测绘激光扫描Photostimulation抑制神经回路

该程序的总体目标是研究抑制性神经元回路的局部功能组织。该过程从小鼠的初级体感皮层准备活的脑切片开始。下一步是从脑切片中表达 GFP 的靶向抑制细胞类型中可视化和记录。

在通过谷氨酸进行这种激光扫描光刺激之后，解笼用于激活突触前神经元的小簇作为兴奋性或抑制性。突触后电流记录在表达 GFP 的神经元间。最后一步是通过光刺激、数据分析，并生成记录神经元的突触输入的定量图。

最终，激光扫描光刺激与全细胞记录相结合，能够构建特定类型抑制性神经元的突触输入的详细图谱，这可能允许确定局部抑制性皮层回路的组织和功能。基于光刺激的技术由 Larry Katz 博士、Ned Calloway 博士开创，并由 Carols Waboda 博士进一步发展，我的 pi，Xing Z 博士与索尔克研究所的 Calloway 博士一起培训，在那里他领导了许多调查口间回路的研究。我们小组目前正在扩展和继续这些研究，调查口间回路。

要开始此过程，请在出生后 2 至 3 周通过斩首处死转基因小鼠，并迅速取出大脑，将大脑置于冷冻和含氧的切割溶液中。然后使用 GFP 护目镜目视筛查大脑并检查 GFP 表达。接下来，用振动器将初级体感皮层切成 400 微米厚的切片。

在含有 A CSF 的蔗糖中，用 95%O2 和 5%CO2 在 32 摄氏度下孵育切片 30 分钟到 1 小时。之后，在室温下将切片转移到常规 A CSF 中，让激光器为实验做好准备，打开激光冷却系统和电源。然后打开与光刺激控制相关的所有硬件，包括扫描镜系统和光学调制器和电子快门，以及光电二极管输入放大器。

接下来打开电生理设备，例如 multi clamp 700 B 放大器和微型纵器。电生理记录、光刺激和成像在安装在显微镜电动载物台上的切片灌注室中进行。之后，打开成像相机，切片将通过成像系统在带有红外 DIC 和 epi 荧光光学元件的正置显微镜中可视化。

然后在显示器上打开基于 MATLAB 的 FS 软件和 Q capture 相机软件。在运行实验之前，请检查激光光刺激系统并确保其处于工作状态。在四个 x 显微镜物镜下放一张纸，以便在系统运行时观察激光扫描模式。

要使微电极具有 4 到 6 兆 OM 电阻，请用移液器拉出器拉动玻璃电极。然后用含有 0.1% 生物素的内部溶液填充电极，用于细胞标记和形态学鉴定。接下来，打开加压灌注系统，将 A CSF 泵入腔室。

确保腔室中切片上方 2.0 毫米的恒定液位。将 MNI 笼状谷氨酸储备液的等分试样添加到 25 毫升循环 A CSF 中，浓度为 0.2 毫摩尔笼状谷氨酸。然后将一个脑切片转移到记录室。

运行成像系统以检查切片质量并在解剖学上定位主要体感区域。接下来，用定制的带串铂环固定切片，并注意不要将锚点放在用于录制的大脑区域上。基于 DIC 荧光显微镜下 GFP 表达的可视化，用 60 x 物镜可视化细胞。

识别并选择抑制性细胞类型。请注意，录制将在红外 DIC 辅助的视觉控制下进行。在将电极降低到目标电池时，需要视频监控和 DIC 和荧光模式之间的切换以确认 GFP 池的位置。

使用传统的膜片钳技术。首先，对电极施加正压。将其靠近细胞表面，以在目标细胞膜上建立一个可识别的凹坑。

然后快速施加负压，在电池中形成千兆密封和断裂，同时在视频监视器上监控电流注入响应。闯入后，在 DIC 和荧光模式下以 60 倍放大倍率拍摄记录的表达神经元内的 GFP 的图像以进行在线验证。在收集光刺激数据之前，注入超极化和去极化电流脉冲以检查每个细胞的基本电生理特性。

一旦稳定，就可以以良好的访问电阻实现全细胞记录，通常小于 20 兆欧姆，将显微镜物镜从 60 倍放大倍切换到 4 倍放大倍率以进行激光扫描光刺激，以 4 倍放大倍率获取切片图像，并将其用于引导和记录光刺激部位。通过激活 phys 的 configuration switch 模块来设置光刺激和数据采集参数。使用大约 20 毫瓦的 1 毫秒激光脉冲，刺激间隔为 1 秒。

对于光刺激映射，获取以 10 kHz 采样的一秒数据轨迹。接下来，将 4 个 x 切片图像加载到 phys 的 mapper 模块中。定义胞体的位置，并设置16 x 16模式的光刺激部位，尺寸为80，微米x 80微米。

单元格位置周围的间距，覆盖所有皮质层。然后通过在电流钳模式下检查响应光刺激的尖峰位置来绘制记录神经元的激发曲线。我们的用户友好型软件具有在线显示功能，有助于进行动态分布验证实验。

之后，通过检测来自记录细胞的兴奋性突触后电流来映射局部兴奋性电路连接 通过激光扫描在不同位置，将细胞保持在负 70 毫伏tage 钳模式以检测向内的兴奋性电流。然后重复兴奋性突触后电流图两到三次，光刺激模式旋转或翻转。为了映射局部抑制回路连接，从记录的细胞中检测抑制性突触后电流。

在这种情况下，将电池保持在接近零毫伏的水平，在电压钳位模式下保持负 15 毫伏，以检测向外的抑制电流。完成所有生理测定后，轻轻地从记录的细胞中取出电极。从腔室中取出脑切片，然后将其固定在 4% 对位甲醛中过夜，并用生物素对记录的细胞进行染色。

在本实验中，结合 GFP 表达、内在电生理学和形态学特征对抑制性神经元进行分类。显示。以下是示例和原始数据映射，以说明激光扫描光刺激，它允许将局部皮质回路连接广泛映射到记录的抑制神经元。以下是从图 D 中所示的原始轨迹得出的颜色编码定量输入图的示例.在记录的神经元间检测到的突触事件的振幅是颜色编码的，并在地形上叠加在光刺激位置上。

单元体位置由比例尺中的红色空心圆圈表示。暖色表示强突触输入，冷色表示与目标细胞的连接较弱或没有连接。同样，图 E 显示了记录的神经元每个采样解笼位置的突触事件数。

图 F 显示了在比例尺中记录的光刺激后第一个检测到的突触事件的开始时间。暖色表示输入较短，延迟较冷，较冷的颜色表示较长的突触延迟。因此，LSPS 能够构建影响特定类型抑制性神经元的位置、强度、潜伏期和输入数量的详细映射。

好吧，参加这个程序，重要的是要有耐心，做一个干净的实验条件，但神经元要有效且非常小心地从物体的高放大倍率转变为低修饰。然后最后用 land 软件非常好。