Name: 长期培养的人类乳腺癌标本，并利用光学投影层析成像分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解利用光学投影层析成像技术长期培养人类乳腺癌标本的方法。该技术通过胶原基质培养原代肿瘤组织，实现三维生长模式的可视化与定量分析，为个体化药物反应评估提供研究工具。

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我们感谢 Lorna Renshaw（爱丁堡乳腺科）在获取临床标本方面提供的宝贵帮助。
使用肿瘤材料已获得洛锡安研究伦理委员会（08/S1101/41）的批准，并在实验癌症医学中心项目（爱丁堡）的授权下获取。
本工作由苏格兰资助委员会资助。A.D.L. 是玛格丽特·巴特斯·里基信托临床研究员。

1. 从大鼠尾部提取胶原蛋白
<ol>
<li>将冷冻的新鲜大鼠尾巴置于70%乙醇中。</li>
<li>用手术刀剥离表面皮肤，暴露肌腱。</li>
<li>将肌腱从尾巴上剥离，并放入70%乙醇中进行消毒。</li>
<li>称量收集的肌腱，转移至乙酸溶液中（每1g肌腱加入250ml 0.5M乙酸），在4°C下搅拌48小时。</li>
<li>将肌腱与乙酸的混合物在10,000g下离心30分钟，弃去沉淀。</li>
<li>向上清液中加入等体积的10%（w/v）NaCl溶液，于4°C静置过夜。</li>
<li>收集富含胶原的不溶性底层物质，并在10,000g下进一步离心30分钟。</li>
<li>将富含胶原的材料在4°C下重悬于0.25M乙酸中，然后在4°C下用1:1000稀释的乙酸溶液透析3天，每天更换透析缓冲液两次。</li>
<li>通过离心（20,000g，2小时）进一步灭菌胶原溶液，并在4°C下保存。</li>
<li>根据需要，加入无菌的1:1000乙酸溶液，将胶原溶液稀释至1mg/ml的储存浓度。</li>
</ol>

2. 三维检测构建
三维检测基于先前发表的细胞系检测方法2。
<ol>
<li>在同意接受根治性手术切除浸润性乳腺癌的患者手术时，采集多个组织核心活检样本。</li>
<li>肉眼观察下，使用手术刀将组织核心切成 1mm3 的小块。修剪并弃去肉眼可见的脂肪组织。</li>
<li>将组织小块浸入 MEGM 完全培养基中。组织可在该状态下保存最多 1 小时。</li>
<li>制备胶原凝胶时，于冰上按 3:5:1:1 的比例混合 1mg/ml 大鼠尾胶原蛋白、1:1000 稀释的过滤乙酸、10 倍浓度的 DMEM/F12 和 0.22M NaOH，最终获得 0.3mg/ml 的胶原蛋白浓度。</li>
<li>将 1.2ml 胶原混合液注入 24 孔板的各个孔中，放入 37 °C 培养箱孵育 10 分钟，以启动凝胶形成。</li>
<li>10 分钟后，从培养箱中取出 24 孔板。将肿瘤组织块置于正在凝固的胶原上，使用 10μl 移液器吸头轻轻将其推入凝胶中央。将 24 孔板重新放回培养箱中继续孵育 1 小时。</li>
<li>对于 ER+ 肿瘤，需在 MEGM 完全培养基中添加 β-雌二醇，使其浓度达到 3.2×10-10 M。当凝胶体系已凝固 1 小时后，小心向每孔加入 1.2ml 添加了上述成分的培养基。实验体系中的最终 β-雌二醇浓度将平衡至 1.6×10-10 M，以模拟乳腺组织中生理性的雌激素水平3。</li>
<li>使用 10μl 移液器吸头沿每个孔的内壁轻轻划一圈，使凝胶从孔壁周围松脱，从而使每个凝胶可在培养基中自由漂浮。将 24 孔板重新放回培养箱中继续培养。</li>
<li>每周更换两次添加了 β-雌二醇的培养基，直至实验结束。实验终止时，吸去培养基并加入甲醛固定液进行固定。</li>
</ol>

3. 光学投影断层扫描检测前的抗体染色
我们采用了一种先前发表的全样本染色方法4。
<ol>
<li>用 PBS 清洗福尔马林固定的样本 30 分钟。使用含 0.05% Tween 20 的 PBS（0.05% PBST）梯度稀释甲醇对凝胶进行逐步脱水处理：33%、66% 和 100%，每步至少 15 分钟。</li>
<li>将组织置于新配制的甲醇：DMSO：30%H2O2 溶液中（体积比为 2:1:3，即 15% v/v H2O2），室温孵育 24 小时，以淬灭自发荧光。</li>
<li>用甲醇清洗样本两次，每次 30 分钟。将样本在 -80°C 冷冻五次，每次至少 1 小时，然后恢复至室温（RT），以确保组织深层的抗原可被有效暴露。</li>
<li>使用甲醇作为稀释液，将组织逐步再水化至 0.05% PBST 溶液中（33%、66% 和 100%，每步 15 分钟）。</li>
<li>将组织在封闭液（含 10% 血清的 0.05% PBST）中封闭 24 小时。</li>
<li>使用兔抗细胞角蛋白一抗（浓度为 1:500）识别上皮成分，将其溶于含 5% DMSO 的 1.5 ml 封闭液中，与组织在 48 小时内孵育。</li>
<li>用 0.05% PBST 溶液清洗样本四次，每次 30 分钟。</li>
<li>将组织与荧光标记的二抗（1:100 山羊抗兔 Alexa555）在含 5% DMSO 的 1.5 ml 封闭液中稀释后，孵育 48 小时。</li>
<li>再次用 0.05% PBST 溶液清洗样本四次，每次 30 分钟。</li>
</ol>

4. 光学投影断层成像
光学投影断层成像是先前开发的一种显微技术，用于对厚度达15毫米的荧光生物样本生成高分辨率的三维图像5。
<ol>
<li>将染色后的凝胶置于1%低熔点琼脂糖中，用100%甲醇脱水24小时。用BABB溶液（1:2 苯甲醇:苯甲酸苄酯）透明处理48小时，然后使用OPT 3001M扫描仪（Bioptonics）进行扫描。</li>
<li>分别使用Cy3滤光片组（激发光：545nm/30 nm，发射光：610/75 nm）和GFP1滤光片组（激发光：425nm/40 nm，发射光：长通475 nm）捕获目标信号和自发荧光信号。</li>
</ol>

5. 重建与三维定量分析
<ol>
<li>通过 OPT 获取的一组角度投影可使用 NRecon 软件（SkyScan）进行重建，以生成侵袭实验的横截面切片序列。该软件可免费下载，网址为 <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a>。</li>
<li>使用 Volocity 软件（PerkinElmer）分析重建后的数据。免费试用版软件可在 <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> 下载。</li>
<li>为了通过细胞角蛋白染色定量上皮体积，需设定目标通道中体素强度的最小阈值，以减少背景荧光的干扰。我们根据经验将该阈值设定为 9000 a.u.。利用测量应用程序中提供的参数列表，定量与原始核心连续的上皮体积（在自发荧光通道中标记界定）。这使我们能够量化不同肿瘤样本之间上皮外生长的体积。</li>
</ol>

6. 代表性结果：
在检测方法的开发过程中，共使用了52例具有广泛组织病理学特征的乳腺癌活检样本。其中&lt;10%（5/52）的样本未能提供至少一个可用的侵袭性检测结果。检测失败的原因是细菌性继发感染或肿瘤活检组织量不足。因此，该检测方法的应用并不局限于特定类型的乳腺癌。
典型的检测（图1）在胶原培养20天后进行固定，随后对细胞角蛋白进行染色。Volocity软件能够识别与原始核心相连的上皮主体以及脱离的侵袭细胞团，并分别量化各自的体积。
<img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="上皮细胞自发荧光分析；三维模型显示核心与表面，显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 固定后进行侵袭实验及定量分析。该实验适用于多种乳腺癌亚型来源的样本：a) ER+ b) HER2+ 和 c) ER-。

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW 和 JF 供职于 MRC Technology，该公司正在商业化 Bioptonics OPT 扫描仪。其他作者声明无利益冲突。

目前，基于胶原蛋白的实验方法已被广泛用于研究癌细胞系的行为6,7,8。然而，这些实验方法尚未充分反映肿瘤及其微环境的复杂性。在本研究中，我们表明，人乳腺癌组织可用于类似的ex vivo（离体）实验。此外，光学投影断层成像（OPT）是一种可用于表征乳腺癌三维扩展的有效工具。我们发现，该技术的主要限制因素在于肿瘤组织的可获得性（单个穿刺活检样本足以进行4–6次实验）。另一个限制因素是，仅约40%的实验中可观察到结构性侵袭。为克服这一问题，我们通常在所有可见生长的实验中，于第7天左右定期加入任意所需的处理干预。
未来，OPT 的应用可进一步拓展，以检测整体性变化。 离体，由药物治疗引起。这反过来可能有助于实现更个性化的癌症治疗，而不依赖于动物模型。我们目前正在研究ER+肿瘤对他莫昔芬的反应 离体.

<table><tbody><tr><td>MEGM 完全培养基</td><td>Lonza 公司</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8900 10X1L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-&amp;#8211;雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875-250MG</td><td></td></tr><tr><td>兔抗角蛋白抗体</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa555 荧光二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">其余所有常规试剂均购自 Sigma-Aldrich。</td></tr></tbody></table>

人乳腺癌标本的长期培养及其通过光学投影断层成像技术的分析

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

乳腺癌是西方世界导致死亡的主要原因。众所周知，乳腺癌首先在局部、随后在远端的扩散是影响患者预后的重要因素。乳腺癌的实验研究系统通常依赖于来源于原发性肿瘤或胸腔积液的细胞系。该研究领域面临两大主要障碍：（i）某些已知的乳腺癌亚型（尤其是预后较差的管腔B型肿瘤）在现有的细胞系库中尚未得到代表；（ii）肿瘤微环境的影响通常未被纳入考虑。
我们展示了一种用于培养所有亚型原发性乳腺癌标本的技术。该技术通过三维（3D）培养系统实现，将肿瘤小块包埋于软性大鼠I型胶原凝胶中。在2至3周内，肿瘤细胞向胶原中扩散，并形成多种结构，类似于在人类肿瘤中所观察到的形态1。组织学检查显示，原始组织核心中存在存活的脂肪细胞、上皮细胞和成纤维细胞。具有鳞状形态的恶性上皮细胞可见侵入周围胶原基质，这些细胞中可见明显的核多形性，以及有丝分裂相和凋亡小体。
我们采用了光学投影断层扫描技术（OPT）这一三维成像技术，以量化体外培养中肿瘤扩散的程度。我们利用OPT测量了肿瘤培养物的整体体积，该参数在乳腺癌患者的术前新辅助治疗中 routinely 用于评估药物治疗的疗效。
在此，我们提供了一种无亚型偏好地培养人类乳腺肿瘤并量化其扩散的方法 离体该方法未来可用于量化原发性肿瘤对药物的敏感性，可能提供比目前常用细胞系更具预测性的模型。

我们开发了一种基于胶原蛋白的 体外 一种可促进所有乳腺癌亚型样本增殖和侵袭的检测方法。采用光学投影断层扫描技术（一种三维显微成像技术）对肿瘤扩展进行可视化和定量分析。该检测方法可用于量化个体肿瘤样本对药物的反应。

乳腺癌是西方国家死亡的主要原因。众所周知，乳腺癌的扩散首先在局部发生，随后……

本实验的总体目标是建立原发性乳腺癌组织的长期培养，并量化其三维生长模式。首先从大鼠尾部提取I型胶原蛋白，然后制备癌组织活检样本，并将其包埋于胶原基质中。培养20天后，对乳腺癌组织进行免疫荧光染色，并使用光学投影断层扫描技术进行扫描，随后对数据进行重建和定量分析。最终可获得显示个体肿瘤侵袭模式的结果，这些结果还可通过三维分析进一步量化。离体培养的主要优势在于其在生理环境下使用真实的癌症组织材料。与细胞系培养不同，该技术的可视化演示非常重要，因为获取原代癌组织较为困难。正确的操作技术将最大限度地提高实验成功的可能性。本技术的演示将由我本人以及来自 MRC Technology 的 Joanne Farrell 共同完成，以开始提取 I 型胶原蛋白。将冷冻的大鼠尾巴置于70%乙醇中，直至完全解冻。使用解剖刀剥离表面皮肤以暴露肌腱，将肌腱从尾部剥离后放入70%乙醇中进行消毒。称量收集的肌腱，并将其转移至乙酸中。在 4°C 下搅拌 48 小时。接着，将肌腱醋酸混合物在 10,000 ×g 条件下离心 30 分钟，并弃去沉淀。向S上清液中加入等体积的10%氯化钠溶液，于4摄氏度下静置过夜。用移液管吸除并弃去上层液体，收集富含胶原的不溶性底层沉淀，于10,000 × g离心30分钟。随后在4 °C条件下，用0.25摩尔的乙酸重新悬浮富含胶原的材料，并移液至透析袋中。在4 °C条件下，用1至1000倍体积的乙酸透析三天。每天更换两次透析缓冲液。胶原蛋白可通过额外的离心步骤以及在乙酸中重悬以进一步灭菌，用于本检测。从接受根治性手术切除侵袭性乳腺癌并签署知情同意书的患者中，获取多个穿刺活检组织，通过肉眼观察并使用手术刀进行处理。将组织切成1 mm³大小的碎块，剔除并弃去肉眼可见的脂肪组织。将样本固定在手术刀片上，便于在生物安全柜内更清晰地观察，使解剖操作更准确、更安全。将组织碎块浸入MEGM完全培养基中。组织可在该状态下保存长达一小时，以制备浓度为0.3毫克/毫升的胶原凝胶混合物。将冰上预冷的混合物包含1毫克/毫升大鼠尾胶原、1:1000稀释的过滤乙酸、10倍体积的D-M-E-M-F12以及0.22摩尔的氢氧化钠。用移液器将1.2毫升胶原混合物加入24孔板的各个孔中，并将该板置于37摄氏度的培养箱中孵育10分钟。为启动凝胶化过程，从培养箱中取出培养板。将肿瘤组织块置于凝胶化的胶原中，使用10微升移液器吸头轻轻将其推入凝胶中心。将培养板放回培养箱中孵育1小时。在A-M-E-G-M完全培养基中添加β-雌二醇，使其终浓度为3.2 × 10⁻¹⁰ 摩尔。凝胶检测孵育一小时后，小心向每个孔中加入1.2毫升添加了补充成分的培养基。最终的β-雌二醇浓度将平衡至1.6 × 10⁻¹⁰ 摩尔，以模拟乳腺组织中生理性的雌激素水平。用10微升移液器枪头沿每个孔的内边缘绕行一圈，使凝胶从孔壁周向释放，从而让每个凝胶在培养基中自由漂浮。将24孔板放回培养箱，每周两次更换补充培养基，直至实验结束。可在此期间使用明场显微镜实时观察侵袭性生长。通过延时拍摄并扩展焦深的视频显示，在第7天至第9天共60小时期间，肿瘤边缘的上皮细胞向周围胶原侵袭的过程。通过移除培养基并加入固定液来终止实验，对3D检测样品进行48小时固定，以用于光学投影断层扫描的免疫染色。首先将固定后的样本从孔板转移至小瓶中。然后用 PBS 清洗 30 分钟。使用含 0.05% Tween 20 的 PBS 配制的甲醇对凝胶进行梯度脱水，随后将组织置于新配制的甲醇-DMSO-30% 过氧化氢溶液（体积比为 2:1:3）中，室温孵育 24 小时，以淬灭自发荧光。接着，将样品清洗两次，每次 30 分钟。在甲醇冻融过程中，将样品从零下80摄氏度至室温反复冻融五次，每次至少一小时，以确保组织深层的抗原得以暴露。随后使用甲醇作为稀释剂，将组织用含0.05%Triton X-100的PBS溶液逐步复水，于20倍体积中进行；将组织在封闭液中4摄氏度孵育24小时以识别上皮成分；将样品在含有5%DMSO的1.5毫升封闭液中稀释的兔抗角蛋白一抗溶液中，4摄氏度孵育48小时。用含0.05%Triton X-100的PBS溶液洗涤样品，每次30分钟，共洗涤24次。将组织在含有5% DMSO的1.5毫升封闭液中，与荧光二抗孵育，4°C条件下孵育48小时。用含0.05% Tween 24的PBS溶液再次洗涤样本，每次30分钟，共洗涤24次。为进行光学投影断层成像样品制备，将染色凝胶置于1%低熔点琼脂糖中固定，并在100%甲醇中脱水24小时。接下来，用 BABB 溶液对样本进行 48 小时的透明处理。使用 OPT 3001 M 扫描仪扫描样品。分别采用 SI three 和 GFP one 滤光片组捕获目标信号和自发荧光信号。将标本置于透明的aro凝胶圆柱中，并以0.9度为步长进行角度旋转。在400个不同的旋转位置上，分别采集标本静止状态的数字图像。使用n recon软件，通过在侵袭实验中生成一系列横截面切片，重建在OPT中获取的角度投影数据集。使用速度分析软件通过细胞角蛋白染色对重建的数据进行分析，以量化上皮体积。设定最低体素强度阈值，以减少目标通道中背景荧光的干扰。此处，该阈值根据经验定义为9,000个任意单位。最后，利用检测应用程序中可用的参数列表以及来自自发荧光通道的数据，该通道可界定与原始核心连续的上皮组织，从而定量肿瘤出芽中上皮的体积。此处展示的是在胶原培养中固定20天后、并随后进行细胞角蛋白染色的典型实验。Velocity软件能够识别与原始核心相连的上皮主体以及脱离的侵袭性细胞团，并分别量化各自的体积。获取的原始活检组织来自多种肿瘤，经离体培养后获得。研究者也可采用其他技术，如免疫组织化学或免疫荧光，来测定细胞增殖或凋亡率，或其他类似指标。该技术的发展使得转化型乳腺癌研究领域的科研人员能够探索识别乳腺癌患者个体化药物耐药性的方法。

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生物学

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