从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

本视频的目的是演示使用免疫沉淀方法从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物的RNA及蛋白质组分的技术。大家好，我叫Garrett Dom，是密苏里大学分子、微生物学与免疫学系的研究生，在Eli Sso博士指导下开展研究。随着高通量测序和高效微阵列分析技术的进步，全局基因表达分析已成为许多科研和疾病模型中易于获取且广泛使用的数据采集方式。

然而，目的基因 mRNA 的稳态水平并不总是与蛋白质的稳态水平直接相关。转录后基因调控可能是导致两者差异的原因，这一过程主要由 RNA 结合蛋白的相互作用所驱动。

转录后调控通过与靶标 mRNA 形成核糖核蛋白复合物，影响 mRNA 的定位、稳定性和翻译。从细胞提取物中鉴定该复合物内未知的从头合成 mRNA 靶标，对于理解 RNA 结合蛋白的作用机制、功能及其对蛋白质表达水平的影响至关重要。本方案介绍了一种称为核糖核蛋白免疫沉淀（ribo protein immunoprecipitation，简称 RIP）的方法，可用于鉴定与核糖核蛋白复合物特异性结合的特定 mRNA。

实验开始前，必须准备好所有试剂、容器和器皿。为获得无RNA酶的玻璃器皿，需使用RNase抑制剂（如Ambion公司的RNA ZAP）处理，随后用经DEPC处理的水冲洗。确保所有试剂均已确认为无RNA酶。该实验的第一步是从细胞裂解液中收获核糖核蛋白复合物：收集处于指数生长期的组织细胞，每份样品通常需获得2至5毫克总蛋白，一般使用两个P150培养皿即足够。

在此，我们正在收获 MB 2 31 和 MC 7 人乳腺癌细胞系，并研究 RNA 结合蛋白的核糖核蛋白相互作用。需要注意的是，针对每一个被研究的 RNA 结合蛋白，必须优化细胞总数和蛋白用量，以最大化目标 mRNA 与 RNA 结合蛋白之间的相互作用。在 4 摄氏度下，以 1000 RPM 离心约 8 到 10 分钟收集细胞，随后用预冷的 PBS 洗涤三次。最后一次洗涤后，轻轻弹击管底，将细胞沉淀重悬于等体积预先配制的含 RNase 和蛋白酶抑制剂的多聚核糖体裂解缓冲液中。

建议准确量取细胞沉淀的体积，用移液器轻轻吹打混合以分散细胞团块，并将裂解液在冰上孵育五分钟。在4°C条件下以13,000 G离心20分钟，以去除裂解液中的碎片，立即把澄清的上清液转移至预冷的无RNA酶的微量离心管中，保持在冰上，并于-80°C保存。

该裂解液可在零下80摄氏度保存长达六个月。避免反复冻融，因为这可能导致蛋白质和/或mRNA降解。最好立即进行免疫沉淀。

使用标准的Bradford蛋白测定法快速定量蛋白浓度和裂解液。接下来，我们需要准备材料以分离我们感兴趣的特定蛋白。首先预溶胀蛋白。

将 Sphero 珠子在含 5% BSA 的 NT2 缓冲液中 4 摄氏度下孵育过夜。使用 NT2 缓冲液以 4:1 的比例与 PAS 珠子混合。可在 4 摄氏度下长期保存，保存时间可达数月。

使用前若添加0.1%叠氮化钠，需去除过量的NT2缓冲液，使最终磁珠与缓冲液的比例为1:1。采用1.5毫升无RNA酶的微量离心管，每份独立的IP反应中加入100微升SRO高速裂解液，并加入30微克抗体。例如，在我们的实验中使用的是who are抗体，即一种小鼠IgG1抗体。

因此，我们的对照抗体也是IgG1。接下来，向抗体-磁珠混合物中加入100至200微升NT2缓冲液。此外，应平行使用同型匹配的抗体或来自同一物种的正常全血清作为抗体对照，以排除背景RNA的干扰。

加入适量抗体至珠子混合物中，4°C 条件下翻转孵育过夜。使用前立即准备抗体包被的珠子，用 1 毫升预冷的 NT2 缓冲液洗涤 5 次，每次在 4°C 下以 13,000 ×g 离心 1 至 2 分钟以洗涤珠子。用移液器或抽吸装置小心去除上清液。

此洗涤步骤有助于去除抗体混合物中未结合的抗体以及RNA污染物。完成最后一次洗涤后，将磁珠重悬于700微升冰上预冷的T2缓冲液中，随后加入多种RNA抑制剂以保护目标mRNA，包括10微升RNAs、10微升100毫摩尔/升DTT和15微升EDTA。用NT2缓冲液将终体积调至900微升。

接下来，我们将对目标复合物进行免疫沉淀。我们强烈建议使用预清除步骤，以降低RIP操作后RNA分析中的背景信号。在4°C下，用15微克同型对照抗体预清除30分钟。加入50微升预先溶胀的未包被抗体的Protein A/G S琼脂糖微珠。

在 4°C 条件下旋转孵育 30 分钟，随后在 4°C 下以 10,000 G 离心。收集沉淀。保留上清液用于免疫沉淀。

接下来，将约含2至5毫克蛋白质的100微升已纯化的澄清裂解液加入准备好的抗体混合物中。稀释裂解液有助于降低背景；包裹试管并用封口膜密封以确保密闭，然后在4°C下翻转孵育4小时。随后在4°C下以5,000 × g离心5分钟，收集沉淀珠，并将上清液保存用于后续潜在分析，按前述方法于-80°C保存。用1毫升冰预冷的TNE2缓冲液重悬珠子，离心洗涤5次。

然后使用手动移液器或抽吸装置去除上清液。为了通过在 NT2 缓冲液中添加脱氧胆酸钠、尿素或 SDS 来降低背景信号，可采用更严格的处理方法。尽量将样品保持在冰上，并快速操作，以尽量减少靶 mRNA 的降解。

最后，我们将使用DNA和蛋白酶K处理，随后进行RNA沉淀，以在用100 µL含5 µL无RNase的DNase I的N NT 2缓冲液洗涤并重悬磁珠后，分离核糖核蛋白中的RNA。将样品置于37 °C孵育5至10分钟。加入1 mL N NT 2缓冲液，于5,000 ×g离心5分钟。

弃去上清液，将SROs沉淀重悬于100微升NT2缓冲液中，加入5微升浓度为10毫克/毫升的蛋白酶K以及1微升10% SDS，于55°C水浴中孵育30分钟，每10分钟轻轻振荡一次。蛋白酶K有助于释放核糖核蛋白组分。离心收集珠粒。

在室温下以 5,000 G 离心五分钟，收集上清液，体积约为 100 微升。接下来取两粒磁珠，加入 200 微升 NT2 缓冲液，以 5,000 G 离心两分钟。收集约 200 微升上清液，弃去磁珠。

混合超纳丁，加入300 µL下层酸性酚-氯仿，涡旋1分钟，室温静置1分钟，然后室温下以最大速度离心1分钟。收集250 µL上层液体。

务必小心，不要扰动界面，以免造成污染。在RNA样品中加入25 µL pH为5.2的乙酸钠、625 µL预冷的100%乙醇以及5 µL甘油蓝（glyco blue），充分混匀后于-20 °C过夜保存。

此外，为确保RNA的正确回收，加入糖蓝（glyco blue）可作为载体分子，增加RNA沉淀的可见性。次日，通过倒置混合3至5次，然后在4°C、12,000 G条件下离心30分钟，弃去上清液。向蓝色沉淀中加入1毫升预冷的70%乙醇，通过倒置或涡旋混合，随后离心。

在 4 °C 条件下，以 12,000 G 离心样品 2 分钟。弃上清，于 4 °C 以 12,000 G 再次离心 1 分钟。用移液器除去残留的 70% 乙醇，并将沉淀空气干燥。

室温孵育五分钟。加入 20 至 40 微升无 RNA 酶、无 DNA 酶的水重悬。样品现可用于 NanoDrop 分光光度法进行定量，并可用于后续实验，如定量实时 PCR 或微阵列分析。在 RNA 分离后，通过微阵列和定量实时 PCR 分析，揭示了 RNA 结合蛋白 who are 的 mRNA 靶标及其在免疫沉淀中的富集情况。

通过 Western 印迹验证表明，目标蛋白得到了纯净的分离。定量 PCR 显示，与 IgG 阴性对照相比，mRNA 靶标 β-actin 的富集倍数显著提高。尽管微阵列分析揭示了 MC7 与 MB-231 乳腺癌细胞系之间独特的基因表达谱，但总体核糖核蛋白免疫沉淀技术已被本研究团队及众多其他研究团队确立为一种优秀的工具，用于分离并研究 RNA 结合蛋白与其 mRNA 靶标之间的相互作用。该方法虽然在本质上和操作中较为敏感，但若正确执行，即可成功分离这些核糖核蛋白复合物，而这些复合物在以往一直难以被发现和分析。