Name: 测绘激光扫描Photostimulation抑制神经回路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学习激光扫描光刺激结合全细胞记录技术，用于绘制转基因小鼠体感皮层抑制性神经元的局部突触回路图谱。该方法可定量分析突触输入的空间分布与功能特性。

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感谢Tran Huynh、Andrew San Antonio和Jerry Lin提供的技术协助。本研究由美国国立卫生研究院资助，项目编号为DA023700和DA023700-04S1，授予X.X.。

1. 脑切片制备
<ol>
 <li>用戊巴比妥钠（>100 mg/kg，腹腔注射）深度麻醉转基因小鼠，迅速断头，并将脑组织取出至冰冷且充氧的切片液中。</li>
 <li>使用GFP护目镜进行肉眼筛选，以确认小鼠脑组织是否确实表达GFP。</li>
 <li>在含蔗糖的人工脑脊液（ACSF）中，使用振动切片机切割得到400 μm厚的初级躯体感觉皮层切片。切片首先在含蔗糖的ACSF中32°C孵育30分钟至1小时；初始孵育结束后，转移至室温下的记录用ACSF中。在整个孵育和记录过程中，切片持续通入95% O2-5% CO2混合气体。</li>
</ol>
2. 仪器启动
整体系统实现如图1所示。
<ol>
 <li>打开激光冷却系统和电源，使激光器进入准备状态。</li>
 <li>开启所有与光刺激控制相关的硬件设备（包括扫描镜系统、光学调制器、电子快门和光电二极管输入放大器）。</li>
 <li>开启电生理设备（包括Multiclamp 700B放大器和显微操作器）。电生理记录、光刺激以及脑片样本的成像均在安装于显微镜电动载物台上的脑片灌流室中进行。</li>
 <li>开启成像相机（Retiga 2000，Q-imaging，Austin，TX）。通过直立显微镜（BW51X，Olympus）结合红外微分干涉差（DIC）和落射荧光光学系统，利用成像系统观察脑片。</li>
 <li>启动基于Matlab的EPHUS软件和Q-capture相机软件。使用经过自定义修改的Ephus软件版本（Ephus，可从<a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a>获取）来控制光刺激方案并采集光刺激数据。</li>
 <li>系统启动后，应检查激光光刺激系统是否处于正常工作状态。由于使用4倍物镜传递紫外闪光以实现谷氨酸解笼，可在物镜下方放置一张白纸，在系统运行时观察激光扫描模式。</li>
</ol>
3. 设置切片灌注
<ol>
 <li>启动加压灌流系统，将记录用人工脑脊液（ACSF）泵入切片室。需注意保持切片室中液面恒定，高出切片约 2.0 mm。</li>
 <li>取一份谷氨酸MNI光笼锁化合物（MNI-caged-glutamate）储备液加入 25 ml 循环ACSF中，使光笼锁谷氨酸终浓度为 0.2 mM。请注意，实验进行 5–6 小时后，需更换浴液和MNI-谷氨酸溶液。</li>
 <li>将脑切片转移至记录室。可运行成像系统检查切片质量，并在解剖学上定位初级躯体感觉区。随后使用自制的带弦铂金丝环固定切片。注意避免将固定环压在拟用于记录的脑区上。</li>
</ol>
4. 全细胞膜片钳记录
<ol>
 <li>使用拉制的玻璃电极（电阻为4-6 MΩ），并用含0.1% 生物胞素的内液灌注，用于细胞标记及形态学鉴定。</li>
 <li>进行膜片钳记录时，使用60倍物镜观察细胞。首先在DIC/荧光奥林巴斯显微镜下通过观察GFP表达来识别并选择抑制性神经元类型；随后在红外DIC视频监控辅助下进行可视化记录。请注意，在将电极接近目标细胞的过程中，需多次切换DIC与荧光模式，以确认GFP阳性细胞的位置。</li>
 <li>采用常规膜片钳技术。电极充以正压，移近细胞表面，使目标细胞膜上形成可见的凹陷；随后迅速施加负压，以形成吉欧封接（gigaseal）并破膜，同时在视频监视器上监测电流注入的响应。</li>
 <li>破膜后，采集目标细胞在60倍物镜下DIC与荧光模式的图像，用于在线验证。在采集光刺激数据前，注入超极化和去极化电流脉冲，以检测每个细胞的基本电生理特性。</li>
 <li>当获得稳定的全细胞记录且通路电阻良好（通常&lt;20 MΩ）后，将显微镜物镜从60倍切换至4倍，用于激光扫描光刺激。获取4倍下的脑片图像，用于引导和注册光刺激位点。</li>
</ol>
5. 激光扫描光刺激
<ol>
 <li>通过激活Ephus的配置开关模块来设置光刺激和数据采集参数。通常采用1毫秒激光（20毫瓦），刺激间隔为1秒，用于光刺激定位。以10 kHz采样率采集持续1秒的数据轨迹。</li>
 <li>将4倍放大下的脑片图像载入Ephus的定位映射模块。确定细胞胞体的位置，并在该细胞周围设置16×16阵列的光刺激位点（间距为80 μm × 80 μm），覆盖所有皮层层级。</li>
 <li>通过在电流钳模式下检测光刺激引发的动作电位位置，绘制所记录神经元的兴奋性反应图谱。我们用户友好的软件具备实时显示功能，有助于定位映射实验的进行。</li>
 <li>通过在不同位置进行激光扫描并检测所记录细胞的兴奋性突触后电流（EPSC），绘制局部兴奋性环路连接图。在电压钳模式下将细胞钳制在-70 mV，以检测向内流动的兴奋性电流。重复2-3次EPSC图谱记录，并对光刺激模式进行旋转或翻转以提高可靠性。</li>
 <li>可选步骤：也可通过在电压钳模式下将细胞钳制在接近0 mV，检测向外流动的抑制性突触后电流（IPSC），从而绘制局部抑制性环路连接图。请注意，进行IPSC定位映射时，最好使用以铯离子替代钾离子的电极内液。</li>
 <li>完成所有生理学检测后，轻柔地将电极从所记录的细胞中撤出。取出脑片并在4%多聚甲醛中固定过夜。利用链霉亲和素标记对所记录细胞进行生物胞素染色，通过共聚焦或落射荧光显微镜观察细胞形态，以确认每个记录的细胞确实是最初靶向的表达GFP的中间神经元。</li>
</ol>
6. 光刺激数据的分析
我们新开发的方法学和软件实现11被应用于原始数据图中光刺激诱发的突触事件的检测与测量。如图2所示，通过构建颜色编码图来展示记录神经元突触输入的空间分布模式。
7. 代表性结果：
电生理记录与光刺激定位成像的示例结果如图2所示。通过使用在已知抑制性细胞类型中表达GFP的转基因小鼠，可实现对特定抑制性细胞类型的靶向记录。鉴于抑制性中间神经元具有高度多样性，本研究结合GFP表达分析、内在电生理特性及形态学特征（图2A），最终确定细胞类型分类。图2B-C表明，激光扫描光刺激技术能够对单个抑制性神经元的局部皮层环路连接进行广泛 Mapping。原始数据图谱如图2C所示，其中直接解笼响应未纳入数据分析（图2C）。定量输入图谱采用颜色编码，如图2D-F所示。示例中的快速放电型抑制性中间神经元从第4层及更深层接收强烈的兴奋性突触输入（EPSCs）。通过将细胞的突触输入分布模式与明确定义的皮层通路相关联，可推断其在皮层信息处理中的潜在作用（例如反馈性与前馈性抑制）。
<img alt="用于激光扫描光刺激与电生理的紫外激光装置；详细说明光学元件的示意图。" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 激光扫描光刺激系统的总体仪器配置。 我们的整体系统包括光刺激控制、视频成像和电生理记录系统。我们采用了先前描述的LSPS系统设计7,17。使用一个激光单元产生355 nm紫外激光，用于谷氨酸解笼。激光束通过系统的光路传输。通过电光调制器（即Pockels盒）和机械快门控制激光脉冲的短时持续时间（例如1–3 ms）。激光束功率通过中性密度梯度轮进行调节，并利用玻璃盖片将一小部分激光束偏转至光电二极管进行监测。激光扫描系统包括一对X-Y扫描镜、扫描透镜、管镜和物镜。扫描镜将激光束引导通过扫描透镜，随后激光束经由二向色镜进入显微镜，并由定制的紫外透射管镜聚焦。激光束未完全充满显微镜物镜的后光瞳，从而形成更接近柱状（而非锥状）的照明光束，通过降低轴向分辨率使映射尽可能保持二维特性。在4倍物镜下，激光束形成的解笼光斑在焦平面上的横向宽度约为153 μm，近似高斯分布（见插图）。通过由检流计驱动的XY扫描镜可实现多种激光刺激位置，由于扫描镜与物镜后光瞳位于共轭平面，镜片位置的变化可转化为物镜焦平面上不同的扫描位置。在解笼过程中，以非光栅、非随机的顺序依次刺激覆盖整个视野的多个特定模式位点，避免重复刺激最近已激活位点的邻近区域。更多详细信息请参见Xu et al. (2010)。
<img alt="显示EPSC振幅、数量和潜伏期图以及神经元定位的电生理学实验。" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 小鼠初级感觉皮层第4层表达GFP的快速放电中间神经元局部兴奋性环路连接的定位。 A1和A2显示在活体脑片中通过60倍物镜观察到的目标细胞的微分干涉差（DIC）图像和GFP荧光图像，A3显示记录后经生物胞素染色固定的脑片中揭示的细胞形态。A4显示记录的GFP细胞在不同强度胞体内电流注入下的放电模式，具有快速放电抑制性中间神经元的典型特征。B显示叠加了16×16个光刺激位点（*）的脑片图像，细胞位置由小的红色圆圈指示。C显示来自B图中所示刺激位点的光刺激诱发反应迹线阵列，记录时细胞钳制在-70 mV以检测内向兴奋性电流。位置1和2的迹线示例（插图中单独放大显示）展示了不同类型的光刺激反应：迹线1为谷氨酸在细胞体和近端树突解笼时产生的直接反应（红色箭头所示）；其他迹线2为典型的兴奋性突触输入反应（蓝色）。直接反应与突触输入可通过其振幅和反应潜伏期加以区分。D、E和F分别为C图所示原始数据图的平均EPSC振幅、EPSC数量以及每站点首次检测到的EPSC潜伏期的编码彩色图（16×16位点）。每个刺激位点的平均输入振幅为分析时间窗内EPSC振幅的均值，已从同一站点的光刺激反应中减去基线自发反应。每个位点的EPSC数量及首个检测到的EPSC到达时间（潜伏期）也被测量并绘图。更多细节请参见（Shi et al., 2010）。

<ol><li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology%3A+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons%3A+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li>
<li>Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+sources+of+synaptic+input+to+cortical+inhibitory+interneurons+and+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 3, 701-707 (2000).</li>
<li>Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-scale+specificity+of+cortical+networks+depends+on+inhibitory+cell+type+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity.</a> Nat Neurosci. 8, 1552-1559 (2005).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li>
<li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li>
<li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li>
<li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li>
<li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

基于光刺激的定位技术已成功应用于皮层环路的分析。将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合，可实现对单个神经元突触前输入源在皮层各层中分布的高分辨率定位，因为通过同时记录突触后神经元的反应，并在多个不同位置光刺激突触前神经元集群，能够定量评估兴奋性或抑制性输入的空间分布。该技术结合表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠（其特定抑制性神经元类型已知），极大促进了我们当前对局部抑制性皮层网络的研究。在本示例研究中，我们使用笼锁型谷氨酸盐，通过激光解笼在空间上精确地激活神经元。需要注意的是，谷氨酸解笼可被通道视紫红质或其他基因编码的光敏分子在特定细胞类型中的光激活所替代12,13。因此，光刺激技术不仅可靶向特定皮层区域，还可靶向参与环路的特定神经元亚群14-16。此外，我们近期开发了一种新的基于光刺激的定位技术9，该技术结合了激光扫描光刺激所能实现的高空间精度，以及电压敏感性染料成像所能实现的快速、高时间分辨率的网络活动检测。与将全细胞记录与光刺激结合以定位单个记录神经元的局部环路输入不同，这一创新技术可用于在神经元群体水平上定位皮层环路的输出及功能连接。

<table><tbody><tr><td>转基因小鼠品系</td><td>杰克逊实验室或其他来源</td><td></td><td>请参阅Xu和Callaway（2009）</td></tr><tr><td>GFP 护目镜</td><td>BLS有限公司，匈牙利</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>徕卡系统</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>MNI 光笼型谷氨酸（4-甲氧基-7-硝基吲哚啉基-光笼型 L-谷氨酸）</td><td>Tocris Bioscience，Ellisville，MO</td><td>货号 1490</td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td></td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>用于制作电极的玻璃管</td><td></td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 放大器</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>数字CCD相机</td><td>Q-imaging，德克萨斯州奥斯汀市</td><td>Retiga 2000</td><td></td></tr><tr><td>研究显微镜</td><td>奥林巴斯，日本东京</td><td>BW51X</td><td></td></tr><tr><td>紫外激光单元</td><td>DPSS Lasers，美国加利福尼亚州圣克拉拉</td><td>model 3501</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描光刺激的其他设备</td><td></td><td></td><td>请参考 Xu &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; (2010)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;溶液：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt;&lt;李&gt;含蔗糖的人工脑脊液（ACSF），用于脑片切割（单位：mM：85 NaCl，75 sucrose，2.5 KCl，25 glucose，1.25 NaH₂PO₄，24 NaHCO₃，0.5 CaCl₂，7 MgCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，4 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，以及 24 NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;).&lt;/li&gt;&lt;李&gt;记录用人工脑脊液（ACSF，单位：mM：126 NaCl，2.5 KCl，26 NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，2 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，2 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，以及10葡萄糖）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;电极内液（单位：mM：126 K-葡萄糖酸盐，4 KCl，10 HEPES，4 ATP-Mg，0.3 GTP-Na 和 10 磷酸肌酸；pH 7.2，300 mOsm）。&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

通过激光扫描光刺激绘制抑制性神经元环路

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

抑制性神经元对皮层功能至关重要。它们约占整个皮层神经元群体的20%，并可根据其免疫化学、形态学和生理学特性进一步细分为多种亚型1-4。尽管以往的研究已揭示了不同类型抑制性神经元内在特性的诸多方面，但关于它们局部环路连接的知识仍相对有限3,5,6。鉴于单个神经元的功能由其在皮层环路中的兴奋性和抑制性突触输入所决定，我们一直采用激光扫描光刺激（LSPS）技术来绘制特定抑制性神经元亚型的局部环路连接图谱。与传统的电刺激或谷氨酸喷射刺激相比，LSPS具有独特优势，能够对单个记录神经元的局部功能性输入进行广泛绘制和定量分析3,7-9。通过谷氨酸解笼技术进行的激光光刺激可选择性地在胞体周围激活神经元，而不激活穿行轴突或远端树突，从而保证了亚层水平的映射分辨率。LSPS在大范围区域内对多个刺激位点输入进行检测的高灵敏度和高效率，使其非常适用于皮层环路分析。
本文介绍了结合全细胞膜片钳技术的局部光解激活（LSPS）方法，用于局部抑制性神经环路的绘制。通过使用在皮层有限抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠3,10，可实现对特定抑制性细胞类型的靶向记录，从而稳定采样目标细胞类型，并明确鉴定所记录细胞的类型。关于LSPS环路作图，我们概述了系统的仪器配置，描述了实验流程与数据采集方法，并展示了在小鼠初级躯体感觉皮层中进行环路作图的实例。如本实验所示，通过紫外激光光解，在脑片的空间限定区域内激活笼锁型谷氨酸；同时进行的电压钳记录可检测光刺激诱发的突触反应。通过扫描激光束刺激数百个潜在的突触前位点，可生成靶向神经元的兴奋性或抑制性突触输入图谱。因此，LSPS技术可通过重复实验，构建特定类型抑制性神经元所接收的突触输入的详细图谱。综上所述，基于光刺激的技术为神经科学家提供了一种强大的工具，用于解析局部皮层环路的功能性组织结构。

本文介绍了一种将激光扫描光刺激与全细胞记录相结合的方法，用于在特定抑制性神经元群体中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠。该技术可实现对特定皮层抑制性神经元局部突触环路的广泛定位和定量分析。

抑制性神经元对皮层功能至关重要。它们约占整个皮层神经元群体的20%，并可进一步细分为……

本实验的总体目标是研究抑制性神经元环路的局部功能组织。实验首先从鼠类初级躯体感觉皮层制备活体脑切片，随后在脑切片中对表达 GFP 的特定抑制性神经元类型进行可视化观察和记录。通过谷氨酸进行激光扫描光刺激后，利用光解技术激活小簇的突触前神经元，使其产生兴奋性或抑制性反应。在表达GFP的中间神经元中记录突触后电流。最后一步是完成光刺激、数据分析，并生成突触输入到所记录神经元的定量图谱。最终，激光扫描光刺激结合全细胞记录技术能够构建特定类型抑制性神经元突触输入的详细图谱，从而有助于确定局部皮层抑制性环路的组织结构与功能。该光刺激技术由 Larry Katz 博士和 Ned Calloway 开创，并由 Carols Waboda 博士进一步发展。我的导师 Xing Z 博士曾在索尔克研究所（the Salk Institute）师从 Calloway 博士，主导了多项关于口周环路的研究。目前，我们课题组正在延续并拓展这些研究，深入探索口周环路的结构与功能。开始此操作时，通过断头法处死一只出生后两周至三周的转基因小鼠，并迅速取出脑组织，将脑组织置于冰冷且充氧的切割溶液中。然后使用GFP护目镜对脑组织进行肉眼筛选，检测GFP表达情况。接着，用振动切片机将初级躯体感觉皮层切成400 µm厚的切片。将脑片置于用95% O₂和5% CO₂混合气体饱和的含蔗糖人工脑脊液（A CSF）中，在32摄氏度下孵育30分钟至1小时。随后，将脑片转移至室温下的普通A CSF中。准备实验所需的激光系统：开启激光冷却系统和电源，启动与光刺激控制相关的所有硬件设备，包括扫描镜系统、光调制器、电子快门以及光电二极管输入放大器。接着打开电生理设备，例如 Multi Clamp 700 B 放大器和显微操作器。电生理记录、光刺激和成像均在安装于显微镜电动载物台上的切片灌流室中进行。随后，打开成像相机，通过成像系统可在直立显微镜下利用红外微分干涉差（DIC）和落射荧光光学技术观察切片。然后在显示器上打开基于 MATLAB 的 FS 软件和 Q Capture 相机软件。实验运行前，检查激光光刺激系统，确保其处于正常工作状态。在四倍显微镜物镜下方放置一张纸，观察系统运行时的激光扫描模式。为了制备具有四到六兆欧电阻的微电极，使用移液管拉制仪拉制玻璃电极。然后用含有0.1%生物素的内液填充电极，用于细胞标记和形态学鉴定。接下来，打开加压灌流系统，将人工脑脊液泵入灌流腔室。确保记录 chamber 中切片上方的液面高度恒定为 2.0 毫米。取一份 MNI 笼锁型谷氨酸原液，加入 25 毫升循环 aCSF 中，使其终浓度为 0.2 毫摩尔的笼锁型谷氨酸。随后将一片脑切片转移至记录 chamber 中。运行成像系统以检查脑片质量，并进行解剖学定位以确定初级躯体感觉区。接着，使用自制的带弦铂金环固定脑片，注意避免将固定环置于拟记录的脑区上方。在DIC荧光显微镜下，通过GFP表达情况，利用60倍物镜观察细胞。鉴定并选择抑制性细胞类型。请注意，记录将在红外微分干涉差（DIC）成像的视觉引导下进行。在将电极下降至目标细胞的过程中，需要通过视频监控并在DIC模式与荧光模式之间切换，以确认GFP标记细胞的位置。采用传统的膜片钳技术。首先，对电极施加正压，将其移至细胞表面附近，使目标细胞膜上形成一个明显的凹陷。然后迅速施加负压以形成吉欧封接，并在视频监视器上监测电流注入反应的同时穿破细胞。穿破后，在微分干涉（DIC）和荧光模式下，以60倍放大倍率拍摄记录到的表达GFP的胞内神经元图像，用于在线验证。在采集光刺激数据之前，注入超极化和去极化电流脉冲，以检测每个细胞的基本电生理特性。当记录稳定后，通过良好的接入电阻（通常小于20兆欧）实现全细胞记录，将显微镜物镜从60倍切换至4倍放大倍数以进行激光扫描光刺激，以4倍放大倍数获取脑片图像，并用该图像引导和定位光刺激位点。通过激活Phys的配置切换模块来设定光刺激和数据采集参数。使用持续时间为1毫秒、功率约为20毫瓦、刺激间隔为1秒的激光脉冲。进行光刺激定位时，采集采样频率为10千赫兹、持续时间为1秒的数据轨迹。接着，将四倍切片图像载入phys软件的定位模块。定义胞体位置，并设置光刺激位点为16×16阵列，每个位点间距为80微米×80微米。围绕细胞位置的间距，覆盖所有皮层。然后通过在电流钳模式下检测记录神经元在光刺激下的放电位置，绘制其兴奋性反应图谱。我们这款用户友好的软件具备在线显示功能，可有效促进定位绘图实验的进行。随后，通过检测记录细胞的兴奋性突触后电流，绘制局部兴奋性环路连接图。采用激光扫描在不同位置进行刺激，将细胞在电压钳模式下钳制在负70毫伏，以检测向内的兴奋性电流。然后，将光刺激模式旋转或翻转，重复获取兴奋性突触后电流图谱两到三次。为绘制局部抑制性环路连接，检测记录细胞的抑制性突触后电流。在此情况下，将细胞钳制在接近零毫伏的水平，即电压钳模式下负15毫伏，以检测外向抑制性电流。完成所有生理检测后，轻柔地将电极从记录细胞中取出。将脑片从记录室中移出，然后在4%多聚甲醛中固定过夜，并对记录的细胞进行生物素染色。在本实验中，通过结合GFP表达、固有电生理特性以及形态学特征，对抑制性神经元进行分类。此处展示了用于说明激光扫描光刺激的示例及原始数据图，该技术可广泛绘制局部皮层回路与记录到的抑制性神经元之间的连接图谱。以下是根据图D中刚刚展示的原始轨迹数据生成的颜色编码定量输入图的示例。在记录到的中间神经元中检测到的突触事件的幅度经过颜色编码，并在空间上叠加于光刺激的位置之上。细胞体的位置由比例尺中的红色空心圆表示。暖色表示对目标细胞有较强的突触输入，冷色表示较弱或无连接性。同样，图E展示了记录到的神经元在每个采样解笼位置处的突触事件数量。图 F 展示了光刺激后记录细胞首次检测到突触事件的发生时间，比例尺如图所示。暖色表示较短的输入潜伏期，冷色表示较长的突触潜伏期。因此，LSPS 能够构建出投射到特定类型抑制性神经元上的输入在位置、强度、潜伏期和数量方面的详细图谱。进行该操作时，重要的是要有耐心，保持实验环境洁净，并且在将观察对象从高倍镜转换到低倍镜时，要小心谨慎、有效地操作神经元。最后，需熟练使用成像软件。

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测绘激光扫描Photostimulation抑制神经回路

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通过激光扫描光刺激绘制抑制性神经元环路

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