Name: 一个小鼠模型角膜血管生成研究掌上含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 了解小鼠角膜袋模型评估碱性成纤维细胞生长因子血管生成效应的方法。该实验通过在小鼠角膜制作袋状结构并植入碱性成纤维细胞生长因子颗粒，诱导新生血管从角膜缘血管向颗粒生长，为血管生成机制及治疗研究提供可靠实验模型。

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我们的研究由美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所的院内研究计划资助。

所有使用的仪器和试剂均为无菌。本方案已获美国国立眼科研究所/国立卫生研究院动物护理与使用委员会（ACUC）批准（动物实验方案编号 NEI-553），并依照美国国立卫生研究院（NIH）的指南与规定进行。
1. 制备含血管生成因子的微粒
在此步骤中，制备含有目标血管生成因子的颗粒。
 <ol>
 <li>用 PBS 配制 10% (w/v) 的硫糖铝溶液，室温保存。</li>
 <li>用无水乙醇配制 12% (w/v) 的聚羟基丙烯酸甲酯（poly-HEMA）溶液，室温保存。</li>
 <li>配制 1 μg/μl 的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）溶液，于 -80 °C 保存。</li>
 <li>为制备 50 个微球，取 5 μl poly-HEMA 溶液、1 μl 硫糖铝溶液和 4 μl bFGF 储存液混合，充分涡旋振荡。</li>
 <li>将一片洁净的 Parafilm 膜放入培养皿中，在组织培养超净台内用紫外光照射 15 分钟。每粒微球滴加 0.2 μl 混合溶液至 Parafilm 膜表面，因此 10 μl 混合溶液可制得 50 个微球。室温干燥 1–2 小时。干燥后的微球可在 4 °C 保存数天，或在 -80 °C 保存数月。</li>
 <li>使用时，用镊子尖小心撬起并夹取微球，注意避免破碎或弹跳丢失。</li>
</ol>
2. 小鼠角膜微囊实验的操作
在本部分中，我们将演示如何在小鼠角膜上制作一个囊袋，以及如何将药丸插入该囊袋中。药丸中所含的促血管生成因子将逐渐释放至角膜周围区域（图1）。本实验演示中采用8周龄雌性C57/Bl6小鼠。

 <ol>
 <li>小鼠通过腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）混合物进行深度全身麻醉。该麻醉状态可持续30–60分钟。将局部麻醉剂（0.5%盐酸丙帕卡因）滴于角膜表面。5分钟后，在体视显微镜下固定一只眼睛。</li>
 <li>在角膜缘向内1.2–1.4 mm处的角膜中央，使用冯·格雷费白内障刀（von Graefe cataract knife）进行一次非常轻柔的切口（如图1所示）。务必格外小心，避免切穿角膜。</li>
 <li>通过将刀片水平插入角膜中部，并小心地向角膜缘方向延伸，在角膜上皮层下方制作一个囊袋（图1）。囊袋的大小应足以容纳一个含有促血管生成因子的 pellet。操作时需格外小心，避免刺穿角膜。</li>
 <li>用镊子将药丸缓慢放入囊袋中，尽量将其压平。</li>
 <li>植入药丸后，将局部眼用抗生素软膏涂抹于眼部。在不同动物之间，仪器需用70%酒精棉片擦拭。</li>
 <li>将小鼠转移至温暖干燥的区域并进行监测，直至其能够维持直立姿势，然后将其放回原笼中。术后每天两次给予全身性镇痛剂（如布托啡诺，2 mg/kg，腹腔注射）和局部抗生素软膏（如庆大霉素），持续2天，并在术后密切观察小鼠3天。预计术后前48小时内完成愈合。在植入药丸后第4至10天期间，使用裂隙灯生物显微镜检查带有囊袋的眼部。</li>
 </ol>
3. 代表性结果
<ol>
 <li>在 pellet 植入后第 7 天，按照 2.1 节所述方法对小鼠进行全身及局部麻醉。</li>
 <li>在解剖显微镜下观察由促血管生成因子诱导的角膜血管。在溶剂处理的角膜中，未见血管生长（图 2A，溶剂处理角膜）。而在 bFGF 处理的角膜中，可见明显的血管生成（图 2B）。可通过测量血管的最大长度（从正常的角膜缘血管至新生血管顶端）以及总血管面积（图 2B 中以红色虚线标示的 bFGF 处理角膜区域）来评估血管生长情况。其他定量方法也已有报道2,5。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="角膜血管生成过程示意图，显示口袋形成及药丸植入，并标注各层结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. A. 经H&amp;E染色的正常角膜。正常角膜中不存在血管。B. 在角膜上皮层下方制作一个口袋。C. 将药丸植入该口袋中。D. 血管生成因子从药丸中释放，新生血管从正常的角膜缘血管长出。
<img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="角膜实验、血管生成示意图、载体对照组与bFGF处理组、示药丸及角膜缘血管。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 植入药丸后第五天的代表性结果。A. 植入仅含载体的药丸的角膜。角膜中无新生血管形成，仅可见原有的正常角膜缘血管。B. 植入含bFGF药丸的角膜。由原有的正常角膜缘血管处长出大量新生血管（点线标示）。

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

小鼠角膜囊袋实验模型最初由 Muthukkaruppan VR 和 Auerbach R 于 1979 年描述6。不同实验室已发表详细的实验方案2,3,7,8。我们实验室多年来在研究中对该方法进行了改良和应用4。小鼠角膜囊袋实验是一种相对简单且具有良好可重复性的模型。该模型的另一个优点是，由于角膜正常情况下无血管，因此本实验的背景信号极低。因此，该模型被广泛用于研究不同因子和分子的促血管生成作用。与某些较大动物（如大鼠和兔）的眼睛相比，小鼠的眼睛更小，操作难度更高。因此在进行该实验时需格外小心，尤其是在角膜上制作囊袋和插入药丸的过程中。操作刀具时必须精确控制，避免刺穿角膜。

<table><tbody><tr><td>解剖显微镜</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PZMIV-BS</td><td></td></tr><tr><td>Von Graefe 白内障手术刀（1.5×25 mm 刀片，平刃）</td><td>安布勒外科</td><td>3401E</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>裂隙灯</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td>30 SL-M</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt; 设备</td></tr><tr><td>bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>硫糖铝（八硫酸蔗糖）&amp;mdash;铝配合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0652</td><td>PBS 中的 10%</td></tr><tr><td>聚-HEMA（聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3932</td><td>12% 乙醇</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表2.&lt;/strong&gt; 试剂和材料</td></tr></tbody></table>

用于血管生成研究的角膜囊袋实验小鼠模型

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

正常的角膜不含血管组织。然而，当施加强效的促血管生成因子时，血管可被诱导在角膜中生长并存活1。这一特性使得角膜囊袋实验成为研究血管生成最常用的模型之一。角膜由多层细胞组成，因此可将含有目标促血管生成因子的药丸植入角膜，以研究其促血管生成作用2,3。本文中，我们逐步演示如何（I）制备含有促血管生成因子的药丸，（II）将药丸植入角膜，（III）分析目标促血管生成因子所诱导的血管生成。由于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是已知最强效的促血管生成因子之一4，本实验采用bFGF在角膜中诱导血管生成。

角膜的独特之处在于其缺乏血管组织。然而，通过强效的促血管生成因子，可在角膜中诱导出显著的血管生长与存活。因此，角膜可为我们提供一种研究血管生成的宝贵工具。本方案展示了如何开展小鼠角膜囊袋实验模型，以及如何利用该模型评估促血管生成因子所诱导的血管生成。

正常的角膜不含血管组织。然而，当存在强效的促血管生成因子时，血管可被诱导在角膜中生长并存活。

本实验的总体目标是利用小鼠角膜囊袋模型检测碱性成纤维细胞生长因子（basic FGF）的促血管生成作用。该方法通过在小鼠角膜中制作一个囊袋，并将含有碱性 FGF 的颗粒植入囊袋内。随后，碱性 FGF 从颗粒中释放，诱导来自角膜缘血管的新生血管生长。最终，该方案可诱导血管从角膜缘血管向碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）小球方向稳定生长。大家好，我是来自美国国立卫生研究院（NIH）Shiley 实验室的 Shuan。该模型的主要优势在于其具有相对简单的操作流程和较高的可重复性。另一个优点是，由于正常的角膜缺乏血管，背景干扰非常少。现在我们已经了解了该模型的基本思路。接下来，我将逐步向您展示如何构建角膜上皮疾病模型。那么，让我们开始吧。为准备此操作，配制以下溶液：10%（重量/体积）的明矾溶液和 PBS，12%（重量/体积）的聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）乙醇溶液，以及 1 µg/µL 的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。碱性成纤维细胞生长因子必须保存在 -80 °C 条件下，而其余两种溶液可室温保存。制备50个促血管生成因子小球：在200 µL的PCR管中加入5 µL的聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly hema）溶液、1 µL的sate溶液和4 µL的碱性成纤维细胞生长因子（basic FGF）溶液，然后涡旋充分混匀。将一小段parfum置于培养皿中，再将0.2 µL的混合液滴加到parfum上。每滴将干燥形成一个颗粒。让颗粒在室温下干燥一至两小时。干燥后的颗粒可在4摄氏度下保存数天，或在负80摄氏度下保存数月。使用药丸时，用镊子从参数中撬出，务必格外小心，避免将其折断或弹飞。用氯胺酮和赛拉嗪混合物麻醉小鼠后，使用移液器将50 µL的0.5%盐酸丙卡因滴加到角膜上。等待五分钟，然后将小鼠置于解剖显微镜下，使其中一只眼睛正对物镜。使用无菌的von grave白内障手术刀，在距离角膜缘约1.2至1.4毫米的角膜中央处轻轻做一切口。务必极其小心，避免切穿角膜。现在将手术刀水平插入切口，并小心地推进，以在角膜上皮层下方形成一个囊袋。制作的囊袋应足够大，以容纳一个碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释小丸。再次注意务必小心，避免刺穿角膜。将小丸放置在角膜上，并将其折叠两次。用镊子将颗粒缓慢插入囊袋中，然后用镊子尽可能将其压平以完成操作，再使用眼科尖头涂药器覆盖整个眼睛。涂抹局部眼科抗生素软膏后，将小鼠转移至温暖干燥的区域。当小鼠能够维持直立姿势时，在恢复期间每日两次将其放回其原有饲养笼中。在植入药丸后第4至10天，给予小鼠全身性镇痛剂（如丁丙诺啡）以及眼部局部抗生素软膏，然后将小鼠麻醉并检查眼睛。在裂隙灯或体视显微镜下观察，通过解剖显微镜可见由促血管生成因子诱导的角膜血管；而仅使用载体处理的角膜未见血管生成。经碱性成纤维细胞生长因子（basic FGF）处理的角膜未观察到血管生成迹象。新生血管的生长十分显著。通过测量正常角膜缘血管与新生血管顶端之间的最大长度来评估血管生长情况。同样，也测量了新生血管的总面积。您会发现，这是一种相对简单的操作。一旦掌握，单眼操作可在五分钟内完成。在进行该操作时需格外小心，尤其是在制作囊袋以及将垫片插入囊袋的过程中。操作刀具时必须精准，以免刺穿角膜。感谢您的关注，祝您好运。

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医学

一个小鼠模型角膜血管生成研究掌上含量

用于研究以下两方面的正常成年哺乳动物血管化组织：该组织不具有生理性血管生成，且未接受过外科干预；（i）在腹腔内给予试验物质后，血管生成的启动与发展过程；（ii）在系统性给予选定试验物质后，对血管生成的调控作用。...

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