Name: B7-H1（PD-L1）免疫组化染色石蜡的嵌入式幻灯片的胰腺癌组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习免疫组化染色技术检测胰腺腺癌组织中B7-H1（PD-L1）的表达水平。该方法通过抗原修复和DAB显色实现蛋白定位，为研究肿瘤微环境中的免疫抑制机制提供可靠手段。

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E.B.、K.M.B. 和 H.X. 贡献相同。本研究由美国国家癌症研究所胃肠道癌症SPORE项目（P50 CA062924）、NIH K23 CA148964、Lustgarten基金会、Viragh基金会、ASCO青年研究者奖、NIH 5T32 CA0090701-28培训基金、Sol Goldman胰腺癌中心以及国家胰腺基金会资助。

B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的一员，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞过度表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。
近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明B7-H1作为潜在治疗靶点的重要性。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。
为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战13-18。我们已成功建立适用于胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片的B7-H1染色方案。本文所述的B7-H1染色方案可在背景染色极低的情况下，稳定地显示B7-H1的膜性和胞质性表达。
1. 脱蜡
<ol>
 <li>将载玻片在 55 °C 下烘烤 20 分钟。</li>
 <li>在通风橱中，将载玻片浸入二甲苯中 10 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入新鲜二甲苯中 10 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入 100% 乙醇中 5 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入新鲜 100% 乙醇中 5 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入 95% 乙醇中 5 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入 80% 乙醇中 5 分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入去离子水中 5 分钟。</li>
</ol>
2. 抗原修复
<ol>
 <li>将切片浸入Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）中，置于压力锅内加热至125 °C，持续30秒，然后降至90 °C，持续10秒。</li>
 <li>让切片冷却60分钟。</li>
 <li>将切片浸入TBST中5分钟；重复两次。</li>
</ol>
3. 染色
<ol>
 <li>用擦去载玻片上组织周围的溶液，用疏水笔在组织周围画一个圆圈。</li>
 <li>将载玻片放入湿盒中，确保在整个染色过程中组织不会干燥。在载玻片的疏水圈内加入一滴过氧化物酶阻断剂（约200 μl 或更多，以完全覆盖组织区域），将载玻片在过氧化物酶阻断剂中孵育5分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴BLOCK ACE封闭缓冲液，孵育15分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴亲和素（Avidin）溶液，孵育15分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴生物素（Biotin）溶液，孵育15分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。</li>
 <li>将载玻片与鼠抗人B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）或鼠IgG1 κ同型对照抗体以1:1,000稀释度（溶于200 μl TBST中）在4 °C孵育过夜，时间为22小时±1小时。TBST中最终抗体浓度为2.57 μg/ml。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。</li>
 <li>将载玻片与生物素标记的辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG1二抗以1:500浓度（溶于200 μl 2%山羊血清溶液中）孵育30分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴链霉亲和素-生物素复合物（必须在使用前至少30分钟配制），孵育15分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴扩增试剂（用TBST按2:1稀释），孵育4分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP），孵育15分钟。</li>
 <li>用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴3,3-二氨基联苯胺（DAB）底物和显色剂，显色2分钟。</li>
 <li>显色完成后立即用ddH2O冲洗载玻片1-2分钟。</li>
 <li>在每张载玻片上加一滴苏木精染液，孵育90秒。</li>
 <li>用ddH2O冲洗1-2分钟。</li>
 <li>用含洗涤剂的自来水冲洗1-2分钟。</li>
 <li>用ddH2O冲洗1-2分钟。</li>
</ol>
4. 脱水与封片
<ol>
 <li>将载玻片浸入80%乙醇中3分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入95%乙醇中3分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入100%乙醇中5分钟，重复一次。</li>
 <li>将载玻片浸入二甲苯中5分钟，重复一次。</li>
 <li>在载玻片上滴加一滴Cytoseal 60，盖上盖玻片。</li>
</ol>
表1列出了上述实验步骤中所使用的试剂。

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

既往研究已报道在多种癌症的冷冻切片上进行B7-H1的免疫组织化学染色3,4。然而，临床肿瘤样本通常仅以石蜡包埋组织块的形式保存。近年来，5H1单克隆抗体已成功应用于包括肾细胞癌、宫颈癌、膀胱癌和黑色素瘤在内的石蜡包埋肿瘤组织的染色13-18。也有研究报道使用其他单克隆抗体对胰腺导管腺癌组织的石蜡切片9,19或冰冻切片20进行B7-H1染色。本文中，我们展示了使用抗B7-H1的5H1单克隆抗体对石蜡包埋的胰腺导管腺癌组织进行成功染色的结果。B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达具有异质性，这与多种其他恶性肿瘤（如黑色素瘤）中的表达模式相似4,21。在腺癌细胞中可同时观察到B7-H1的膜表达和胞质表达（图1和图2）。B7-H1的膜表达与其生物学功能一致。而B7-H1在肿瘤组织中的胞质表达作用仍有待进一步研究。正常的胰腺导管上皮细胞或腺泡细胞不表达B7-H1（图4）。
本实验方案中的所有步骤均在室温下进行，仅过夜孵育在...

<table><tbody><tr><td>CSA 系统</td><td>Dako</td><td>K1500</td><td>包含本方案中提及的以下试剂：过氧化物酶阻断剂、链霉亲和素-生物素复合物、扩增试剂、链霉亲和素-HRP 以及 DAB 底物和发色剂</td></tr><tr><td>亲和素/生物素阻断试剂盒</td><td>Vector</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Block ACE</td><td>Serotec</td><td>BUF029</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记抗小鼠 IgG1 抗体</td><td>BD</td><td>553441</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 K 同型对照</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-85</td><td></td></tr><tr><td>TBS（Tris 缓冲盐水），10X</td><td>Cellgro</td><td>46-012-CM</td><td>10xTBS 含有 80 g/L NaCl 和 24.2 g/L Tris；&lt;br/&gt; 使用 ddH₂O 稀释至 1X 用于洗涤；</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>将 1 ml 加入 1 L 的 1X TBS 中以配制 TBST</td></tr><tr><td>靶点修复液，20x</td><td>Celerus Wave</td><td>014-3000-000</td><td>使用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 1x</td></tr><tr><td>190 证明乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Pharmo-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>95057-827</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>72804</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>湿盒</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 试剂与设备。</td></tr></tbody></table>

胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片中b7-h1（pd-l1）的免疫组织化学染色

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的成员之一，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞高表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。
近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明，B7-H1可能是重要的潜在治疗靶点。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。
为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战13-18。我们已成功建立了适用于胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片的B7-H1染色方案。本文所述的B7-H1染色方案可实现B7-H1稳定一致的膜性和胞质性染色，且背景染色较弱。

成功的B7-H1免疫组化染色将显示胰腺导管腺癌中B7-H1的异质性表达（棕黄色信号为DAB显色）。部分胰腺导管腺癌细胞主要表现为B7-H1的膜表达（图1A），而其他细胞则主要表现为B7-H1的胞质表达或B7-H1表达甚少（图2和图3）。正常的胰腺导管上皮几乎不表达B7-H1（图4）。以小鼠IgG1 κ同型对照抗体替代抗B7-H1抗体进行染色，结果显示背景染色极少（图1B）。
<img src="/files/ftp_upload/4059/4059fig1.jpg" alt="组织病理学比较、免疫组织化学染色结果、组织分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. A. 使用抗B7-H1（克隆5H1抗体）进行免疫组织化学染色，显示部分胰腺导管腺癌细胞膜呈阳性表达。B. 使用同型对照IgG1进行免疫组织化...

B7-H1（PD-L1）与其受体PD-1的结合在肿瘤微环境中提供了主要的肿瘤诱导性免疫抑制信号。本文介绍了一种免疫组织化学染色技术，用于表征B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达水平与定位情况。

胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片中B7-H1（PD-L1）的免疫组织化学染色

B7-H1/PD-L1 是 B7 免疫调节细胞表面蛋白家族的成员，在细胞介导的免疫反应负调控中发挥重要作用……

本实验的总体目标是利用免疫组织化学染色技术，检测人胰腺导管腺癌组织石蜡切片中 B7-H1（PD-L1）的表达情况。首先去除组织切片中的石蜡并进行水化处理，完成切片的脱蜡和复水。实验的第二步为抗原修复，需使用压力锅进行处理，以利于后续组织染色。抗体染色程序之后是信号放大和DAB显色步骤。最后步骤为脱水并封片组织。完成后。显微镜观察与图像分析可用于可视化膜性和胞质性 B7-H1。该方法有助于解答胰腺导管腺癌研究中的关键问题，使我们更深入理解 B7-H1（BTLA 配体 1）如何在肿瘤微环境中介导抗肿瘤免疫的抑制作用。与现有方法（如冷冻切片染色）相比，该技术的主要优势在于已针对石蜡包埋组织切片进行优化，而石蜡切片通常更易获得且更便于长期保存。在载玻片上进行可靠的抗体染色之前，必须先去除石蜡。因此，在制备石蜡包埋组织的载玻片时，首先将载玻片在55摄氏度下烘烤20分钟。接下来，在化学通风橱中，使用一系列七种化学溶液进行脱蜡处理，首先将载玻片浸入二甲苯中10分钟。接着，将切片浸入第二份新鲜的二甲苯溶液中，持续10分钟。第三步，将切片浸入100%乙醇中5分钟。第四步，再次将切片浸入新鲜的100%乙醇中，持续5分钟。第五步，将切片浸入95%乙醇中五分钟。第六步，将切片浸入80%乙醇中五分钟。最后，用去离子水清洗切片五分钟，使其洁净。去除石蜡后，接下来需要暴露抗原。首先，将切片浸入 Tris EDTA 缓冲液中。然后，使用压力锅的两步程序对切片进行加热处理。首先，在 125 摄氏度下加热 30 秒。其次，在 90 摄氏度下加热 10 秒。然后将载玻片放置一旁，冷却至室温。玻片冷却一小时后，用 TBST 溶液洗涤两次，每次五分钟。现在可对每张玻片进行染色。首先用吸水纸吸干组织周围的 TBST 溶液，然后用疏水笔在组织周围画一个圆圈。在整个操作过程中，需将载玻片置于湿盒中以避免组织干燥。当不进行浸洗时，应在载玻片的疏水圈内滴加一滴过氧化物酶阻断剂。孵育5分钟后，用TBST缓冲液洗去过氧化物酶阻断剂。然后将切片浸入 TBST 中洗涤 5 分钟。从溶液中取出切片，轻轻甩去多余的 TBST。接着在每张切片上加一滴 CE 封闭缓冲液，在室温下孵育 15 分钟。用 TBST 冲洗载玻片，并在 TBST 中浸泡 5 分钟以清洁。随后在每张载玻片上加一滴 Vidan 溶液，静置 15 分钟。使用相同的 TBST 冲洗和浸泡程序去除 AVADON。现在加入生物素，孵育五分钟，再用TBST缓冲液清洗切片。随后将切片与小鼠单克隆抗体或对照抗体稀释液进行孵育。在TBST中，4摄氏度下孵育过夜（22小时），使任一抗体结合。次日，用TBST洗涤切片三次，每次洗涤包括TBST冲洗和5分钟浸泡。在洗去一抗的过程中，需重复进行数次上述三重洗涤步骤。准备STR肌联蛋白Bio ITIN复合溶液，该溶液应在使用前至少30分钟配制完毕。现在将切片在山羊血清溶液中与生物素标记的山羊抗-US二抗在室温下孵育30分钟。在此孵育期间，按照DACO试剂盒说明书配制DAB底物显色液。该溶液可在避光条件下于4摄氏度保存最多8小时。孵育结束后，用TBST洗涤三次。随后在每张玻片上滴加一滴strippin生物素复合物，孵育15分钟，再用TBST洗涤玻片三次。接下来，在每张玻片上滴加一滴扩增试剂。孵育4分钟，用TBST洗涤玻片三次。洗去扩增试剂后，向每张玻片滴加一滴链霉亲和素-HRP，并孵育15分钟。继续操作前，再用 TBST 洗涤三次。现在进入该实验流程中最敏感的步骤。向一张载玻片上加入一滴 DAB 底物显色剂及底物过氧化氢，开始观察显色情况，即 DAB 底物的显色反应。显色反应的孵育时间通常为两分钟，但我们通常在显微镜下监测显色过程，以确保染色效果最佳。为保证每轮染色的背景最低，我们会同时设置一张前一批次的切片和一张扁桃体切片作为阳性对照。染色完成后，立即用清水洗涤切片，不可使用TBST缓冲液。在载玻片上加入一滴血红素，孵育90秒。立即用去离子蒸馏水冲洗载玻片，随后用含肥皂的自来水冲洗，再用更多去离子水冲洗。至此完成染色步骤。所有切片染色完成后，在封片前使用乙醇系列对切片进行脱水。首先，将切片浸入80%乙醇中3分钟；其次，将切片浸入95%乙醇中3分钟。第三和第四步，将切片浸入100%乙醇中5分钟。第五和第六步，将切片浸入二甲苯中5分钟。最后，向每张切片各加一滴封片剂，然后轻轻盖上盖玻片。载玻片现已准备好用于显微镜免疫组织化学染色，B7-H1的染色结果显示胰腺导管腺癌中B7-H1呈异质性表达。使用DAB显色后，阳性信号呈棕色。部分胰腺导管腺癌细胞主要表现为B7-H1的膜表达，而其他细胞则主要表现为B7-H1的胞质表达或几乎无B7-H1表达。正常的胰腺导管上皮细胞仅显示微弱的B7-H1染色。使用小鼠IgG1κ同型对照抗体替代抗B7-H1抗体时，背景染色极低。掌握该技术后，若操作得当，整个流程可在两天内完成，总计约七小时操作时间，并包含一个22小时的过夜孵育步骤。该技术为肿瘤学领域的研究人员探索B七H一PD L一信号通路在其他恶性肿瘤中的作用奠定了基础。

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