓝排斥法计数 PBMC。取 20 μl PBMC 与 180 μl 台盼蓝染液混合，制备成 1:10 稀释液，充分混匀后立即取 20 μl 加入血细胞计数板进行计数。计数位于两个大方格（每个大方格含 16 个小方格）内的所有未染色细胞及仅被染成蓝色的细胞数量。取两个大方格计数结果的平均值，乘以 10。再将该数值除以 100，得到每毫升 PBMC 的数量。细胞活力百分比计算公式为：[1－（蓝色细胞数 / 总细胞数）×100]。若细胞活力 ≥95%，则继续后续实验。</li>
</ol>
3. CD4 T细胞的MACS预分选
<ol>
<li>操作前，将1ml PBMC转移至新离心管中，加入4ml培养基，用于准备接受5000rad照射的细胞——这些细胞将作为抗原呈递细胞（APC）。</li>
<li>将剩余细胞在含PBS/2mM EDTA/0.5%BSA的缓冲液中以250×g离心10分钟（4°C）。弃去上清液，用4ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液重悬细胞。</li>
<li>加入200μl MACS抗CD4微珠，4°C孵育20分钟。</li>
<li>加入40ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液洗涤，250×g离心10分钟（4°C）。弃去上清液，用8ml脱气、室温的PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液重悬细胞。</li>
<li>在上样至LS柱前，使用预分离滤器过滤细胞悬液。</li>
<li>将细胞悬液分装，每份4ml加至已校准的LS柱（柱内预先加入3ml脱气的PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液）。LS柱固定于MidiMACS分选器中。在细胞悬液完全流尽前，可选择将穿流液重新上样，或加入3ml脱气室温PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液并使其流过柱体。继续添加缓冲液直至流出液澄清。</li>
<li>用移液器将5ml脱气缓冲液加入LS柱，从MidiMACS分选器上取下LS柱，放入新的无菌15ml收集管中，让约1.0ml液体自然流出。将推杆插入柱中，缓慢将剩余液体全部推出。</li>
<li>对两个LS柱进行相同操作，并合并所得的两份CD4+细胞组分。加入PBS至总体积达50ml，计数细胞。预期产量可达5×108个细胞。以400×g离心10分钟，充分重悬于2ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液中。</li>
</ol>
4. 荧光激活细胞分选（FACS）分离（图2）
<ol>
<li>配制针对以下细胞表面标志物的CD标志物抗体混合液（避光保存）：20 μl 抗人CD8-FITC（克隆号RPA-T8）、20 μl 抗人CD14-FITC（克隆号M5E2；LPS受体）、20 μl 抗人CD32-FITC（克隆号FLI8.26；FcγR-II型）和6 μl 抗人CD116-FITC（克隆号M5D12；GM-CSFRα链），可选择性地额外加入40 μl 抗人CD4-APCCy7（克隆号RPA-T4）。</li>
<li>从2 ml细胞悬液中取出5 μl，加入2 μl染色混合液进行染色，作为确定阈值的对照管（荧光染料减一对照，FMO）5。</li>
<li>向染色混合液中加入50 μl 抗人CD25-PE（克隆号M-A251；IL-2Rα），混匀后加入细胞悬液中，4°C孵育30分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，400×g离心10分钟，重悬细胞至浓度为107/ml。</li>
<li>准备未染色的细胞以及用单一荧光染料染色的细胞或微珠，作为在FACS Aria（BD Biosciences，San Jose，NJ）上进行细胞分选时的补偿对照。</li>
<li>检测FMO管中的细胞，用于设定CD25+ T细胞分选的阈值（图2a）。在图中设定门控圈选FITC阴性细胞，以排除表达FITC的单核细胞、巨噬细胞及其他CD4+非T细胞（图2b）。</li>
<li>在另一图中，分别圈选CD25-、CD25low和CD25high T细胞——调节性T细胞（Tregs，指表达CD25水平最高的前1%细胞）（图2c）。这些细胞亚群通常具有较高的纯度（图2d、2e和2f）。</li>
<li>将收集管中的细胞以400×g离心10分钟，离心后置于冰上保存，直至进行铺板操作。</li>
</ol>
5. 在96孔板中建立细胞培养（方案见表1），每孔200μl
<ol>
<li>在U型底96孔板中，将50μl CD3包被的磁珠（1 μg/ml，按每3个磁珠对应1个反应细胞计算）用含10%混合人AB血清的完全培养基重悬。例如，配制2ml含CD3包被磁珠的培养基时，取7.5μl磁珠原液（终浓度为4×108/ml），加入2ml培养基中；每50μl含75,000个磁珠，即每细胞3个磁珠。</li>
<li>将照射处理的抗原呈递细胞（APC）稀释至细胞浓度为5×105/ml，每孔加入50μl（含2.5×104个细胞），加入至已预先添加刺激物的各孔中，包括表1中标记为“仅Treg”、“仅APC”和“仅培养基”的孔。</li>
<li>按照表1的设计，每孔加入2.5×104个CD4CD25-或CD4CD25low T细胞，每个样本设三个复孔。</li>
<li>将调节性T细胞（Tregs）以1:10的比例（即2,500个Treg细胞）加入共培养孔（表1中B行）以及标记为“仅Treg”的孔中，将培养板置于37°C、含5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中孵育72小时。</li>
<li>每孔加入1μCi [3H]胸腺嘧啶核苷进行脉冲标记，继续在37°C孵育16小时。</li>
</ol>
6. 收获与计数
<ol>
<li> 使用Packard FilterMate细胞收集器或替代系统，在多孔滤膜收集板上收集细胞。</li>
<li> 加入闪烁液（Microscint 20），并用透明塑料盖覆盖收集板，以准备进行最后一步。</li>
<li> 使用Top Count NXT（Packard, CT）或替代系统读取每孔每分钟计数（cpm）。</li> 
</ol>
7. 计算抑制百分比
<ol>
<li>由于细胞以三复孔培养，因此针对每种条件计算平均值。若变异系数为 &gt;30% 时，剔除该离群值，仅取两个孔的 cpm 值求平均。抑制率通过公式 [(s-c)/s] × 100% 计算，其中 s 为单独培养时的 cpm 值，c 为共培养时的 cpm 值。</li>
<li>初始型（CD25-）和 体内 活化的（CD25low）效应T细胞作为反应T细胞接种，通过检测调节性T细胞（Tregs）对这些亚群抑制能力的差异，并基于“活化细胞更难被抑制”的假设，将其作为潜在的功能性预后指标。</li>
</ol>
8. 代表性结果：
所采用方法及所得结果存在较大差异 体外 人类抑制实验促使我们对影响该实验的各种条件进行了全面研究1我们开发了一种检测方法，不仅能够检测Treg的功能，还能评估其纯度，该方法基于我们先前确定的Tregs与Teffs之间的较低比例（1:10）6此外，Treg细胞在有效抑制初始T细胞和 体内-激活的T细胞，即使在健康受试者中也是如此，如图3及我们先前的研究所示2,4，当免疫平衡受损时，这一现象会更加明显，例如在有发展为1型糖尿病（T1D）风险的个体中。该检测方法在研究中表现良好，我们借此比较了天然性（nTregs）、诱导性（iTregs）和 体外 扩增的天然调节性T细胞（nTregs），从而能够比较健康对照组、新发（RO）1型糖尿病（T1D）和长期（LS）T1D受试者之间这些细胞的功能。我们得出结论：与长期T1D和健康对照组受试者相比，新发T1D受试者在生成具有功能性的诱导型调节性T细胞（iTregs）和扩增的天然调节性T细胞（nTregs）方面能力更强。7因此，该检测可作为识别免疫失衡早期和晚期状态的优良工具。 
方案1 参与步骤的示意图 体外 抑制实验
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="细胞分选工作流程：包被磁珠、PBMC分离、磁珠分选（MACS）、流式分选（FACS）、体外培养、细胞计数。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 步骤 体外 抑制实验以照片形式展示 
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="流式细胞术图谱；基于CD25表达分析的细胞分选；FSC-A 与 PE-A 散点图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. FACS细胞分离中的设门策略。a) 根据荧光减一对照（FMO）设定CD25+阈值，b) 将细胞设门为FITC阴性，c) 对FITC阴性细胞进一步设门并分选为CD+CD25-、CD+CD25low和CD+CD25high（调节性T细胞，Tregs），图中显示各群百分比，d) 分选后经FACS分选的Tregs细胞，e) 分选后经FACS分选的CD+CD25low细胞，f) 分选后经FACS分选的CD4+CD25- T细胞
<img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="CD4+ T细胞抑制数据；柱状图；CD25亚群比较；免疫学研究结果" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 健康受试者的代表性结果 a) 健康受试者每分钟计数（cpm）的代表性结果，以所有涉及细胞亚群的单独培养形式呈现，包括初始型CD25-细胞、体内活化的CD25low细胞、抗原呈递细胞（APC）和调节性T细胞（Treg），以及反应性T细胞（CD25- 或 CD25low）与Treg的共培养体系。b) 显示健康对照组受试者（n=4）中自体Treg对CD25-和CD25low反应性T细胞的抑制百分比。抑制率计算公式为[(s-c)/s] × 100%，其中s为单独培养的cpm值，c为共培养的cpm值。尽管观察到Treg对反应性T细胞的抑制能力存在轻微差异，但无统计学意义（配对t检验，p=0.08）。c) 显示高风险受试者各单独培养体系的cpm值，包括以CD25-和CD25low细胞作为反应性T细胞，以及APC和Treg，并包括将每种反应性T细胞亚群与Treg共同培养的体系（CD25-/Treg 和 CD25low/Treg）。d) 显示高风险受试者（n=4）中自体Treg对CD25-和CD25low反应性T细胞的抑制百分比。Treg对CD25-与CD25low反应性T细胞的抑制能力差异具有统计学意义（配对t检验，p=0.04）。
表1. 示意图设置 体外 抑制实验
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>1-3</td>
			<td>4-6</td>
			<td>7-9</td>
			<td>10-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>CD4CD25-</td>
			<td>CD4CD25low</td>
			<td>仅培养基</td>
			<td>仅培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>CD4CD25- /Tregs</td>
			<td>CD4CD25low /Tregs</td>
			<td>仅Tregs</td>
			<td>仅APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li>
<li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+arsenazo+III+in+the+preparation+and+characterization+of+an+albumin-linked%2C+gadolinium-based+macromolecular+magnetic+resonance+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent.</a> J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).</li>
<li>Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+determination+of+the+number+of+water+molecules%2C+q%2C+coordinated+to+europium%28III%29+ions+in+solution+from+luminescence+decay+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes.</a> Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).</li>
<li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates%3A+design+considerations+for+nanomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li>
<li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).</li>
<li>Uppal, R., Caravan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+probes+for+cardiovascular+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeted probes for cardiovascular MR imaging.</a> Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).</li>
<li>Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioresponsive%2C+cell-penetrating%2C+and+multimeric+MR+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).</li>
<li>Datta, A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gd-hydroxypyridinone+%28HOPO%29-based+high-relaxivity+magnetic+resonance+imaging+%28MRI%29+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).</li>
<li>Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsive+MRI+agents+for+sensing+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo.</a> Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).</li>
<li>Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li>
<li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gadolinium%28III%29+chelates+as+MRI+contrast+agents%3A+structure%2C+dynamics%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li>
<li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging%3A+theory+and+design%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li>
<li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li>
<li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li>
<li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+in+the+preparation+of+dendrimer-based+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+MR+contrast+agent+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives.</a> Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).</li>
<li>Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+MRI+properties+between+derivatized+DTPA+and+DOTA+gadolinium-dendrimer+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).</li>
<li>Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li>
<li>Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li>
<li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+biological+evaluation+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23-targeted+PAMAM+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由于抑制功能是调节性T细胞（Tregs）唯一的独特特征，因此应在同一研究及不同研究中，对疾病发展不同阶段的受试者之间可靠且一致地检测该功能。我们提供了本实验室建立的抑制实验的详细信息，以推动该实验方法的标准化。在我们 extensive 的优化研究中，我们确定使用抗人CD3包被的微珠（UCHT1克隆，浓度为1μg/ml，而非商业产品常用的5μg/ml）联合外周血单个核细胞（PBMC）作为抗原呈递细胞（APC），可提供一种天然刺激方式，有效激活受试者中的反应性T细胞和调节性T细胞1。抗人CD3抗体的选择至关重要，因为在我们的实验中，仅Ancell公司的抗体获得了预期结果。单独使用抗人CD3与抗人CD28联合刺激不足以检测出不同受试组之间的差异（结果未显示），而PBMC可提供完整的共刺激信号谱，从而提高信号转导的可能性并实现高效刺激。
本方案既可用于白细胞浓缩物，也可用于患者血液。唯一的区别在于PBMC分离过程中需要加在Ficoll-Paque PLUS上方的血量。本实验所用培养基含有10%混合人AB型血清，我们发现该成分对实验具有显著促进作用。然而，在使用前必须...

<table><tbody><tr><td>菲可-帕克 PLUS</td><td>Amersham</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-1X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD4-APCCy7（克隆 RPA-T4）</td><td>BD Biosciences</td><td>557852</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD25-PE（克隆 M-A251；IL-2R&amp;#945;）</td><td>BD Biosciences</td><td>555432</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD8-FITC（克隆 RPA-T8）</td><td>BD Biosciences</td><td>555366</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD14-FITC（克隆 M5E2；LPS 受体）</td><td>BD Biosciences</td><td>555397</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD32-FITC（克隆 FLI8.26；Fc&amp;#947;R II 型）</td><td>BD Biosciences</td><td>555448</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD116-FITC（克隆 M5D12；GM-CSFR&amp;#945; 链）</td><td>BD Biosciences</td><td>554532</td><td></td></tr><tr><td>Dynalbeads M-450 甲苯磺酰化磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>140-13</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD3</td><td>Ancell</td><td>144-024</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液1</td><td>自制</td><td></td><td>0.1M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt; pH7.6</td></tr><tr><td>缓冲液2</td><td>自制</td><td></td><td>PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4</td></tr><tr><td>缓冲液3</td><td>自制</td><td></td><td>0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5</td></tr><tr><td>完全 RPMI 培养基</td><td>自制</td><td></td><td>RPMI 1640 培养基 2 mM L-谷氨酰胺 5 mM HEPES 100 U/&amp;#x03BC;g/ml 青霉素/链霉素 0.5 mM 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H] 胸苷</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET027Z005MC</td><td></td></tr><tr><td>人混合 AB 血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>多孔收获板</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHFC1H60</td><td></td></tr><tr><td>Microscint 20</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013621</td><td></td></tr></tbody></table>

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

调节性T细胞（Tregs）是介导对自身抗原免疫耐受的关键因素。此外，它们在感染后免疫应答的调控中也发挥着至关重要的作用。尽管已有诸多努力试图鉴定Tregs特有的表面标志物，但其唯一独特特征仍是抑制效应T细胞增殖和功能的能力。虽然目前明确的是，仅 体外 在评估人类调节性T细胞（Treg）功能时，尽管可以使用多种检测方法，但在进行横断面研究结果评估时会遇到问题，尤其是在需要比较健康个体细胞与自身免疫性疾病患者（如1型糖尿病-T1D）分离细胞的情况下。目前各实验室在所使用的反应性T细胞的数量和类型、刺激的性质与强度、Treg与反应性T细胞的比例，以及所用抗原呈递细胞（APC）的数量和类型方面存在显著差异。 体外 抑制实验。这种变异性使得不同研究之间在评估Treg功能时难以进行比较。Treg研究领域亟需一种标准化的抑制实验方法，能够同时适用于健康个体和自身免疫性疾病患者。我们已开发出一种 体外 抑制试验显示，与存在胰腺β细胞自身免疫破坏的受试者相比，来自健康志愿者的T细胞在刺激过程中表现出极低的实验内变异性。本文主要目的是描述一种 体外 一种可实现不同受试组间比较的人源抑制试验。此外，该试验有望揭示自然调节性T细胞（nTreg）功能的轻微下降，并预测其未来可能的进一步减损，从而识别出可能从预防性免疫调节治疗中获益的个体1以下，我们将详细描述该操作步骤中的各个环节。我们希望为该技术的标准化作出贡献 体外 用于评估Treg功能的抑制试验。此外，我们提供该试验作为识别免疫失衡早期状态以及T1D潜在功能性生物标志物的工具。

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外 一种能够识别有患1型糖尿病风险个体中免疫失衡的检测方法。

调节性T细胞（Tregs）是介导对自身抗原免疫耐受的关键因子。此外，它们也是免疫应答的重要调控者……

本实验的总体目标是利用体外人源抑制性检测方法来评估调节性T细胞（Treg）的功能，并可能预测其功能的未来丧失情况。首先制备并测试编码微球，这些微球将用作细胞刺激剂；第二步是从体内分离出纯化的初始型CD4阳性CD25阴性T细胞、活化的CD4阳性CD25低表达T细胞以及调节性CD4阳性CD25高表达T细胞，并将这些细胞辐照处理后的PBMCs用作抗原呈递细胞（APC）。接下来，在相同条件下，分别建立以初始T细胞或活化T细胞作为反应细胞、P BMCs作为抗原呈递细胞的单培养体系，或加入调节性T细胞（Tregs）以1:10比例共培养的共培养体系。最后一步是收集细胞，并通过氚标记的胸腺嘧啶掺入法检测其增殖情况。最终获得的结果可揭示调节性T细胞对初始T细胞与体内活化T细胞应答抑制作用的差异。我叫 Jeff Woodcliff。调节性 T 细胞不表达独特的细胞表面标志物。因此，为了可靠地检测其功能，必须采用能够实现最佳分离效果的技术来分离这些细胞。相较于其他方法（如最大分离法），使用荧光激活细胞分选的主要优势在于，fax 能够获得高纯度的细胞群体。随后，可在体外抑制实验中可靠地检测细胞功能，如本实验所示。尽管该方法可用于研究调节性 T 细胞（Treg）在健康个体以及1型糖尿病相关受试者中的功能，还可应用于其他自身免疫性疾病，例如人类类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、红斑性狼疮、多发性硬化症等。为包被经 taal 激活的微珠，需使用抗人 CD3 抗体。从原装小瓶中取1毫升M-450包被磁珠加入1.5毫升离心管中，将离心管置于磁力架上，直至所有磁珠吸附至管壁一侧。随后，在离心管仍处于磁力架上的状态下，用移液器吸除磁珠缓冲液。然后将离心管从磁力架上取出，加入1毫升缓冲液一。将试管反复置于磁力架上。当试管处于磁力架上时，移除缓冲液。再次将磁珠重悬于1 mL缓冲液中。此次还需加入40微升抗人CD3抗体。将磁珠与抗体在37摄氏度下振荡15分钟。然后加入0.1%（质量/体积）的BSA，并继续振荡16小时。接下来，在2至8摄氏度下，用一毫升缓冲液二孵育磁珠五分钟，以缓冲液二洗涤磁珠两次，然后将离心管置于磁力架上，移除缓冲液。随后在相同的无菌条件下再洗涤磁珠一次。此次使用一毫升缓冲液三，通过在每个细胞中加入不同数量的CD3包被微珠，检测抗体包被的效率，以确定最佳比例，并在96孔圆底培养板中每孔接种50,020至5,000个外周血单个核细胞（PBMNCs），每组设三个复孔。在37摄氏度培养72小时后，每孔加入一微居里的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷，继续孵育16小时。随后在多孔收集板或类似装置中收集细胞。加入闪烁液并读取每孔每分钟计数（CPM）。使用Top Count NXT闪烁计数仪或类似仪器，根据经验，选择每孔CPM持续高于5,000但低于15,000的条件来确定珠子与细胞的比例。在所有测试的人类受试者中，每细胞三个珠子的比例通常可为应答细胞和调节性T细胞（Treg细胞）提供最佳刺激效果。向一个50毫升的锥形管中加入15毫升Ficoll-Paque Plus。然后通过向血液管中加入250毫升PBS，对50毫升的血沉棕黄层进行1:6稀释。将25毫升稀释后的血沉棕黄层缓慢地加到Ficoll-Paque层上方，注意不要搅动已形成的液层。在4°C条件下，以800 × g离心30分钟。关闭刹车后，小心收集PBMC层，即血浆与缓冲液之间的白色中间相。如有需要，可从离心管管壁上刮取细胞。等待几分钟后，再次从中间层收集细胞。将细胞转移至新的 50 毫升离心管中，通过加入 PBS 重悬细胞沉淀进行洗涤。PBM cs。每次重复洗涤步骤两次。将两个细胞沉淀合并到一个离心管中，最终将所有细胞沉淀合并至一个50毫升的离心管中。然后取20 µL悬浮细胞，用台盼蓝排斥法测定细胞活力。通过将1毫升活细胞PBMC转移至新管中来制备诱导性抗原呈递细胞。然后加入4毫升培养基，并用5,000拉德的辐射处理细胞，同时用PBS缓冲液补满含有剩余PBMC的管子。随后在4摄氏度下以250 × g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于4毫升相同的混合培养基中。然后向 PBMC 中加入 200 µL Max Anti-CD4 微珠，将细胞与微珠混合物在 4°C 下孵育 20 分钟。孵育结束后，用 40 mL PBS 缓冲液洗涤细胞，然后离心收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 8 mL 室温的脱气 PBS 缓冲液中。接下来，使用预分离过滤器过滤细胞悬液。然后将外周血单个核细胞悬液分装到两个15毫升离心管中，每管加入4毫升外周血单个核细胞悬液。将两个S型柱牢固地安装在最小值分离器上，并在每个柱下方放置收集管。当柱内无缓冲液残留时，向每个柱中加入3毫升DGA PBS缓冲液，随后在细胞悬液完全流尽前，将每根管中的全部4毫升细胞溶液加在柱上。再向每个柱中加入3毫升室温DGA PBS缓冲液，让缓冲液流过柱体进入收集管中。继续加入缓冲液，直至流出液变得澄清。用移液器将五毫升 DGA 缓冲液加入 LS 柱中，然后将 LS 柱从 miniMACS 分离器上取下。将柱子转移至新的无菌 50 毫升收集管中。先让半毫升液体流出，然后缓慢将剩余约四毫升的液体完全推出。现在合并两份CD4阳性组分。随后向离心管中加入至多50毫升的PBS，并在4°C下以400 × g离心10分钟，之后计数细胞。将细胞重悬于两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。将用于表面染色的抗体混合至同一管中，包括抗 CD 14、CD 32、CD 116 抗体，以及可选的抗 CD 4 抗体。取部分混合抗体用于荧光染料减一（fluorochrome minus one）对照管的染色。通过将五微升每毫升细胞悬液转移至流式管中来准备FMO管，并加入两微升预先配制的抗体混合物对细胞进行染色。接下来，将未染色的细胞以及包被小鼠IgG并用单一荧光染料染色的微珠分别加入新的单独流式管中，作为细胞分选时的补偿对照。然后，在抗体混合物中加入50微升抗人CD25 PE，并将该混合物加入剩余的细胞悬液中。将试管在4°C下孵育30分钟。用抗体混合物孵育细胞后，向细胞中加入PBS缓冲液，然后离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中，浓度为每毫升10⁷个细胞。使用FMO管设置分选CD25阳性T细胞的阈值。采用此门控策略，首先在FITC阴性细胞周围设门，以排除FITC阳性细胞，这些细胞包括单核细胞、巨噬细胞以及所有其他CD4阳性非T细胞，如本图所示。在另一张图中，分别绘制CD25阴性与CD25低表达T细胞以及CD25高表达Treg细胞的门，如本图所示。流式分选细胞亚群后，离心收集管并立即将T细胞置于冰上直至铺板。按照表格所示标记一个U型底96孔板。在96孔板中，用含10%人AB型血清的完全培养基悬浮50 µL的CD3包被珠子，使其浓度为每孔每反应细胞对应3个珠子；同时将先前经照射处理的抗原呈递细胞（APC）用培养基稀释至5×10⁵ 个细胞/毫升的浓度。向96孔板中每孔加入50微升细胞，然后每孔加入2.5 × 10⁴个CD4阳性CD25阴性或CD4阳性CD25低表达T细胞，每个样本设三个复孔。按照此处所示的1:10比例，将Treg细胞加入B行以及共培养板中标记为“Treg only”的孔中。随后将板置于37°C、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中孵育72小时。接着，用1微居里的氚标记胸腺嘧啶对细胞进行脉冲标记，胸腺嘧啶掺入后，继续在37°C孵育16小时，此过程发生在共培养的最后阶段。使用滤膜收获仪将细胞收获至多孔筛板上。然后用预先加入闪烁液的透明塑料盖覆盖收获板。最后读取每孔的每分钟计数（CPM）。使用闪烁计数器，可通过该系统实现T细胞亚群的高纯度分离，如下列点图系列所示：此处下部门控区域显示的是CD4阳性CD25阴性T细胞。在下一张图中，可观察到高度纯化的CD4阳性CD25低表达T细胞。经流式分选获得的CD4阳性细胞纯群体。高表达CD25的Treg细胞显示在上方的门控对照中。来自健康受试者的APC和Treg细胞的单细胞类型培养物在胸苷掺入法测定时，表现出极低或几乎无背景增殖；而 naive CD25阴性T细胞和体内活化的CD25低表达T细胞则表现出显著增殖，当这些反应性细胞类型与Treg细胞共培养时，其增殖受到抑制。尽管观察到Treg细胞对抑制naive CD25阴性T细胞和体内活化的CD25低表达T细胞的反应能力存在轻微差异。这种差异无显著性控制意义。来自高危个体的抗原提呈细胞（APCs）和调节性T细胞（Tregs）单细胞类型培养物，通过胸苷掺入法检测，其增殖水平与背景相比极低或几乎无增殖。而来自健康对照组的初始CD25阴性T细胞以及体内活化的CD25低表达T细胞，其增殖水平低于健康对照组。在该检测能够产生可靠结果的情况下，效应T细胞的增殖进一步受到调节性T细胞（tregs）以及共培养体系的抑制。我们还可以进一步推断，较低的CPM值可能提示信号转导存在潜在缺陷，这需要在其他类型的研究中进一步探究。然而，在高风险个体中，调节性T细胞对CD25阴性与CD25低表达的效应T细胞的抑制能力差异具有显著性。观看本视频后，您应能充分理解如何顺利衔接所有必要步骤，以对健康受试者及免疫系统功能受损受试者（例如1型糖尿病患者）体内的调节性T细胞（Tregs）进行成功且可靠的的功能检测。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

人类<em在体外承认免疫失衡的早期国家禁止作为筛检工具

我们开发了一种 体外 用于研究免疫调节通路在HIV特异性CD4...

体外检测免疫调节通路对HIV特异性CD4 T细胞效应功能影响的实验方法

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利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原富集与清除人胚胎干细胞

人类共感染难以复制 体外然而，人类疟原虫可被轻易地进行体外培养 体外，新鲜分离的自然感染HIV的人类外周血单个核细胞亦可如此。这为研究HIV共感染背景下疟原虫的早期免疫应答提供了一个极佳的模型。...

一个 体外 HIV共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

在此，我们介绍一种诱导移植耐受的方案，并对其进行评估 体外 和 体内...

体外 与 体内 评估移植受者T细胞、B细胞及髓系细胞的抑制活性与体液免疫应答

我们在此描述一种用于研究预先激活的CD8细胞毒性的实验方案+ 通过检测凋亡的癌细胞来识别针对癌细胞的T细胞 通过 实时显微镜技术。该方案可用于研究髓系细胞诱导的T细胞抑制机制，并评估旨在恢复T细胞功能的化合物 通过...

实时检测CD8+ T细胞诱导的体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

我们描述了一种基于人外周血单个核细胞（PBMC）的人源化异种移植小鼠模型，用于转化性肿瘤免疫学研究。该方案可作为建立和表征类似模型以评估免疫肿瘤学疗法的通用指南。...

用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

本文通过分子与信息学实验方案，描述了利用基于RNA的方法对实体瘤组织进行定量免疫谱分析，并借助临床队列开展肿瘤免疫学生物标志物发现的研究策略。...

实体瘤的预测性免疫建模

本文介绍了一种从人外周血中分离单核细胞，并将其分化为巨噬细胞和树突状细胞，进而与上皮细胞共同组装成多细胞人肺模型的实验方案。该研究比较了由新鲜分离或冻存后解冻的单核细胞分化而来的免疫细胞所构成的共培养体系，在受到促炎刺激后的生物学反应。...

由上皮细胞和原代免疫细胞组成的用于危害评估的多细胞人类肺泡模型

本方案概述了用于免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的构建方法。本文介绍了在此模型中移植人源肿瘤并用于测试人源免疫治疗药物的操作步骤和注意事项，重点在于表征人源免疫系统对肿瘤的应答反应。...

在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

了解如何使用体外抑制实验评估调节性T细胞功能，以识别1型糖尿病高风险人群的免疫失衡状态。该方法通过测量T细胞增殖反应，为早期预测自身免疫疾病提供可靠工具。

人类体外抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

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