Name: 量化在G蛋白偶联受体激动剂活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 了解如何通过浓度-反应曲线分析估算G蛋白偶联受体激动剂的相对亲和力常数Kb。该方法利用非线性回归分析Eemax和EC50值，为药物研发提供受体激活机制的定量框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到美国国立卫生研究院资助项目 GM 69829 的支持。

1. 激动剂浓度-反应曲线的测定：无组成型活性
<ol>
 <li>为了估算相对激动剂的 Kb 值（RAi），至少需要一系列两条以上的激动剂浓度-反应曲线。只要能够控制激动剂浓度，并且反应由单一类型的受体介导，任何可用于检测 GPCR 功能反应的 体外 实验均可使用。合适的基于细胞的检测方法包括测定表达重组受体的细胞系中 cAMP 4,7 和肌醇磷酸的累积 8,9。整体组织实验的示例包括测定平滑肌的收缩 10，或通过场刺激的大鼠左心房中 M2 毒蕈碱受体和 β1-肾上腺素能受体介导的收缩变化 11。</li>
 <li>选择一组包含高效力激动剂（例如内源性配体）在内的激动剂进行分析。在单次实验中，测定每种激动剂的完整浓度-反应曲线。如果激动剂数量过多，无法在一次实验中完成全部检测，则将激动剂分为若干亚组，每个亚组包含可在单次实验中合理处理的激动剂数量。对每个亚组，同时测定高效力激动剂与其他激动剂的浓度-反应曲线（见图3）。根据数据的变异性，每个亚组重复实验约 3 至 6 次。</li>
 <li>对每条浓度-反应曲线，测量无激动剂时的反应（基础反应）以及激动剂浓度递增时的反应。激动剂浓度应在对数尺度上均匀分布，间隔约为 0.3 - 0.7 log10 单位，覆盖整个反应范围并确定最大反应（Emax）（见图3）。对于细胞系实验，每次测量均需设三个重复。</li>
 <li>从各激动剂浓度下的测定反应中减去基础反应。图3中绘制的反应值即按此方式计算得出。</li>
</ol>
2. 激动剂浓度-反应曲线的初步分析：无组成型活性
<ol>
 <li>将浓度-反应实验的数据（例如图5）输入 Prism 中的数据表。所有对数激动剂浓度均输入标为 X 的列中。将具有最大 Emax 值的激动剂的反应测量值输入 A 列，另一激动剂的测量值输入相邻的字母列中。浓度-反应曲线的重复测量值输入至指定字母列的子列中。</li>
 <li>选择绘制数据的图表工作表，使用“对数激动剂浓度 vs. 反应 — 可变斜率（四参数）”方程，通过非线性回归分析对数据进行分析。将“Bottom”参数约束为零，并执行回归分析。将“Top”（Emax）和 log EC50 参数复制到 Excel 电子表格中，用于计算初始参数估计值。将具有最大 Emax 估计值的激动剂指定为“标准激动剂”，其余激动剂则指定为“测试激动剂”。</li>
 <li>
 将标准激动剂的负对数 EC50 值（-log EC50'）作为 log τKobs 的初始估计值（LOGR1）进行计算。 
 将每个测试激动剂的 log RAi 值（LOGRA）的初始估计值计算为 log {(Top×EC50')/(Top'×EC50)}，其中标准激动剂的参数用撇号表示。 
 将测试激动剂的对数亲和常数（LOGK2 - LOGK5）计算为其各自 EC50 值的负对数。</li>
</ol>
3. 使用非线性回归分析估算激动剂RAi值：无组成型活性
<ol>
 <li>按照上文 2.1 节所述，将数据输入 Prism 中的数据表。确保标准激动剂的数据输入至 A 列。</li>
 <li>在 Prism 中输入用户自定义方程“log RAi”，分多行输入，以包含总共五种激动剂的情况为例：
<ul>
<li>&lt;A&gt;P=LOGK1</li>
<li>&lt;A&gt;Q=LOGR</li>
<li>&lt;~A&gt;Q=LOGR+LOGRA</li>
<li>&lt;B&gt;P=LOGK2</li>
<li>&lt;C&gt;P=LOGK3</li>
<li>&lt;D&gt;P=LOGK4</li>
<li>&lt;E&gt;P=LOGK5</li>
<li>Y=Msys/(1+{[(1+10^(X+P))/(10^(X+Q))]^M})</li></ul>
</li>
 <li>按如下方式输入初始参数估计值： 
为标准激动剂的对数亲和常数（LOGK1）输入一个任意低值 0。 
输入测试激动剂的 LOGR 初始估计值、亲和常数（LOGK2 - LOGK5）以及对数 RAi 值（LOGRA）。 
将换能斜率因子（M）的初始估计值设为 1.0。 
 将系统最大反应（Msys）的初始估计值设为与标准激动剂的 Emax（Top′）相等的数值。</li>
 <li>应用以下参数约束：将 LOGK1 固定为常数 0；LOGR、Msys 和 M 在所有数据集中共享；LOGK2 - LOGK5 和 LOGRA 不设约束。</li>
 <li>启动非线性回归分析。结果将得到测试激动剂的对数 Kobs 和对数 RAi 值。如果标准激动剂为完全激动剂，则对数 Kobs 和对数 RAi 值均准确。如果最具效能的激动剂（即标准激动剂）实际上为部分激动剂，则效能更高的激动剂的 Kobs 值可能会被高估。尽管如此，在此情况下，对数 RAi 的估计值仍然准确。</li>
 <li>如果回归未能收敛，实验者可尝试绘制由初始参数估计值定义的理论曲线。若数据点与理论曲线之间存在较大偏差，请检查初始参数估计值的计算过程。若一种或多种激动剂的 Emax 值与标准激动剂相当，则可能需要将其对数 Kobs 值约束为 0，以便回归能够收敛至解。</li>
</ol>
4. 在具有组成型受体活性的基于细胞的检测中测定激动剂浓度-反应曲线
<ol>
 <li>用于激动剂的估算 Kb 以 M 为绝对单位的数值-1基于细胞的 体外 采用表现出受体组成型活性的检测方法。受体组成型活性定义为表达目的受体后，反应水平较基础状态显著升高。</li>
 <li>选择激动剂并按照上述第1.2节所述设计实验。</li>
 <li>对于每条浓度-反应曲线，测量非转染细胞在无激动剂存在时的反应（基础反应）以及转染了目标受体的细胞在无激动剂存在时的反应（基础反应 + 组成型反应）。按照第1.3节所述，测量不同激动剂在不同浓度下的反应。</li>
 <li>计算组成型受体活性以及每种浓度激动剂的反应，方法为：用转染受体细胞的实测反应减去未转染受体细胞的基础反应。图6展示了针对一条组成型活性极低的信号通路，以该方法计算得到的多种激动剂的反应结果。</li>
</ol>

5. 具有组成型活性的激动剂浓度-反应曲线的初步分析
<ol>
 <li>将数据（例如图6）输入 Prism 的数据表中，方法如第3.1节所述，同时将由受体组成性活性引起的功能反应输入至对应于激动剂浓度对数为-20的相应字母列中。输入一个较大的负对数值以近似表示激动剂浓度为零的情况。</li>
 <li>按照第2.2节中所述方法分析数据，但将“Bottom”参数设定为“所有数据集共享”。复制“顶部" (E最大），共享“底部”和对数 EC50 将参数输入 Excel 电子表格，用于计算初始参数估计值。</li>
 <li>按下述方法计算初始参数估计值： 
 标准激动剂的对数亲和常数（LOGK1）或任何完全性测试激动剂的对数亲和常数，必须在独立实验中按前述方法测定 3. 
 计算对数值的初始估计 K观察 每个部分激动剂的值（即本例中的仅 LOGK2）为 log {(Top'-Top)/(EC50（上′- 下）}，其中“下”表示由受体组成性激活引起的反应。 
 计算 log 的初始估计值 Kb (LOGKb) 为每种激动剂的 log {Top/(EC50底部）。 
 计算对数的初始估计值 τsys (LOGTsys) 表示为 log {Bottom/(Top′ - Bottom)}。</li>
</ol>
6. 使用非线性回归分析估算表现出受体组成型活性的激动剂Kb值
<ol>
<li>按照上文 3.1 节所述方法，将数据输入 Prism 中的数据表。</li>
<li>在 Prism 中输入用户自定义方程“Log Kb”，分多行输入，以两种激动剂的条件为例：
<ul>
<li>&lt;A&gt; LOGKOBS = LOGK1</li>
<li>&lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2</li>
<li>A=(10^(X+LOGKOBS))+1</li>
<li>B=10^(X+LOGTSYS+LOGKB)</li>
<li>C=(10^(LOGTSYS))</li>
<li>Y=Msys/{1+[(A/(B+C))^M]}</li>
</ul>
</li>
<li>按以下方式输入初始参数估计值： 
 输入每种激动剂的亲和常数（LOGK1 — 输入步骤 5.3 中确定的数值）。 
 输入每种测试激动剂的 Kobs 估计值。 
 输入激动剂的 Kb 估计值。 
 输入 log τsys（LOGTsys）估计值。 
 将转导斜率因子（M）和系统最大反应值（Msys）分别设定为 1.0 和 Top'（标准激动剂的 Emax）。</li>
<li>应用以下参数约束条件：LOGTsys、Msys 和 M 对所有数据集采用共享值；LOGK2 和 LOGKb 不设约束。</li>
<li>启动非线性回归分析。结果将提供标准激动剂的 log Kb、部分激动剂的 log Kobs 和 log Kb 值，以及系统最大反应值（Msys）、游离受体复合物的 τsys 值（LOGTsys）和操作模型中的转导斜率因子（M）。</li>
<li>如果回归无法收敛，请按照上文第 3.6 节所述步骤进行处理。</li>
</ol>
7. 代表性结果
图5展示了我们先前发表的部分数据，涉及在稳定表达M3毒蕈碱受体的中华仓鼠卵巢细胞中，由毒蕈碱激动剂诱导的磷脂酰肌醇水解12。本实验测定了若干选定毒蕈碱激动剂的浓度-反应曲线。如第3节所述，对数据进行分析，以估算各激动剂相对于氧托洛尔-M（oxotremorine-M）的Kb值。这些log RAi估算值分别为：卡巴胆碱（carbachol），-0.56 ± 0.063；槟榔碱（arecoline），-0.60 ± 0.074；匹罗卡品（pilocarpine），-1.20 ± 0.15；以及McN-A-343，-1.92 ± 0.31。理论曲线表示根据回归方程对数据进行最小二乘法拟合的结果（第3.2节）。系统最大反应值（Msys）和转导斜率因子（M）的相应估算值分别为53.9 ± 1.3和1.15 ± 0.09。除氧托洛尔-M外，各激动剂的log Kobs值分别为：卡巴胆碱，5.19 ± 0.14；槟榔碱，5.49 ± 0.12；匹罗卡品，5.58 ± 0.16；McN-A-343，5.27 ± 0.33。
图6展示了在稳定表达Gα153的HEK 293细胞中，毒蕈碱激动剂刺激下的磷脂酰肌醇水解实验结果。M3毒蕈碱受体的瞬时表达导致基础磷脂酰肌醇水解增加，这归因于受体的组成型活性。根据第6节所述方法对数据进行分析，以估算氧化震颤素-M和McN-A-343的log Kb值。该分析得到氧化震颤素-M和McN-A-343的log Kb值分别为8.30 ± 0.59和6.59 ± 0.77。理论曲线表示回归方程对数据的最小二乘拟合结果（见第6.2节）。log τsys、Msys和M的估计值分别为-2.29 ± 0.59、95.8 ± 2.8和0.72 ± 0.08。Kobs值对McN-A-343的估计为5.35 ± 0.46。
<img alt="受体活性示意图；显示激动剂结合、单个受体与群体、高/低亲和力状态。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 单个受体活性与受体群体平均激活水平之间的关系。单个受体活性，表示在激动剂存在下，单个受体在激活（开启）状态与非激活（关闭）状态之间发生转换的理论行为。激动剂对激活态和非激活态的亲和常数分别用Kb和Ka表示。群体行为，表示在激动剂存在下，多个受体随机在激活态与非激活态之间转换的理论行为。群体平均值，表示在特定浓度激动剂存在下，一群受体中受体激活的平均水平。受体群体的激活水平称为刺激。
<img alt="受体激活图，激动剂浓度分析，受体激活程度与激动剂对数浓度的关系。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图 2. 受体激活函数与激动剂的效能（ε）及观察到的亲和常数（Kobs）之间的关系。群体平均值，显示随着激动剂浓度增加所引发的受体激活平均水平。受体激活，以激动剂的对数浓度为横坐标，绘制受体激活的平均水平。引起半数最大受体激活所需的激动剂负对数浓度相当于激动剂的观察亲和常数的对数（log Kobs）。受体激活函数的最大值定义为效能（ε）。
<img alt="激动剂对受体测定中[³H]肌醇磷酸盐的影响；剂量-反应曲线，比较分析。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 不同毒蕈碱型激动剂在表达人源 M3 毒蕈碱受体的中国仓鼠卵巢细胞中对[3H]肌醇磷酸盐累积作用的浓度-反应曲线示例。共测定了九种激动剂的浓度-反应曲线。该实验可分为两个部分，每一部分均将标准激动剂（oxotremorine-M）与其他激动剂同时检测。因此，若每次实验仅能测定五种激动剂，则需进行两轮如图 a 和 b 所示类型的实验，方可完成九种激动剂的浓度-反应曲线测定。数据来自 Ehlert et al. 12。
<img alt="不同激动剂的剂量-反应曲线；图表；药理学研究；受体活性分析。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 不同毒蕈碱型激动剂在表达人源 M2 毒蕈碱受体和 Gα15 的 HEK 293 细胞中刺激 [3H]肌醇磷酸盐累积的浓度-反应曲线示例。M2 受体的表达引起 30–35% 的 [3H]肌醇磷酸盐反应，归因于受体的组成型活性。数据来自 Ehlert et al. 12。
<img alt="各种激动剂的剂量-反应曲线图；肌醇磷酸测定。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 稳定表达人源 M3 毒蕈碱受体的中国仓鼠卵巢细胞中，毒蕈碱激动剂介导的磷脂酰肌醇水解。图中显示了若干选定的毒蕈碱激动剂刺激磷脂酰肌醇水解的浓度-反应曲线。数据为三次实验的平均值 ± 标准误（SEM）。数据来源于 Ehlert et al. 12。
<img alt="[3H]肌醇磷酸的剂量-反应曲线；激动剂对数浓度与反应关系；受体结合图。" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 在表达Gα15和M3毒蕈碱受体的HEK 293细胞中，氧化震颤素-M和McN-A-343介导的磷脂酰肌醇水解。磷脂酰肌醇水解以氧化震颤素-M的Emax为参照进行表示。在无激动剂存在时，由M3受体表达引起的磷脂酰肌醇水解约占反应的2%。数据展示为三次实验的平均值±标准误。数据来自Ehlert 等3。

<ol><li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+receptor+theory%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li>
<li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Drug+Research%22%5BJournal%5D)">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li>
<li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity%3A+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li>
<li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi%2Fo%2CGs%2C+and+G15%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li>
<li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+models+of+pharmacological+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+LondonSeries+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li>
<li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li>
<li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+adenosine+3%27%3A5%27-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells%3A+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li>
<li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li>
<li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKendall%2C+DA+%22Methods+in+Neurotransmitter+Receptor+Analysis%22">Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis</a>. , Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).</li>
<li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li>
<li>Kenakin, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKenakin%2C+T+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22">Current Protocols in Pharmacology</a>. Enna, S. J. , John Wiley & Sons. (2001).</li>
<li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes%3A+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li>
<li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

由于我们估算RAi（相对Kb值）的方法仅需测定激动剂的浓度-反应曲线，因此只要测定了这些曲线，即可随时进行分析。
如果实验体系（例如细胞或组织）的反应在不同天之间存在较大日间变异，则可将每条浓度-反应曲线的反应测量值相对于当天标准激动剂的“Top”估计值进行归一化。通过回归分析（如第2和第5节所述），对标准激动剂的每条重复浓度-反应曲线分别估算其Top和log EC50值。将当天所有激动剂浓度-反应曲线的反应值相对于该天标准激动剂的Top估计值进行归一化处理。随后，对这些归一化后的数据按照第3节起所述方法进行分析。
准确估算 Kb 依赖于对受体组成型活性的精确测定。在本实验中，将 M3 受体转染至 HEK 293 细胞后，导致磷脂酰肌醇水解增加，在使用 [3H]肌醇预标记并加入锂的细胞中测得的 [3</...

量化g蛋白偶联受体上的激动剂活性

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

当激动剂激活一群G蛋白偶联受体（GPCRs）时，会引发一条信号通路，最终导致细胞或组织产生反应。该过程可在单个受体、受体群体或下游反应水平上进行分析。本文介绍如何分析下游反应，以估算激动剂对单个受体活性状态的亲和常数。
受体表现为量子化开关，可在活性状态与非活性状态之间交替转换（图1）。活性状态可与特定的G蛋白或其他信号分子伙伴相互作用。在无配体存在时，受体主要处于非活性状态。激动剂的结合会提高受体转换为活性状态的概率，因为其对活性状态的亲和常数（Kb）远大于对非活性状态的亲和常数（Ka）。群体中所有受体随机输出信号的总和，随时间表现为恒定水平的受体激活。引起半最大受体激活的激动剂浓度的倒数，相当于观测到的亲和常数（Kobs），而处于活性状态的激动剂-受体复合物所占的比例定义为效能（ε）（图2）。
已开发出用于分析G蛋白偶联受体（GPCR）下游反应的方法，可用来估算激动剂的Kobs值及其相对效能1,2。在本报告中，我们展示了如何改进该分析方法，以估算一种激动剂相对于另一种激动剂的Kb值。对于具有组成型活性的检测体系，我们进一步展示了如何以M-1为绝对单位来估算Kb值。
我们分析激动剂浓度-反应曲线的方法3,4采用基于操作模型5的全局非线性回归。本文描述了使用软件Prism（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）的操作流程。该分析可得到观察解离常数Kobs与一个与效能成正比的参数（τ）的乘积估计值。一种激动剂的τKobs估计值除以另一种激动剂的对应值，即为Kb (RAi) 6的相对度量。对于任何具有组成性活性的受体，均可估算出一个与游离受体复合物效能成正比的参数（τsys）。在此情况下，激动剂的Kb值等于τKobs/τsys 3。
我们的方法可用于确定激动剂对受体亚型的选择性，并可量化激动剂-受体通过不同G蛋白的信号传导。

本文描述了一种用于估算激动剂对G蛋白偶联受体活性状态亲和常数（Kb）的方法。该分析可提供Kb的绝对值或相对值，具体取决于受体的组成性激活是否可测量。本方法适用于受体激活后产生的多种下游反应。

量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

当激动剂激活一群G蛋白偶联受体（GPCRs）时，会引发一条信号通路，最终导致细胞产生相应的反应……

本实验的总体目标是通过分析激动剂的浓度-反应曲线，估算其与受体活性状态结合的相对亲和常数KB。首先测定一组激动剂在G蛋白偶联受体上引发反应的浓度-反应曲线；随后通过非线性回归分析，估算这些激动剂的eemax和EC50值。然后利用这些值计算后续基于操作模型的非线性回归分析的初始参数估计值。最后一步，通过对其浓度-反应曲线进行全局非线性回归分析，获得激动剂相对于受体活性状态的亲和常数的相对估计值。最终，利用操作模型的一种改进形式，可通过对其浓度-反应曲线进行全局非线性回归分析，估算一种激动剂相对于另一激动剂在受体活性状态下的亲和常数。该方法有助于解答药物发现领域中的关键问题，例如：激动剂是否对特定信号通路具有选择性？通常，刚接触该方法的研究人员会因数学分析的细节而遇到困难。为了估算激动剂的相对 KB 值，需要至少获得两条激动剂浓度-反应曲线。有关此类实验的注意事项可在书面方案中找到。获得反应曲线后，从各浓度激动剂存在下的测量值中减去基础反应值，然后开始将浓度-反应实验的数据输入数据表。在Prism软件中，所有激动剂的对数浓度均输入标记为X的列下。将表现出最大反应幅度（即最大EAX值）的激动剂的反应测量值输入A列，其余激动剂的测量值则依次输入相邻的字母列中。将浓度反应曲线的重复测量值输入至指定字母列的子列中。选择用于绘制数据的图表工作表，点击分析，使用可变斜率方程通过非线性回归分析对数据进行拟合，将参数“底部”（bottom）约束为零，并执行回归分析。记录“顶部”（top）和 log EC50 参数，用于后续计算初始参数估计值。为计算初始参数估计值，将观测到的 log tau K 赋值为标准激动剂的负对数 EC 50 值。接着，计算每个测试激动剂的 log RAI 值，其为测试激动剂的 eemax 值与标准激动剂的 EC 50 值的乘积，除以标准激动剂的 emax 值与测试激动剂的 EEC 50 值的乘积，再对该商取对数。在此方程中，标准激动剂的参数以撇号（'）表示。然后将测试性激动剂的对数亲和常数赋值为各自EC值的负对数。将数据输入Prism后，需确保最大EMAX值的激动剂数据输入至A列。该激动剂现被指定为标准激动剂，而其他激动剂则被指定为测试性激动剂。接下来，在Prism中分多行输入用户自定义方程log RAI。在此情况下，用户自定义方程涉及总共五种激动剂。输入锁定 R 的初始参数估计值以及测试激动剂的亲和常数。将标准激动剂的 EMAX 值赋给 M sis，将 M 赋值为 1。现在输入测试性激动剂的log RAI值的初始参数估计值。通过将log K₁约束为零，并将log GR、m、sis和M设置为所有数据集的共享值，来应用参数约束。接下来，启动非线性回归分析。实验结果可得到受试激动剂的 log K 观察值和 log RAI 值，用于估算激动剂的 KB 值（以摩尔浓度倒数的绝对单位表示）。为此，需采用表现出受体组成型活性的基于细胞的体外检测方法。激动剂的选择及实验设计应按照书面方案中的描述进行。将未转染受体的细胞中测得的反应减去基础反应，以此计算受体的组成型活性以及激动剂各浓度下的反应。此处展示的是针对某条信号通路的分析结果，该通路组成型活性极低，适用于初步分析。首先，按照非组成型活性所述的方法将数据输入 Prism 中。同时，将组成型受体活性引起的作用响应输入至对应于激动剂浓度对数值为 -20 的行中适当的字母列内。此处输入一个较大的负对数值，以近似表示激动剂浓度为零的情况。按之前的方法分析数据，但针对组成型活性，应将参数“bottom”限制为所有数据集共享。记录该共享参数，以及每种激动剂的“top”和“log EC”参数。在通过独立实验确定标准激动剂的log亲和常数后，计算各部分测试激动剂的log K观察值的初始估计值，该值为以下表达式的对数：标准激动剂emax值与测试激动剂emax值之差，除以EC50与标准激动剂emax值和组成型反应值之差的乘积。计算每种激动剂的 log KB 初始估计值以及 log T cis 的初始估计值，以估算激动剂的 KB 值。将数据输入 Prism，然后输入用户自定义方程。将 log KB 按如下所示针对两种激动剂条件的多行形式输入 Prism。接下来，通过输入每种激动剂的亲和力值来设定初始参数估计值。log T sis 估计 M sis 估计值，其中 M sis 被赋予标准激动剂的最大效应（EMAX）值，而 M 被赋予数值 1。最后，输入 log kb 的初始估计值。通过将 log K1 约束为其先前确定的值，并将 log T sis、m sis 和 M 设置为所有数据集的共享值，来应用参数约束。启动非线性回归分析。结果得到标准激动剂的 log KB、观测到的 log K 值，以及部分激动剂的 log KB 值。本系统中的最大反应、游离受体复合物的 log T cys 值以及此处所示操作模型中的转导斜率因子，对应于中国仓鼠卵巢细胞中毒蕈碱受体 M3 亚型稳定表达条件下，毒蕈碱激动剂诱导的磷脂酰肌醇水解。本实验测定了若干选定毒蕈碱激动剂的浓度-反应曲线，并按本文所述方法对数据进行分析，以估算各激动剂相对于氧甲酰胆碱（Oxo Tremaine M）的 KB 值。理论曲线为回归方程对数据的最小二乘法拟合结果。图中显示了卡巴胆碱（kabale）、占巴明（recline）、毛果芸香碱（pilocarpine）和麦克尼尔（McNeil）的 log RAI 估计值。3、4 3。确定了系统最大反应和换能器斜率因子的相应估计值。还得到了所示每种激动剂的观测 log K 值。以下是关于HC 2 93细胞中毒蕈碱激动剂刺激磷脂酰肌醇水解实验的结果。稳定表达G alpha 15并瞬时表达M3毒蕈碱受体导致基础磷脂酰肌醇水解增加，该现象归因于受体的组成型活性。数据分析用于估算Oxo Tremaine M和MacNeil A 3 43的log KB值。理论曲线代表回归方程对数据的最小二乘法拟合结果。图中显示了Oxo Tremoring M和McNeil, A 3 43的log KB估计值。McNeil A 3 43的K观测值估计也已确定。一旦掌握，若操作得当，该数据分析技术可在数分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何从G蛋白偶联受体信号通路下游效应的激动剂浓度-反应曲线中估算出相对和实际的KB值。

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

量化在G蛋白偶联受体激动剂活性

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。...

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。...

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca2+...

一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

本文介绍了从结合到生理学和药理学层面发现作用于GABAA受体的活性化合物的实验方案。...

调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

本方案展示了利用无标记阻抗检测技术，从生长在单个微电极上的单层细胞中实时记录激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活全过程剂量-反应关系的方法。新的加样方案在不损失时间分辨率的前提下显著提高了通量。...

无标记阻抗法G蛋白偶联受体检测中提高通量的逐步给药方案

鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

已开发出一种改良的内皮细胞钙流测定实验方案，用于鉴定蛋白酶激活受体（PARs）的配体。新方案将总检测时间缩短了90至120分钟，并可获得可重复的浓度-反应曲线。...

利用酶标仪通过钙流测定法表征蛋白酶激活受体调节剂

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。...

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

了解如何通过浓度-反应曲线分析估算G蛋白偶联受体激动剂的相对亲和力常数Kb。该方法利用非线性回归分析Eemax和EC50值，为药物研发提供受体激活机制的定量框架。

量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

探索更多视频