疏水性盐改性Nafion用于酶的固定化与稳定化

本实验的总体目标是合成一种用于固定和稳定酶的类细胞聚合物。为实现这一目标，首先将氖悬浮液与溴化胆铵盐混合，并对混合物进行涡旋振荡，以使纳菲昂的质子化形式与铵盐发生交换。第二步是将所得聚合物干燥，即将混合物倒入舟形模具中，静置使溶剂完全蒸发。

接下来，将聚合物浸泡在去离子水中 12 至 24 小时，以去除多余的盐分。盐分提取后，用水冲洗聚合物，然后通过蒸发使聚合物完全干燥。最后一步是将聚合物转移至洁净的小瓶中，并用溶剂重新悬浮，用于酶的固定化。最终，这种微生物酶固定化聚合物可用于提高酶在活性检测中的稳定性。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该步骤看似极为简单，但干燥过程对于制备功能性聚合物至关重要。本实验操作将由我实验室的研究生 shu 演示。开始用夹竹桃铵盐修饰纳芬（nafion）的步骤：称取相对于纳芬聚合物上磺酸基团三倍摩尔过量的烷基溴化铵盐。

将烷基季铵溴化物盐剧烈转移至玻璃小瓶中。用力振荡一瓶5%（质量/体积）的Nafion悬浮液约30秒，以确保Nafion在溶液中均匀悬浮。用移液器吸取2 mL重新悬浮后的Nafion溶液，加入含有AGU季铵溴化物盐的玻璃小瓶中。

将小瓶在900 RPM下涡旋震荡10至15分钟。接着，将粘稠溶液倒入塑料称量盘中，并使用移液器将小瓶中残留的溶液转移至称量盘内。在此示例中，称量盘部分覆盖，放置于实验台上，使溶剂以超过六小时完全蒸发的速度从称量盘中彻底挥发。

以适当的蒸发速率完全蒸发掉所有溶剂后，应在称量盘底部留下一层黄色或棕色的透明薄膜，如图所示。若溶剂蒸发过快，则会形成脆性或结晶状物质，而非透明薄膜，表明聚合物的胶束结构已被破坏。若溶剂蒸发过慢，或铵盐反应时间过长并吸收了过多水蒸气，则可能形成黏性橙色凝胶或白色结晶物质。

无论哪种情况，都必须重新开始该操作步骤。待所有溶剂以适当的蒸发速率完全蒸发后，向称量盘中加入 10 至 20 毫升 18 兆欧·厘米的去离子水并覆盖表面，在其中浸泡 12 至 24 小时，以去除过量的烷基溴化铵盐和 HBr。12 至 24 小时后，用移液器吸出水分，并加入足量去离子水重新充满称量盘。操作时务必始终从聚合物膜的反方向进行移液，以避免损失任何膜材料。

清洗步骤完成后，总共再冲洗三次。将称量盘敞口放置，直至聚合物完全干燥。完全干燥后，聚合物应呈透明且略带脆性的塑料薄膜状。

相比之下，干燥不充分的聚合物在盐分提取后会呈现出明显不同的外观，如此处所示。使用刮勺小心地将干燥的薄膜从称量盘上取下，并转移至一个洁净的玻璃小瓶中。加入2 mL乙醇和3个陶瓷混合珠，涡旋震荡4小时，或直至聚合物薄膜完全重新悬浮。

经过烷基铵改性的纳米材料溶液现已可用于酶的固定化。若待固定的酶为干燥酶，取一毫克酶置于一个1.5毫升的微量离心管中，并加入一毫升100毫摩尔、pH 7的磷酸盐缓冲液，配制成浓度为一毫克每毫升的酶溶液。取120微升该一毫克每毫升的酶溶液转移至新的离心管中。

加入 60 µL ALK 铵修饰的 Nafion 溶液，涡旋振荡 10 秒。如果需要将该混合物按比例放大以用于大量重复实验，则酶与聚合物溶液的比例必须保持为 2:1。最后，将 60 µL 酶-聚合物溶液用移液器加入三个独立的 1 平方厘米比色皿的底部，静置过夜使其自然干燥。

随后可通过酶活性测定实验来评估酶在聚合物膜中的稳定性，具体方法如上所示。接下来开始该测定实验，将以下试剂加入涂有修饰后的Nafion聚合物和NAD依赖性脱氢酶酶的比色皿中：1.3 毫升 50 毫摩尔的焦磷酸钠溶液、1.5 毫升新配制的 15 毫摩尔烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）溶液以及 0.1 毫升水。

将比色皿放入紫外-可见分光光度计中，设置波长为340纳米。向比色皿中加入0.1毫升乙醇，通过轻轻吹打溶液5次混匀试剂；作为空白对照时，使用0.1毫升额外的水代替0.1毫升乙醇。在向比色皿中加入试剂5分钟后，记录340纳米处的吸光度。

在向qve中加入试剂后20分钟再次记录吸光度，这两个数据点将用于绘制曲线斜率，进而计算固定化PQ的酶学比活性。使用移液器将这些试剂加入含有修饰后的Nafion聚合物和PQQ依赖性脱氢酶的qve共铸膜中。试剂包括1.5毫升磷酸钠和200微升600微摩尔的pH甲基硫酸盐（PMS）。

将反应液置于紫外-可见分光光度计中，设置波长为 600 纳米并调零。分光光度计中加入 100 微升混合液，该混合液由 700 微升六氯靛酚（DCIP）和 200 微升目标底物组成。对于空白对照，通过轻轻吹吸溶液五次以混匀试剂。

使用 200 微升水代替目标底物。在加入试剂后 5 分钟，记录 600 纳米处的吸光度。

加入试剂开始此检测后20分钟，再次记录吸光度。将以下溶液加入与改性Nafion聚合物和葡萄糖氧化酶共铸的Q VET中：2毫升含有0.2摩尔对羟基苯甲酸、0.02%叠氮化钠、128单位过氧化物酶、0.3毫摩尔4-氨基安替比林、1摩尔磷酸钾和50毫摩尔葡萄糖的溶液。

通过上下吹打五次使溶液混合均匀。将Q vet放入紫外-可见分光光度计中，设置波长为510纳米。在试剂加入qve后五分钟。

在510纳米处测定吸光度。然后在加入试剂后20分钟再次测定吸光度。此表格显示了固定化的NAD依赖性葡萄糖脱氢酶活性以及经筛选的改性Nafion聚合物的检测结果。

观察到，固定化的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶比酶与缓冲液溶液具有更低的比活性。这是因为聚合物膜会降低大分子的传质效率，尽管测定中的底物葡萄糖分子较小，但辅酶NAD需要在膜内外扩散。对于NAD依赖型脱氢酶而言，由于酶在聚合物中固定化所导致的传质限制，使得观测到的酶活性降低。

下表显示了固定在选定改性Nafion聚合物上的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶活性的检测结果。需要注意的是，大多数Nafion薄膜上固定的酶活性高于缓冲液中的游离酶。由于PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶是一种膜结合蛋白，疏水性改性的Nafion提供了比缓冲液更类似于膜的环境，有助于稳定具有活性的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶，从而增强酶的活性。

最后，为葡萄糖氧化酶比活性的代表性检测结果。该表格展示了固定化并经筛选的改性Nafion聚合物。每种聚合物与三种酶分别进行的酶学检测表明，相对于游离酶溶液，其相对比活性的变化趋势依赖于具体的酶体系。

因此，必须针对每种酶优化所需的精确聚合物。在尝试此操作时，需要注意干燥步骤对这一特定操作至关重要。