人类承认免疫失衡的早期国家禁止作为筛检工具

该程序的总体目标是使用体外人体抑制测定来测量 treg 功能，并可能预测其功能的未来丧失。这是通过首先准备和测试编码珠子来实现的，这些珠子将用作细胞刺激剂。第二步是将纯幼稚 CD 4 阳性 CD 25 阴性 T 细胞体内活化 CD 4 阳性、CD 25 低 T 细胞和调节性 CD 4 阳性 CD 25 高 T 细胞 N 分离到辐射 PP BMC 中，用作抗原呈递细胞或 APC。

接下来，将幼稚或活化的 T 细胞作为反应源，以 P BMC 作为 APC 或相同条件下共培养物的单一培养物，但以 1 比 10 的比例添加 treg。最后一步是收获细胞并通过氚化测量它们的增殖。胸苷掺入最终获得的结果表明，初始激活的 T 细胞反应与体内激活的 T 细胞反应的抑制存在差异。

我叫 Jeff Woodcliff。调节性 T 细胞不表达独特的细胞表面标志物。因此，为了可靠地测量它们的功能，必须使用技术将它们隔离，以提供最佳分离。

与其他方法（如最大分离）相比，使用荧光激活细胞分选的主要优势在于，传真提供了可以实现的纯细胞群。然后可以在体外抑制测定中可靠地测试细胞功能，如此处所示，这种方法可以深入了解健康和与 1 型糖尿病相关的受试者的 treg 功能。它也可以应用于其他自身免疫性疾病，如人类风湿性关节炎、系统性狼疮、ery有丝分裂、多发性硬化症等 用抗人 CD 三包被 taal 活化珠。

将原始小瓶中的 1 毫升 M 四个 50 辛苦活化珠子加入 1.5 毫升试管中，然后将试管放在磁力架上，直到所有珠子都粘附在试管的侧面。然后在试管仍在磁力架中时移液取出珠子缓冲液。然后从磁力架中取出试管，加入 1 毫升缓冲液 1。

一次又一次地将试管放入磁力架中。当管子在磁力架中时去除缓冲液。复苏，再次将珠子悬浮在 1 毫升缓冲液中。

这次也添加了 40 微升的抗人 CD 三。在 37 摄氏度下搅拌微珠和抗体 15 分钟。然后添加每体积重量 0.1% BS、A，并继续搅拌接下来的 16 小时。

接下来，将微珠在 1 mL 缓冲液中孵育，用缓冲液 2 洗涤微珠两次。在 2 到 8 摄氏度下放置 2 个 5 分钟，然后在试管位于磁力架中时去除缓冲液。然后在相同的无菌条件下再次洗涤珠子。

这次使用 1 毫升缓冲液 3，通过在每个细胞中添加可变数量的 CD 3 包被珠子来测试抗体包被的效率，以确定最佳比例和 ALI 引用每孔 50， 020 5， 000 P BMC，在 96 球板中一式三份。在 37 摄氏度下培养 72 小时后，加入 1 块氚化胸苷微咖喱，并继续孵育接下来的 16 小时。在多屏幕收获板或类似物中收获细胞。

加入闪烁液并读取每分钟计数或每孔 CPM。使用最高计数 N XT 闪烁计数器或类似计数器，使用使 A CPM 始终高于 5， 000 但低于 15， 000 的计数器来确定珠子与细胞比率，根据我们的经验。每个细胞 3 颗珠子的比例通常为所有测试的人类受试者提供对反应细胞和 treg 细胞的最佳刺激。

在 50 毫升锥形管中加入 15 毫升 fal plus。然后通过向血液管中加入 250 毫升 PBS 对 50 毫升血沉棕黄层进行 1 到 6 次稀释。慢慢地将 25 毫升稀释的血沉棕黄层铺在 fial 包装的顶部，不要干扰各层。

在 4 摄氏度下以 800 倍 G 离心 30 分钟。关闭中断后，小心收集 PBMC 层，这是 fial 和缓冲液之间的白色中间相。如果需要，从管壁上刮下细胞。

等待几分钟，然后再次从中间阶段收集它们。将细胞转移到新鲜的 50 毫升试管中，并通过用 PBS 沉淀填充试管来清洗它们。PBM cs.

每次重复洗涤步骤两次。将两个细胞沉淀组合成一个试管，最终将所有细胞沉淀合集成一个 50 毫升的试管中。然后使用 20 微升悬浮细胞通过 trian 蓝色排除法测定细胞活力。

通过将 1 毫升活的 PBMC 转移到新试管中来测试生成 APC。然后加入 4 毫升培养基，用 5， 000 拉德照射细胞，用 PBS 缓冲液将含有其余 P BMC 的试管放满。然后在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心细胞 10 分钟后，倒出上清液，并将细胞重悬于 4 毫升相同的混合物中。

然后向 PBMC 中加入 200 μL 最大抗 CD 4 微珠，并在 4 摄氏度下孵育细胞和珠子混合物 20 分钟。孵育后，在 40 毫升 PBS 缓冲液中洗涤细胞，然后沉淀细胞。然后倒出上清液，在室温下将细胞重悬于 8 ml Degas PBS 缓冲液中。

接下来，使用预分离过滤器过滤分离细胞悬液。然后将 PBM CS 分成两个 15 毫升的试管。向每管中加入 4 毫升 P BMC。

将两个 s 柱厚厚地固定在 minimax 分离器上，并将收集管放在每列下方。然后，当没有缓冲液时，向每根柱子中加入 3 毫升 DGA PBS 缓冲液，在细胞悬液完全用完之前，将每根管中的整个 4 毫升细胞溶液铺在柱上。向每根柱子中加入 3 ml DGA 室温 PBS 缓冲液，让缓冲液流入收集管。

添加更多缓冲液，直到它出来变清。将另外 5 毫升 DGA 缓冲液移液到 LS 柱上，然后从 minimax 分离器中取出 LS 柱。将色谱柱放入新的无菌 50 mL 收集管中。

让半毫升流出，然后慢慢将剩余的体积抽出，大约四毫升。现在将两个 CD 合并四个阳性组分。然后向试管中加入最多 50 毫升的 PBS，并在 4 摄氏度下以 400 倍 G 离心细胞 10 分钟后对细胞进行计数。

细胞重悬于 2 mL PBS 缓冲液中。将用于事实染色的抗体合并为一管抗 CD 14、CD 32、CD one 16 和可选的抗 CD 4。取一份用于 FLUOROCHROME 染色的混合物，减去一根试管。

通过将 5 μL 试管毫升细胞悬液转移到传真管中来制备 FMO 管，并用 2 μL 先前制备的抗体混合物对细胞进行染色。接下来，将未染色的细胞和包被小鼠 IgG 的微珠（用单一荧光染料染色）添加到新的单个传真管中，用作细胞分选的补偿对照。然后将 50 μL 抗人 CD 25 PE 添加到混合物中，并将混合物添加到细胞悬液的其余部分。

将试管在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。用抗体混合物孵育细胞后，向细胞中加入 PBS 缓冲液，然后用 Resus 沉淀。将沉淀悬浮在 PBS 缓冲液中，浓度为 10 至 7 个细胞/毫升领导。

使用 FMO 管设置 CD 25 阳性 T 细胞分选的阈值。使用这种设门策略，首先，在 fite 阴性细胞周围设置步态，以排除 fitz 阳性细胞，其中包括单核细胞、巨噬细胞和所有其他 CD 四个阳性非 T 细胞，如图所示。在单独的图中，绘制 CD 25 阴性和 CD 25 低 T 细胞以及 CD 25 高 treg 细胞的步态，如图所示。

流式后，对细胞亚群进行分类，沉淀收集管，然后将 T 细胞保持在冰上直至铺板。如图所示，标记 U 形底 96 孔板。在 96 孔板中用 10% 混合人 AB 血清的完全培养基中悬浮 50 微升等分试样的 CD，三个包被的珠子，计算为每个反应细胞每孔浓度 3 个珠子，然后在培养基中将先前照射的 APC 稀释至浓度为 5 倍 10 至每 mL 第五个细胞。

将 50 微升细胞添加到 96 孔板中，然后将 2.5 乘以 10 添加到每孔的 4 个 CD 4 个阳性 CD 25 阴性或 CD 4 个阳性 CD 25 低 T 细胞中，一式三份，将 treg 添加到 B 行和标记为 treg 的孔中，仅以 1 比 10 的比例共培养，如图所示。然后将板在 37 摄氏度下放入 5% CO2 和饱和湿度的培养箱中孵育 72 小时。接下来，用一微居里氚化胸苷脉冲细胞，然后在共培养的最后几个小时掺入胸苷后，在 37 摄氏度下继续孵育 16 小时。

使用 Filter Mate Harvester 在多筛收集板上收获细胞。然后用预先装满闪烁液的透明塑料盖住收获板。最后读取每孔的 CPM。

使用闪烁计数器，该系统可以分离出高纯度的 T 细胞亚群，如以下一系列点图所示：CD 4 个阳性 CD 25 阴性 T 细胞显示在底部门中。在下图中，可以在此处看到高度纯化的 CD 4 个阳性 CD 25 低 T 细胞。纯种群流排序 CD 四阳性。

CD 25 高 Treg 电池显示在顶部栅极控制器中。通过胸苷掺入测量，来自健康受试者的 APC 和 treg 的单细胞类型培养物在背景上几乎没有增殖，而初始 CD 25 阴性和体内激活的 CD 25 低 T 细胞表现出显着的增殖，当这些反应细胞类型与 treg 细胞共培养时，这种增殖受到抑制。尽管观察到 tregs 抑制反应者幼稚 CD 25 阴性和体内活化 CD 25 低 T 细胞的能力略有不同。

这不是显著的控制。通过胸苷掺入测量，来自高危受试者的 APC 和 Treg 的单细胞型培养物在背景上几乎没有增殖。而与健康对照相比，初始 CD 25 阴性和 InVivo 激活的 CD 25 低 T 细胞表现出较低的增殖水平。

反应型 T 细胞被 treg 和共培养物进一步抑制，因为该测定可产生可靠的结果。我们还可以得出结论，低 CPM 值表明信号转导存在潜在缺陷，这应该在不同类型的研究中进一步研究。然而，在高危受试者中，tregs 抑制 CD 25 阴性与 CD 25 低反应 T 细胞的能力差异很大。

观看此视频后，您应该很好地了解如何顺利地连接所有必要的步骤，以便对健康受试者和免疫系统受损的受试者中是否存在 Tregs 进行成功可靠的功能测试。例如，在患有 1 型糖尿病的受试者中。