Name: 固定化酶和稳定的疏水盐改性的Nafion (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 了解疏水改性Nafion酶固定化膜的合成方法及其在蛋白质固定化中的应用。该方法通过铵盐交换和溶剂蒸发等步骤，显著提高了酶在活性测定中的稳定性，适用于多种生化检测。

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作者感谢美国海军研究办公室、美国大豆委员会和国家科学基金会的资助。

1. 使用季铵盐对纳滤膜进行改性
<ol>
	<li>剧烈振摇一瓶5% w/v的Nafion悬浮液约30秒，以确保Nafion在溶液中均匀悬浮。</li>
	<li>用移液器吸取2 mL重新悬浮后的Nafion至玻璃小瓶中（小瓶体积可在2.5 mL至10 mL之间）。</li>
	<li>称取相对于Nafion聚合物上磺酸基团摩尔量三倍过量的烷基溴化铵盐（适当的质量见表1），并将其加入含有2 mL Nafion的小瓶中。</li>
	<li>将小瓶在1500 rpm条件下涡旋振荡10–15分钟。</li>
	<li>将粘稠溶液倒入一个尺寸约为3英寸×3英寸的塑料称量盘中，并用移液器将小瓶中残留的溶液转移至称量盘内。</li>
	<li>让溶剂从称量盘中缓慢蒸发，最终在称量盘底部形成一层黄色至棕色透明薄膜（图2）。溶剂蒸发速率应控制在全部溶剂完全蒸发所需时间超过6小时为宜。若溶剂蒸发过快，会形成白色、结壳状物质，表明聚合物的胶束结构已被破坏，必须重新开始实验；若蒸发过慢，则可能需要使用除湿机，因为蒸发过慢通常会导致形成黏稠的橙色凝胶，此时也必须重新开始实验。典型的溶剂蒸发温度范围为20–37 °C。实际干燥条件取决于环境的相对湿度和温度，但关键在于干燥过程需足够缓慢以维持胶束结构，又不能过慢而引发凝胶形成。</li>
	<li>向称量盘中加入18 MΩ·cm的去离子水（10–20 mL），盖上盖子，浸泡12–24小时，以去除多余的烷基溴化铵盐和HBr。</li>
	<li>倒出（或用移液器吸出）水溶液，并每次用足量去离子水充满称量盘，重复清洗3次。此步骤中需小心避免损失任何聚合物薄膜。</li>
	<li>将称量盘敞口放置，直至聚合物完全干燥。此时聚合物应为透明且略脆的塑料薄膜。若环境湿度较高，可能需要使用除湿机，以便及时完成蒸发过程。</li>
	<li>用刮刀小心地将干燥的薄膜从称量盘上剥离，并转移至一个洁净的玻璃小瓶中。</li>
	<li>加入2 mL乙醇和3颗陶瓷混合珠，涡旋振荡4小时，或直至聚合物薄膜完全重新悬浮。</li>
</ol>
2. 将酶固定于TBAB修饰的Nafion中以进行活性测定
<ol>
	<li>对于干燥的酶，称取1-10 mg酶于1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 100 mM pH 7磷酸盐缓冲液，配制成1-10 mg/mL的酶溶液。对于已处于溶液状态的酶，使用二辛可宁酸（BCA）法13测定蛋白含量，并加入适量的100 mM磷酸盐缓冲液，使蛋白浓度达到1-10 mg/mL。1-10 mg/mL通常相当于1-50 nmol/mL。</li>
	<li>向120 μL的1 mg/mL酶溶液中加入60 μL烷基铵修饰的Nafion溶液，涡旋振荡10秒。（该体系可按比例放大以满足大量重复实验的需求，但需保持酶溶液与聚合物溶液的比例为2:1。）</li>
	<li>取60 μL酶/聚合物混合溶液分别加入3个独立的1 cm2比色皿底部，室温下静置过夜使其自然干燥。</li>
</ol>
3. 固定化NAD依赖性脱氢酶酶活性测定
<ol>
	<li>向比色皿中加入 1.3 mL 的 50 mM 焦磷酸钠（pH 8.8）、1.5 mL 的 15 mM NAD（新鲜配制）以及 0.1 mL 水。</li>
	<li>将比色皿放入紫外/可见光分光光度计（例如 ThermoScientific Evolution 260 Bio 和 Thermo Spectronic Genesys 20）中，并设置波长为 340 nm。</li>
	<li>将分光光度计调零，然后加入 0.1 mL 乙醇。通过轻轻吹吸溶液 5 次混匀试剂。作为空白对照，用 0.1 mL 额外的水代替 0.1 mL 乙醇。</li>
	<li>在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 340 nm 处的吸光度。绘制这两个数据点以获得斜率，用于酶活性计算。</li>
</ol>
4. 固定化PQQ依赖性脱氢酶的测定
<ol>
	<li>向比色皿中加入 1.5 mL 磷酸钠缓冲液（pH 7.3）和 200 μL 的 600 μM PMS。</li>
	<li>将比色皿放入紫外-可见分光光度计中，设定波长为 600 nm，然后将仪器调零。</li>
	<li>加入 100 μL 的 700 μM DCIP 和 200 μL 待测底物（乙醇、乙醛、甘油、葡萄糖或甘油醛），通过轻轻吹吸溶液 5 次混匀试剂。作为空白对照时，使用 200 μL 水代替待测底物。</li>
	<li>在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 600 nm 处的吸光度。</li>
</ol>
5. 固定化葡萄糖氧化酶的测定
<ol>
	<li>向比色皿中加入 2.0 mL 溶液，该溶液含有 0.2 M p-羟基苯甲酸、0.02 % (w/v) 叠氮化钠、128 U 辣根过氧化物酶、0.3 mM 4-氨基安替比林、1 M 磷酸钾和 50 mM 葡萄糖。用移液器上下吹打混合溶液 5 次。</li>
	<li>将比色皿放入紫外/可见光分光光度计中，并将波长设置为 510 nm。</li>
	<li>在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 510 nm 处的吸光度。</li>
</ol>
6. 代表性结果
若将原始的盐/聚合物共铸膜干燥过快，则会破坏改性Nafion聚合物的胶束结构。图2展示的是正确干燥后的盐/聚合物混合物，形成透明的浅棕色薄膜。若干燥过快，可能导致聚合物形成不透明的白色碎片，因为干燥过程会破坏胶束结构。
将改性Nafion聚合物与酶混合并共铸在比色皿底部后，可利用酶活性测定实验评估酶在聚合物膜内的稳定性。表2-4分别展示了两种脱氢酶和葡萄糖氧化酶固定于不同改性Nafion薄膜中的测定结果。可见，与缓冲溶液中的酶相比，固定化酶表现出更高的活性，表明改性Nafion聚合物实际上可增强某些酶的活性（称为超活性）。而其他酶则因存在传质限制，在固定于聚合物中时其比活性下降（例如纤维素酶和淀粉酶，其底物为较大的大分子）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>使用的季铵盐</td>
			<td>三倍过量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3A (四丙基溴化铵)</td>
			<td>32.37 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB (四丁基溴化铵)</td>
			<td>39.19 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPAB (四戊基溴化铵)</td>
			<td>46.01 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEHA (三乙基己基溴化铵)</td>
			<td>32.37 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHA (三甲基己基溴化铵)</td>
			<td>27.25 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA (三甲基辛基溴化铵)</td>
			<td>30.66 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA (三甲基癸基溴化铵)</td>
			<td>34.07 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA (三甲基十二烷基溴化铵)</td>
			<td>37.48 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA (三甲基十四烷基溴化铵)</td>
			<td>40.89 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA (三甲基十六烷基溴化铵)</td>
			<td>44.31 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA (三甲基十八烷基溴化铵)</td>
			<td>47.71 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于Nafion聚合物改性的四烷基铵盐的使用量。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nafion 类型</td>
			<td>酶活性 (U/g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液（无聚合物）</td>
			<td>16.63 ± 8.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nafion (未修饰)</td>
			<td>9.25 ± 2.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA</td>
			<td>3.23 ± 2.92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB</td>
			<td>3.93 ± 3.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA</td>
			<td>4.19 ± 1.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA</td>
			<td>3.51 ± 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA</td>
			<td>8.00 ± 4.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHA</td>
			<td>1.68 ± 1.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA</td>
			<td>4.83 ± 0.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA</td>
			<td>10.45 ± 3.20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 固定于选定改性Nafion聚合物中的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶活性（注：固定化活性取决于酶的初始比活性）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nafion 类型</td>
			<td>酶活性 (mU/g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液（无聚合物）</td>
			<td>7.18 ± 0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nafion（未修饰）</td>
			<td>70.1± 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA</td>
			<td>133 ± 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB</td>
			<td>244 ± 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA</td>
			<td>221 ± 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA</td>
			<td>1.78 ± 0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA</td>
			<td>206 ± 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEHA</td>
			<td>40.1 ± 50.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA</td>
			<td>1.45 ± 0.06</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 固定在选定改性Nafion聚合物中的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶活性（注：固定化活性取决于酶的初始比活性）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nafion 类型</td>
			<td>酶活性 (U/g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液（无聚合物）</td>
			<td>103.61 ± 3.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nafion (未修饰)</td>
			<td>19.93 ± 10.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMTDA</td>
			<td>247.25 ± 12.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBAB</td>
			<td>152.27 ± 5.29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDDA</td>
			<td>262.05 ± 6.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMOA</td>
			<td>129.18 ± 2.31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMDA</td>
			<td>141.23 ± 1.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHA</td>
			<td>131.75 ± 2.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMHDA</td>
			<td>132.50 ± 1.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMODA</td>
			<td>136.50 ± 0.96</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4. 固定于选定改性Nafion聚合物中的葡萄糖氧化酶比活性的代表性数据（注：固定化酶活性取决于酶的初始比活性）。
<img alt="细胞膜示意图；季铵盐添加显示蛋白质-脂质相互作用。" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. TBAB掺入Nafion聚合物及其在酶固定化中的后续应用示意图。
<img alt="用于静态平衡分析实验的六边形培养皿中的细菌培养物生长情况。" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. Nafion 与 TBAB 初始共铸薄膜的光学照片。缓慢干燥后得到一层透明的浅棕色薄膜，覆盖在称量盘底部。

<ol><li>Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+biofuel+cells+for+implantable+and+microscale+devices+Chem%5BTitle%5D)+AND+%22Rev%22%5BJournal%5D)">Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem.</a> Rev. 104, 4867-4886 (2004).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

在所述实验步骤中，使用四烷基铵盐对商用纳菲昂（Nafion）进行改性，以制备可形成胶束结构的聚合物，该聚合物可用于酶的固定化与稳定化。本方法中描述的检测表明，该聚合物能够固定多种不同类型的酶，并保持较高的酶活性保留率。如果目标酶的活性非常低或纯度不高，可能需要使用更高浓度的酶溶液，但只要酶的固定化浓度不超过10 mg/mL，通常不会影响固定化过程。该方法的简便性使其区别于其他酶固定化技术，无需任何合成步骤（如聚合物合成或交联反应）。此外，这些合成步骤常常会导致蛋白质变性或显著降低其活性。1 mg/mL的蛋白浓度仅为实现高载酶量所建议的浓度；也可采用较低的酶浓度，但会导致单位体积催化活性降低。理论上，只要酶能够溶解，即可使用更高的酶浓度。
	由于这些聚合物可溶于低级脂肪醇（如甲醇、乙醇和丙醇），因此在将聚合物悬浮液与酶混合时，必须存在较高比例的醇。在许多情况下，只要在包埋酶的薄膜成膜后及时蒸发乙醇，这并不会造成问题。然而，如果某种酶完全不耐受醇，在加入改性Nafion悬浮液后会发生变性或沉淀，则这种固定化方法可能存在局限性。在极少数情况下，酶在与改性Nafion悬浮液混合时会发生沉淀...

<table><tbody><tr><td>Nafion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70160</td><td></td></tr><tr><td>季铵盐溴化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>乙醇脱氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3263</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8010</td><td></td></tr><tr><td>吩嗪硫酸甲酯（PMS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>2,6-二氯靛酚（DCIP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1878</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240141</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>过氧化物酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>4-氨基安替比林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06800</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见分光光度计</td><td>Thermo</td><td>Evolution 260 Bio 或 Spectronic Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>旋涡混合器（Vortex Genie）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

疏水性盐改性nafion用于酶的固定化与稳定化

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

近十年来，固定化和稳定化酶在生物催化、生物传感器和生物燃料电池等领域得到了广泛应用。1-3 在大多数生物电化学应用中，酶或细胞器通过某种聚合物基质被固定在电极表面。这种聚合物支架应能保持酶的稳定性，并允许分子和离子在基质内外自由扩散。用于此类固定化的大多数聚合物基于聚胺或聚醇——这些聚合物可模拟其所包封酶的天然环境，并通过氢键或离子键稳定酶。另一种稳定酶的方法是使用胶束，其含有可包封并稳定酶的疏水区域。4,5 特别地，Minteer 团队开发了一种基于市售 Nafion 的胶束聚合物。6,7 Nafion 本身是一种胶束聚合物，可借助通道促进质子及其他小阳离子的扩散，但其胶束和通道极小，且由于侧链上的磺酸基团而具有强酸性，不利于酶的固定化。然而，当 Nafion 与过量的疏水性烷基铵盐（如四丁基溴化铵（TBAB））混合时，季铵阳离子会取代质子，成为聚合物侧链上磺酸根的反离子（图 1）。这导致聚合物内部形成更大的胶束和通道，允许大分子底物和对酶功能必需的离子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））扩散。这种改性 Nafion 聚合物已被用于固定多种不同类型的酶以及线粒体，应用于生物传感器和生物燃料电池中。8-12 本文描述了一种新型的胶束聚合物酶固定化膜制备方法，可实现酶的稳定化。以下详细说明该胶束酶固定化膜的合成方法、酶在膜内固定化的操作步骤，以及测定固定化酶比活性的分析方法。

本文将介绍合成疏水改性Nafion酶固定化膜的方法，以及如何在膜内固定蛋白质和/或酶并测定其特异性活性。

疏水性盐改性Nafion用于酶的固定化与稳定化

在过去十年中，固定化与稳定化酶在生物催化、生物传感器和生物燃料等领域得到了广泛应用……

本实验的总体目标是合成一种用于固定和稳定酶的类细胞聚合物。为实现这一目标，首先将氖悬浮液与溴化胆铵盐混合，并对混合物进行涡旋振荡，以使纳菲昂的质子化形式与铵盐发生交换。第二步是将所得聚合物干燥，即将混合物倒入舟形模具中，静置使溶剂完全蒸发。接下来，将聚合物浸泡在去离子水中 12 至 24 小时，以去除多余的盐分。盐分提取后，用水冲洗聚合物，然后通过蒸发使聚合物完全干燥。最后一步是将聚合物转移至洁净的小瓶中，并用溶剂重新悬浮，用于酶的固定化。最终，这种微生物酶固定化聚合物可用于提高酶在活性检测中的稳定性。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该步骤看似极为简单，但干燥过程对于制备功能性聚合物至关重要。本实验操作将由我实验室的研究生 shu 演示。开始用夹竹桃铵盐修饰纳芬（nafion）的步骤：称取相对于纳芬聚合物上磺酸基团三倍摩尔过量的烷基溴化铵盐。将烷基季铵溴化物盐剧烈转移至玻璃小瓶中。用力振荡一瓶5%（质量/体积）的Nafion悬浮液约30秒，以确保Nafion在溶液中均匀悬浮。用移液器吸取2 mL重新悬浮后的Nafion溶液，加入含有AGU季铵溴化物盐的玻璃小瓶中。将小瓶在900 RPM下涡旋震荡10至15分钟。接着，将粘稠溶液倒入塑料称量盘中，并使用移液器将小瓶中残留的溶液转移至称量盘内。在此示例中，称量盘部分覆盖，放置于实验台上，使溶剂以超过六小时完全蒸发的速度从称量盘中彻底挥发。以适当的蒸发速率完全蒸发掉所有溶剂后，应在称量盘底部留下一层黄色或棕色的透明薄膜，如图所示。若溶剂蒸发过快，则会形成脆性或结晶状物质，而非透明薄膜，表明聚合物的胶束结构已被破坏。若溶剂蒸发过慢，或铵盐反应时间过长并吸收了过多水蒸气，则可能形成黏性橙色凝胶或白色结晶物质。无论哪种情况，都必须重新开始该操作步骤。待所有溶剂以适当的蒸发速率完全蒸发后，向称量盘中加入 10 至 20 毫升 18 兆欧·厘米的去离子水并覆盖表面，在其中浸泡 12 至 24 小时，以去除过量的烷基溴化铵盐和 HBr。12 至 24 小时后，用移液器吸出水分，并加入足量去离子水重新充满称量盘。操作时务必始终从聚合物膜的反方向进行移液，以避免损失任何膜材料。清洗步骤完成后，总共再冲洗三次。将称量盘敞口放置，直至聚合物完全干燥。完全干燥后，聚合物应呈透明且略带脆性的塑料薄膜状。相比之下，干燥不充分的聚合物在盐分提取后会呈现出明显不同的外观，如此处所示。使用刮勺小心地将干燥的薄膜从称量盘上取下，并转移至一个洁净的玻璃小瓶中。加入2 mL乙醇和3个陶瓷混合珠，涡旋震荡4小时，或直至聚合物薄膜完全重新悬浮。经过烷基铵改性的纳米材料溶液现已可用于酶的固定化。若待固定的酶为干燥酶，取一毫克酶置于一个1.5毫升的微量离心管中，并加入一毫升100毫摩尔、pH 7的磷酸盐缓冲液，配制成浓度为一毫克每毫升的酶溶液。取

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生物工程

固定化酶和稳定的疏水盐改性的Nafion

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