利用腺病毒衍生系统高效生产重组细小病毒

本实验的总体目标是在保持重组细小病毒（rec PV）质量和降低生产时间与成本的同时，高效地制备高滴度的重组细小病毒（rec PVS）。该目标首先通过将重组PV质粒与一种源自5型腺病毒的载体共同转染至HEK293T细胞中，以制备初始的重组PV病毒原液来实现。由于将腺病毒基因组元件导入HEK293T细胞可使重组PVS的产量提高十倍以上。

与现有方案相比，我们构建了一种新型的腺相关病毒（AAV）VP辅助载体，该载体包含可增强重组细小病毒生产的基因组腺病毒元件以及细小病毒的VP基因单元。下一步是根据标准方案生产并纯化这种新型的AAV VP辅助载体。

该实验流程的最后一步是通过将重组PV病毒和AD-ADP病毒共同感染NB3.20.4K细胞来扩增重组PVS。采用此策略可使重组PV的产生效率提高100倍以上，因此在通过转染获得少量重组PVS后，即可 exclusively 使用该方法进行扩增。最终，通过定量实时PCR或转导实验对所制备的病毒储备液进行滴度测定。

此外，通过空斑试验确认在生产过程中是否产生了非预期的具有复制能力的病毒。与现有的经典方法（如通过质粒在活跃和传代细胞中进行重组细小病毒生产）相比，该技术的主要优势在于：一旦我们在腺病毒VP辅助系统中生产出初始的重组细小病毒毒种，后续的生产将完全依赖病毒感染。这使得我们可以使用NBK细胞——这类细胞是细小病毒的高效生产者，但难以进行转染。

通过这种方法，可以扩增重组杆状病毒，并将病毒的滴度提高100倍以上，从而显著缩短生产时间并降低成本。演示该实验操作的是病毒制备部门负责人Barbara Loic，她与我们共同开发了这一新型实验方案。我们希望您喜欢本视频，并祝您的实验工作顺利成功。

通过转染法生产重组细小病毒（rec PV）需要制备最低量的重组PVS，以作为后续通过感染法生产重组PVS时的接种物。重组PVS的生产需在生物安全二级实验室中进行，且应在转染前一日准备种子。在10厘米培养皿中接种200万HEK 293T细胞，以获得50%的细胞汇合度。

转染当天，将细胞在含10% FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的10毫升DMEM培养基中培养，并于37°C、5%二氧化碳及92%湿度条件下孵育过夜。转染当天，在1.5毫升离心管中配制病毒制备混合液。按1:2:1的摩尔比加入以下试剂：三微克携带目的转基因的重组PV载体。

6 微克携带细小病毒衣壳基因单元的载体 P-C-M-V-V-P，以及 8 微克腺病毒来源的辅助质粒。Pxx6 将质粒混合物用无血清培养基稀释至 850 微升，以获得每微升 20 纳克的终浓度。接着，按 FUgene HD 转染试剂与 DNA 2.5:1 的比例，加入 42.5 微升 FUgene HD 转染试剂。

注意不要让 FU 基因试剂接触离心管管壁，轻轻涡旋震荡 5 到 10 秒，然后将转染混合物在室温下孵育 30 分钟。将转染混合物逐滴加入细胞中。轻轻摇晃培养板，使混合物均匀分布。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳和92%湿度条件下孵育72小时。在此期间，细小病毒质粒将产生子代细小病毒颗粒，以用于病毒的收集。首先，用培养基刮取细胞，然后吸出悬液并将其从培养板转移至15毫升塑料管中。

将离心管在250 G下离心五分钟。室温条件下，去除上清液的95%，留下约0.5毫升。轻轻涡旋振荡离心管，使沉淀重悬于剩余的上清液中，然后转移至1.5毫升离心管中。

将悬液在液氮浴中冷冻，然后在37摄氏度的温水中解冻。剧烈涡旋振荡试管15秒。重复冻融循环两次。

在4°C条件下，以16,000 G离心15分钟，收集上清液至新离心管中。此阶段的上清液含有粗病毒提取物，可作为接种物用于通过感染生产重组PVS。Power virus增殖。

病毒的复制依赖于在增殖细胞中表达的细胞因子。因此，用于重组杆状病毒生产的细胞必须处于最佳状态，并以适当的密度接种，正如本方案中所示。感染前一天，将一千万个MB three 20 4K细胞接种于T175培养瓶中，使次日细胞融合度达到60%至80%。

准备第二个含有相同数量细胞的烧瓶作为对照。每个T 1 75烧瓶在感染当天早晨应加入20毫升MEM，终体积中补充5%FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素。在2毫升塑料管中制备病毒混合物。

加入这些试剂。加入VP辅助剂。以感染复数为10的rec PVS在MOI为0.5的条件下加入MEM，总体积至1.5毫升。

将全部病毒混合物加入其中一个T 1 75培养瓶中。在37摄氏度、92%湿度和5%二氧化碳条件下孵育培养瓶2小时，每15分钟轻轻摇动一次。随后在37摄氏度、92%湿度和5%二氧化碳条件下继续孵育20至24小时。

20至24小时后，更换为新鲜培养基，并在相同条件下继续培养48小时，以指示病毒的有效产生。含有病毒感染细胞的培养瓶中应观察到明显的细胞毒性迹象。从感染后36至48小时开始，在48小时后吸出培养基上清液，并将其转移至50毫升离心管中。

用 1.5 毫升 PBS 洗涤细胞两次，加入胰蛋白酶作用 3 至 5 分钟，然后将细胞悬液加入已去除培养基的离心管中，在室温下以 5,000 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液，并向细胞沉淀中加入 1 毫升 TE 缓冲液。轻轻涡旋振荡试管以重悬细胞。接着，将细胞悬液置于液氮浴中冷冻，然后在 37 摄氏度温水中解冻。

剧烈涡旋混匀试管15秒。重复冻融循环三次。接着，在37摄氏度下用Ben Nase核酸酶处理细胞悬液30分钟，以消化基因组细胞DNA和未包装的病毒DNA。

30分钟后，在4°C条件下以5,000 G离心20分钟。最后将上清液收集到一个新的离心管中。此阶段的上清液含有粗病毒提取物。

按照本方案生产的重组PV-GFP的典型产量应在每毫升1×10⁸至1×10⁹个病毒感染单位之间。此处展示了一个基于腺病毒的质粒刺激重组PV产生的示例。粗提病毒提取物中含有PHH1-GFP重组PV，该病毒携带GFP基因，无论是否含有。

在显微照片中观察到，将基于腺病毒的 PXX 质粒应用于 NBK 指示细胞后，在 Pxx 六存在的条件下，GFP 阳性细胞数量更多。当进行 GFP 转导实验时，在 Pxx 六存在下，重组 PV 的产量显著增加。产量从传统方法获得的每细胞 0.3 个 GFP 转导单位（TU）提高至本方法获得的每细胞约 5 个 TU。

绿色荧光蛋白（GFP）转导实验的结果表明，PXX6 中含有的腺病毒 E2A、E4 和 VA RNA 基因能够增强细小病毒的产生。下图展示了通过感染进行重组细小病毒（rec PV）生产的代表性示例。NB324K 细胞首先被纯化的 ADP 辅助病毒感染，随后再被两种重组细小病毒中的一种进行超级感染。

采用粗制细胞提取物通过转导实验测定病毒滴度，结果显示 AD VP 辅助质粒可进一步将重组假病毒（rec PV）的产量提高至每细胞 70 以上。最后，在有或无 ADP 的条件下生产的病毒批次，通过在 MB three 20 4K 指示细胞上进行噬斑实验，分析其复制能力病毒颗粒的含量。结果表明，ADP 辅助质粒在提高重组假病毒产量的同时，并未增加具有复制能力的病毒颗粒的产生，且在后续检测中未发现安全性风险。

该技术可使癌症与基因治疗领域的科学家进一步扩大重组慢病毒的生产规模。利用生物反应器，可在临床环境中大量生产所需的不同病毒株系。