人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

本实验的总体目标是利用体外人源抑制性检测方法来评估调节性T细胞（Treg）的功能，并可能预测其功能的未来丧失情况。首先制备并测试编码微球，这些微球将用作细胞刺激剂；第二步是从体内分离出纯净的初始型CD4阳性CD25阴性T细胞、活化的CD4阳性CD25低表达T细胞以及调节性CD4阳性CD25高表达T细胞，并将这些细胞辐照处理后的外周血单个核细胞（PBMCs）用作抗原呈递细胞（APCs）。

接下来，将建立单独的培养体系，以初始T细胞或活化T细胞作为反应细胞，P BMCs作为抗原呈递细胞（APCs），或在相同条件下进行共培养，但按1:10的比例加入调节性T细胞（Tregs）。最后一步是收集细胞，并通过氚标记的胸腺嘧啶掺入法检测其增殖情况。最终获得的结果可揭示对初始T细胞与体内活化T细胞反应的抑制作用之间的差异。

我的名字是Jeff Woodcliff。调节性T细胞不表达独特的细胞表面标志物。因此，为了可靠地检测其功能，必须采用能够实现最佳分离效果的技术来分离这些细胞。

相较于最大分离等其他方法，使用荧光激活细胞分选的主要优势在于 fax 能够获得高纯度的细胞群体。随后，可在体外抑制实验中可靠地检测细胞功能，如本实验所示。尽管如此，该方法可为健康个体及1型糖尿病相关受试者中调节性T细胞（Treg）功能提供深入见解，也可应用于其他自身免疫性疾病，如人类类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、红斑性狼疮、多发性硬化症等。为包被经taal激活的微珠，需使用抗人CD3抗体。

从原装小瓶中取1毫升M four 50磁珠活化液加入1.5毫升离心管中，将离心管置于磁力架上，直至所有磁珠吸附至管壁一侧。随后，在离心管仍处于磁力架上的状态下，用移液器吸除磁珠缓冲液。然后将离心管从磁力架上取下，加入1毫升缓冲液一。

将试管反复置于磁力架上。当试管处于磁力架上时，移除缓冲液。再次将磁珠重悬于1 mL缓冲液中。

此次还需加入40微升抗人CD3抗体。将磁珠与抗体在37摄氏度下振荡15分钟。然后加入0.1%（质量/体积）的BSA，并继续振荡16小时。

接下来，在2至8摄氏度下，用一毫升缓冲液二孵育磁珠五分钟，以洗涤磁珠两次，然后将离心管置于磁力架上，去除缓冲液。随后在相同的无菌条件下再洗涤磁珠一次。

此次使用一毫升缓冲液三，通过在每个细胞中加入不同数量的CD3包被微珠，检测抗体包被的效率，以确定最佳比例，并在96孔圆底培养板中每孔接种50,020至5,000个外周血单个核细胞（PBMNCs），每组设三个复孔。在37摄氏度培养72小时后，每孔加入一微居里的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷，继续孵育16小时。随后在多孔收集板或类似装置中收集细胞。

加入闪烁液并读取每孔的每分钟计数（CPM）。使用Top Count N XT闪烁计数仪或类似设备，根据经验，选择每孔CPM持续高于5,000但低于15,000的条件来确定珠子与细胞的比例。在所有测试的人类受试者中，每细胞三个珠子的比例通常可为应答细胞和调节性T细胞（Treg细胞）提供最佳刺激效果。

用15毫升FAL Plus填充一个50毫升的锥形管。然后通过向血液管中加入250毫升PBS，对50毫升的血沉棕黄层进行1:6稀释。缓慢地将25毫升稀释后的血沉棕黄层加到Ficoll-Paque液面上方，注意不要扰动液层。

在4°C条件下，以800 × g离心30分钟。关闭刹车后，小心收集PBMC层，即血浆与缓冲液之间的白色中间相。如有需要，可从离心管管壁上刮取细胞。

等待几分钟，再次从中间层收集细胞。将细胞转移至新的50毫升离心管中，通过加入PBS缓冲液重悬细胞并离心洗涤。PBM cs。

每次重复洗涤步骤两次。将两个细胞沉淀合并到一个离心管中，最终将所有细胞沉淀合并至一个50毫升离心管中。然后取20微升悬浮细胞，用台盼蓝排斥法测定细胞活力。

通过将1毫升活细胞PBMC转移至新试管中来制备诱导性抗原呈递细胞。然后加入4毫升培养基，并用5,000拉德的辐射处理细胞，同时用PBS缓冲液补满含有剩余PBMC的试管。随后在4°C条件下以250 × g离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于4毫升相同的混合培养基中。

然后向 PBMC 中加入 200 µL Max Anti-CD4 微珠，将细胞与微珠混合物在 4°C 下孵育 20 分钟。孵育结束后，用 40 mL PBS 缓冲液洗涤细胞，然后离心收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 8 mL 室温的脱气 PBS 缓冲液中。

接下来，使用预分离滤器过滤细胞悬液。然后将外周血单个核细胞悬液分装到两个15毫升离心管中，每管加入4毫升外周血单个核细胞悬液。

将两个S型柱固定在最小-最大分离器上，并在每个柱下方放置收集管。当柱内无缓冲液残留时，向每个柱中加入3毫升DGA PBS缓冲液，随后在细胞悬液完全流尽前，将每根管中的全部4毫升细胞溶液加在柱上。再向每个柱中加入3毫升室温DGA PBS缓冲液，让缓冲液流过柱子进入收集管中。

继续添加缓冲液，直至流出液变澄清。用移液器将五毫升 DGA 缓冲液加入 LS 柱中，然后将 LS 柱从 Minimax 分离器上取下。将柱子放入新的无菌 50 毫升收集管中。

先让半毫升液体流出，然后缓慢将剩余约四毫升的液体完全推出。现在合并两份CD4阳性组分。随后向离心管中加入至多50毫升的PBS，并在4℃下以400 × g离心10分钟，然后计数细胞。

将细胞重悬于 2 mL PBS 缓冲液中。将用于表面染色的抗体混合至同一管中：抗 CD14、CD32、CD116 以及可选的抗 CD4。取部分混合抗体用于染色荧光染料减一对照管。

通过将五微升每毫升细胞悬液转移至流式管中来准备FMO管，并加入两微升预先配制的抗体混合物对细胞进行染色。接下来，将未染色的细胞以及包被小鼠IgG并用单一荧光染料染色的微珠分别加入新的流式管中，作为细胞分选时的补偿对照。然后，在抗体混合物中加入50微升抗人CD25 PE，并将该混合物加入剩余的细胞悬液中。

将试管在4°C下孵育30分钟。用抗体混合物孵育细胞后，向细胞中加入PBS缓冲液，然后离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于PBS缓冲液中，浓度为每毫升10的7次方个细胞。

使用FMO管设置分选CD25阳性T细胞的阈值。采用此门控策略，首先在FITC阴性细胞周围设门，以排除FITC阳性细胞，后者包括单核细胞、巨噬细胞以及所有其他CD4阳性非T细胞，如本图所示。在另一张图中，分别绘制CD25阴性与CD25低表达T细胞以及CD25高表达Treg细胞的门，如本图所示。

流式分选细胞亚群后，离心收集管，立即将T细胞置于冰上直至铺板。按照表格所示标记一个U型底96孔板。在96孔板中，将CD3包被微珠按每3个微珠对应1个反应细胞的浓度，取50 µL等分试样溶于含10%人AB血清的完全培养基中，随后将先前经照射的APC用培养基稀释至5×10⁵个细胞/毫升的浓度。

向96孔板中每孔加入50微升细胞，然后每孔加入2.5 × 10⁴个CD4阳性CD25阴性或CD4阳性CD25低表达T细胞，每个样本设三个复孔。将Treg细胞以1:10的比例加入B行以及共培养板中标记为“仅Treg”的孔中，如图所示。随后将培养板置于37°C、含5% CO₂及饱和湿度的培养箱中孵育72小时。接着，每孔加入1微居里的³H标记胸腺嘧啶核苷对细胞进行脉冲标记，然后继续在37°C孵育16小时，使胸腺嘧啶核苷在共培养的最后几小时内被细胞摄取。

使用滤膜收获仪将细胞收获至多孔筛板上。然后用透明塑料盖密封收获板，该盖预先加入闪烁液。最后读取每孔的每分钟计数（CPM）。

使用闪烁计数器，可通过该系统实现T细胞亚群的高纯度分离，如下列点图系列所示：此处下部门区显示的是CD4阳性CD25阴性T细胞。在下一张图中，可观察到高度纯化的CD4阳性CD25低表达T细胞。经流式分选获得的CD4阳性细胞纯度很高。

高表达CD25的Treg细胞显示在上方的门控对照中。来自健康受试者的APC和Treg细胞的单细胞类型培养物在胸苷掺入法检测中显示出极低或几乎无背景增殖，而初始CD25阴性T细胞和体内活化的CD25低表达T细胞则表现出显著增殖，当这些反应性T细胞与Treg细胞共培养时，其增殖受到抑制。尽管观察到Treg细胞对抑制初始CD25阴性T细胞和体内活化的CD25低表达T细胞的反应能力存在轻微差异。

这种差异无显著性控制意义。来自高危个体的抗原提呈细胞（APCs）和调节性T细胞（Tregs）的单细胞类型培养物，通过胸苷掺入法测定，其增殖水平与背景相比极低或几乎无增殖。而来自健康对照组相比，初始的CD25阴性T细胞以及体内活化的CD25低表达T细胞表现出较低的增殖水平。

在该检测能够产生可靠结果的情况下，应答性T细胞因受到调节性T细胞（tregs）以及共培养体系的进一步抑制。我们还可以进一步推断，较低的CPM值提示信号转导可能存在缺陷，这需要在其他类型的研究中进一步探究。然而，在高风险个体中，调节性T细胞对CD25阴性与CD25低表达的应答性T细胞的抑制能力差异具有显著性。

观看本视频后，您应能充分理解如何顺利衔接所有必要步骤，以对健康个体及免疫系统功能受损个体（例如 1 型糖尿病患者）体内的调节性 T 细胞（Tregs）进行成功且可靠的的功能检测。