量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

本实验的总体目标是通过分析激动剂的浓度-反应曲线，估算其与受体活性状态结合的相对亲和常数KB。首先测定一组激动剂在G蛋白偶联受体上引发反应的浓度-反应曲线；随后通过非线性回归分析，估算这些激动剂的eemax和EC50值。

然后利用这些值计算后续基于操作模型的非线性回归分析的初始参数估计值。最后一步，通过对其浓度-反应曲线进行全局非线性回归分析，获得激动剂相对于受体活性状态的亲和常数的相对估计值。最终，利用操作模型的一种改进形式，可通过对其浓度-反应曲线进行全局非线性回归分析，估算一种激动剂相对于另一激动剂在受体活性状态下的亲和常数。

该方法有助于解答药物发现领域中的关键问题，例如：激动剂是否对特定信号通路具有选择性？通常，刚接触该方法的研究人员会因数学分析的细节而遇到困难。为了估算激动剂的相对 KB 值，需要至少获得两条激动剂浓度-反应曲线。

有关此类实验的注意事项可在书面方案中找到。获得反应曲线后，从各浓度激动剂存在下的测量值中减去基础反应值，然后开始将浓度-反应实验的数据输入数据表。在Prism软件中，所有激动剂的对数浓度均输入标记为X的列下。将表现出最大反应幅度（即最大EAX值）的激动剂的反应测量值输入A列，其余激动剂的测量值则依次输入相邻的字母列中。

将浓度反应曲线的重复测量值输入至指定字母列的子列中。选择用于绘制数据的图表工作表，点击分析，使用可变斜率方程通过非线性回归分析对数据进行拟合，将参数“底部”（bottom）约束为零，并执行回归分析。记录“顶部”（top）和 log EC50 参数，用于后续计算初始参数估计值。

为计算初始参数估计值，将观测到的 log tau K 赋值为标准激动剂的负对数 EC 50 值。接着，计算每个测试激动剂的 log RAI 值，其为测试激动剂的 eemax 值与标准激动剂的 EC 50 值的乘积，除以标准激动剂的 emax 值与测试激动剂的 EEC 50 值的乘积，再对该商取对数。在此方程中，标准激动剂的参数以撇号（'）表示。

然后将测试性激动剂的对数亲和常数赋值为各自EC值的负对数。将数据输入Prism后，需确保最大EMAX值的激动剂数据输入至A列。该激动剂现被指定为标准激动剂，而其他激动剂则被指定为测试性激动剂。接下来，在Prism中分多行输入用户自定义方程log RAI。

在此情况下，用户自定义方程涉及总共五种激动剂。输入锁定 R 的初始参数估计值以及测试激动剂的亲和常数。将标准激动剂的 EMAX 值赋给 M sis，将 M 赋值为 1。

现在输入测试性激动剂的log RAI值的初始参数估计值。通过将log K₁约束为零，并将log GR、m、sis和M设置为所有数据集的共享值，来应用参数约束。接下来，启动非线性回归分析。

实验结果可得到受试激动剂的 log K 观察值和 log RAI 值，用于估算激动剂的 KB 值（以摩尔浓度倒数的绝对单位表示）。为此，需采用表现出受体组成型活性的基于细胞的体外检测方法。激动剂的选择及实验设计应按照书面方案中的描述进行。将未转染受体的细胞中测得的反应减去基础反应，以此计算受体的组成型活性以及激动剂各浓度下的反应。此处展示的是针对某条信号通路的分析结果，该通路组成型活性极低，适用于初步分析。

首先，按照非组成型活性所述的方法将数据输入 Prism 中。同时，将组成型受体活性引起的作用响应输入至对应于激动剂浓度对数值为 -20 的行中适当的字母列内。此处输入一个较大的负对数值，以近似表示激动剂浓度为零的情况。

按之前的方法分析数据，但针对组成型活性，应将参数“bottom”限制为所有数据集共享。记录该共享参数，以及每种激动剂的“top”和“log EC”参数。在通过独立实验确定标准激动剂的log亲和常数后，计算各部分测试激动剂的log K观察值的初始估计值，该值为以下表达式的对数：标准激动剂emax值与测试激动剂emax值之差，除以EC50与标准激动剂emax值和组成型反应值之差的乘积。

计算每种激动剂的 log KB 初始估计值以及 log T cis 的初始估计值，以估算激动剂的 KB 值。将数据输入 Prism，然后输入用户自定义方程。将 log KB 按如下所示针对两种激动剂条件的多行形式输入 Prism。

接下来，通过输入每种激动剂的亲和力值来设定初始参数估计值。log T sis 估计 M sis 估计值，其中 M sis 被赋予标准激动剂的最大效应（EMAX）值，而 M 被赋予数值 1。最后，输入 log kb 的初始估计值。

通过将 log K1 约束为其先前确定的值，并将 log T sis、m sis 和 M 设置为所有数据集的共享值，来应用参数约束。启动非线性回归分析。结果得到标准激动剂的 log KB、观测到的 log K 值，以及部分激动剂的 log KB 值。

本系统中的最大反应、游离受体复合物的 log T cys 值以及此处所示操作模型中的转导斜率因子，对应于中国仓鼠卵巢细胞中毒蕈碱受体 M3 亚型稳定表达条件下，毒蕈碱激动剂诱导的磷脂酰肌醇水解。本实验测定了若干选定毒蕈碱激动剂的浓度-反应曲线，并按本文所述方法对数据进行分析，以估算各激动剂相对于氧甲酰胆碱（Oxo Tremaine M）的 KB 值。理论曲线为回归方程对数据的最小二乘法拟合结果。图中显示了卡巴胆碱（kabale）、占巴明（recline）、毛果芸香碱（pilocarpine）和麦克尼尔（McNeil）的 log RAI 估计值。

3、4 3。确定了系统最大反应和换能器斜率因子的相应估计值。还得到了所示每种激动剂的观测 log K 值。

以下是关于HC 2 93细胞中毒蕈碱激动剂刺激磷脂酰肌醇水解实验的结果。稳定表达G alpha 15并瞬时表达M3毒蕈碱受体导致基础磷脂酰肌醇水解增加，该现象归因于受体的组成型活性。数据分析用于估算Oxo Tremaine M和MacNeil A 3 43的log KB值。

理论曲线代表回归方程对数据的最小二乘法拟合结果。图中显示了Oxo Tremoring M和McNeil, A 3 43的log KB估计值。McNeil A 3 43的K观测值估计也已确定。

一旦掌握，若操作得当，该数据分析技术可在数分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何从G蛋白偶联受体信号通路下游效应的激动剂浓度-反应曲线中估算出相对和实际的KB值。