RNA纯化法染色质分离（ChIRP）

以下实验的总体目标是利用定量PCR（QPCR）或高通量测序技术，鉴定与特定非编码RNA相关的DNA区域。该目标通过交联细胞以在体内捕获天然的DNA-RNA相互作用来实现。第二步是裂解细胞，并进行超声处理，以溶解细胞裂解物并将染色质剪切为小片段。

接下来将生物素标记的反义寡核苷酸加入细胞裂解液中，以特异性富集目标 R-N-A-D-N-A 复合物，通过 qPCR 或高通量测序获得结果，从而阐明与非编码 RNA 结合的基因组位点的身份。该技术相较于现有的 R-N-A-D-N-A FISH 等方法的主要优势在于，chIRP 能够在接近碱基对分辨率的水平上绘制全基因组范围内非编码 RNA 的结合位点图谱。该方法有助于我们回答非编码 RNA 领域中的关键科学问题，例如 roX RNA 如何在雄性果蝇中实现剂量补偿。

该技术对非编码核酸相关疾病的治疗具有重要意义，因为它有助于更深入地理解非编码RNA如何调控染色质状态和基因表达。在进行RNA纯化分离染色质（ChIRP）实验时，需收集4000万个细胞，离心后弃去PBS，小心倾斜吸除残留液体，并通过轻敲Falcon管底部使细胞沉淀松动。加入新配制的1%戊二醛，先加入少量体积重悬细胞沉淀，再补加至最终体积，随后颠倒混匀，在室温下于上下摇床或旋转仪上交联10分钟。用终体积1/10量的1.25摩尔甘氨酸终止交联反应，并在室温摇床上继续孵育5分钟，此时细胞将变为亮橙色。

接下来在2000 RCF下离心5分钟，倾出并吸除上清液，用20毫升预冷的PBS重悬沉淀，再次离心，吸除上清液后，将洗涤后的交联细胞沉淀用预冷的PBS重悬。将每毫升细胞转移至eppendorf管中，在4°C下以2000 RCF离心3分钟。离心后，用移液器吸头小心尽可能去除残留的PBS。

快速操作，将所有细胞沉淀在液氮中迅速冷冻，并无限期保存于负80摄氏度。为进行CHIRP实验制备细胞裂解液时，将冷冻的交联细胞沉淀在室温下解冻。用力轻敲以松动并混匀细胞沉淀。

将沉淀物离心后，使用一支锋利的10微升移液器吸头，在精确至1毫克的电子天平上吸除残留的PBS。称量一个空离心管的质量，然后称量每个沉淀物并记录其重量。

向每管中加入10倍体积的裂解缓冲液，并加入新鲜的蛋白酶抑制剂PMSF和Super Ace，重悬沉淀。细胞裂解物必须在制备后立即进行处理。将不超过1.5毫升的裂解物转移至每个15毫升的Falcon管中，并插入超声探头，将其拧紧。

接下来将试管放入生物破碎仪中，在4°C下以最高功率进行超声处理，超声30秒，间歇45秒。每30分钟检查一次裂解液，持续超声直至细胞裂解液不再浑浊。

这可能需要30分钟到4小时，具体时间取决于离心管数量、样品体积、水浴温度以及超声处理时间。当裂解液变得澄清后，取5 µL转移至新的离心管中。加入DNA蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K，涡旋混匀后短暂离心，于50°C孵育45分钟，随后使用PCR纯化试剂盒提取DNA。

在1%琼脂糖凝胶上检测DNA大小。DNA弥散条带的主体应位于100至500个碱基对之间，表明超声处理充分。将超声处理后的样品取1毫升，在4摄氏度下以100 ×g离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中，并在液氮中快速冷冻，随后开始进行chirp实验。室温下解冻染色质样品管，以进行典型的chirp样品操作。

取一毫升裂解液，分别移取10微升用于RNA输入，10微升用于DNA输入，并置于einor管中。冰上保存以待后续使用。将每份染色质样品的一毫升转移至15毫升Falcon管中。

向每个试管中加入 2 mL 杂交缓冲液。接下来，在室温下解冻探针。这些生物素标记的平铺寡核苷酸根据其在 RNA 上的位置进行标记，并分为两个池。

偶数池包含所有偶数编号的探针，而奇数池包含奇数编号的探针。所有实验均使用这两个池进行，二者互为内部对照。

真正实验方案最具挑战性的方面之一是所有杂交和洗涤步骤都必须在37摄氏度下进行。为确保实验温度一致，所有步骤均应在杂交炉内或靠近杂交炉的位置操作。将适量探针加入特定离心管中，充分混匀后，在杂交完成前20分钟开始，于37摄氏度下振荡孵育4小时。

准备C一型磁珠。每100皮摩尔探针使用100微升磁珠。用1毫升无添加剂裂解缓冲液洗涤三次，每次使用Dyna mag二号磁力架将磁珠与缓冲液分离。

最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的裂解缓冲液中，并补充新鲜的PMSF和蛋白酶抑制剂。当四小时的杂交反应完成后，向每管中加入100微升磁珠混合物。在37摄氏度下充分孵育30分钟并震荡；第一次洗涤时，用预热至37摄氏度的1毫升洗涤缓冲液洗涤磁珠。

使用Dyna Mag 15磁力架分离磁珠，倾去上清，加入1毫升洗涤缓冲液重悬，转移至1.5毫升EOR管中。后续洗涤步骤中，于37°C振荡孵育5分钟，将各管在小型离心机中短暂离心后，置于Dyna Mag 2磁力架上静置1分钟以分离磁珠，倾去上清。用Kimwipe纸巾擦去管壁残留液滴，再加入1毫升缓冲液重悬磁珠。

用洗涤缓冲液洗涤，在37摄氏度下振荡孵育5分钟。总共重复洗涤五次，最后一次洗涤后重悬。充分悬浮磁珠，移取100微升用于RNA提取，保留900微升用于DNA组分。

将所有离心管置于Dyna Mag管磁力架上，去除洗涤缓冲液。短暂离心后，再次将离心管放回磁力架，使用10微升移液器尖端。彻底移除每根离心管中残留的洗涤缓冲液。

随后从ChIRP样品中分离RNA和DNA组分，用于定量和测序。该图显示了在HELOC细胞中，人端粒酶RNA或Turk相对于GA dh的富集情况。其中，一种丰度较高的细胞RNA被用作阴性对照。

细胞中大部分的Turk RNA（约88%）通过CHIRP实验被富集下来，而GA DH RNA仅有0.46%被回收，表明富集倍数约为200倍。非特异性探针（如靶向LAC ZRNA的探针）可作为额外的阴性对照，因为LAC ZRNA通常不在哺乳动物细胞中表达。预期与靶标结合的DNA区域在通过qPCR检测时，长链非编码RNA通常在阴性区域表现出富集。

该图显示了通过在相同细胞系中进行 chirp SSE 实验，在原代人包皮成纤维细胞中确定的四个 hot air 结合位点的 QPCR 验证结果，其中 Turk 和 GA DH DNA 位点作为阴性对照区域。无论偶数还是奇数探针组，均显示出相对于阴性区域预期的 hot air 结合位点的富集，这是真正的长链非编码 RNA 结合位点的特征。

通过高通量测序 chirp 富集的 DNA，可以获得长链非编码 RNA 结合位点的全基因组图谱，如本数据所示：trla 长链非编码 RNA Rocks two 已知以剂量补偿所必需的方式与 X 染色体相互作用。对偶数和奇数样本分别进行测序，并去除其独特的噪声，从而生成重叠信号轨迹，每个峰代表 Rocks two 强结合位点。在执行该实验流程时，务必严格遵守无 RNA 酶操作技术。

其他方法，例如蛋白质印迹，可用于回答更多问题，例如在非编码 RNA 被发现后，哪些蛋白质与其相互作用。CHI 技术为 RNA 生物学领域的研究人员提供了在培养细胞和固定组织中绘制 RNA-蛋白质相互作用图谱的途径。