Name: 小胶质细胞的小分子RNA检测在正常中枢神经系统的实时PCR技术在神经发炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 了解利用实时PCR技术检测中枢神经系统小胶质细胞中小分子RNA表达的方法。本方案通过密度梯度离心分离单核细胞，结合流式细胞术鉴定细胞群体，为研究神经炎症中的基因调控机制提供可靠手段。

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本工作得到了 NIH R01 NS071039-01A1 研究基金的资助。

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

近年来，小胶质细胞及其在与神经炎症和神经退行性病变相关多种病理过程中的作用受到广泛关注。此外，微小RNA（microRNA）在免疫细胞和癌细胞分化中的作用在过去几年中显著增加5,10。我们此前已报道miR-124在维持正常中枢神经系统中小胶质细胞非活化或静息表型中的作用7，但其他类型微小RNA在小胶质细胞表型及活化状态中的作用仍有待揭示。这需要开发新的方法，以特异性检测小胶质细胞中微小RNA的表达水平。
小胶质细胞在实验中难以处理，因为它们从中枢神经系统（CNS）分离后会迅速活化并发生显著改变。此前已有文献发表过从正常中枢神经系统分离小胶质细胞的方案11,12。尽管这些方案可用于RNA提取，但我们认为它们更适合mRNA表达分析，而不适用于microRNA表达的检测。首先，许多研究者采用对匀浆组织进行酶消化或磁珠分选纯化的方法，这些操作会激活小胶质细胞，导致microRNA表达发生显著变化（未发表观察结果）。其次，作者使用基于Trizol的方法提取RNA11，而这种方法在处理少量小胶质细胞时，尤其...

<table><tbody><tr><td> 1X PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td>可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4</td></tr><tr><td> 10X PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30258.02</td><td>可在实验室中用干粉配制，pH：7.2–7.4</td></tr><tr><td>DMEM；FBS</td><td>GBCO</td><td>11965；10438</td><td></td></tr><tr><td>miRVana 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td> Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500 ml</td><td>通过将10 ml 10X PBS与90 ml Sigma公司的Percoll混合，配制100 ml 100% Percoll。通过将35 ml 100% Percoll与15 ml DMEM混合，配制50 ml 70% Percoll。通过将20 ml 100% Percoll与30 ml 1X PBS混合，配制50 ml 40% Percoll</td></tr><tr><td>MOG&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt; 肽</td><td>AnaSpec Inc</td><td>60130-5</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>DIFCO</td><td>263810</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>Sigma</td><td>P7208</td><td></td></tr><tr><td>FcR 封闭抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>克隆号 2.4G2</td></tr><tr><td> Anti-CD11b&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;PE 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553311</td><td>可使用不同荧光染料（例如 AF488）标记</td></tr><tr><td> Anti-CD45-APC-Cy7 单克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>可使用不同荧光染料（例如 APC）标记</td></tr><tr><td>多聚甲醛（16%）</td><td>EMS Inc</td><td>15710</td><td>用1X PBS按1:15稀释</td></tr><tr><td>15% TBE-尿素凝胶</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>EC68855BOX</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 通用 PCR 主混合液</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 检测试剂 mmu-miR-124a</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001182</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 检测试剂 snoRNA-55</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001228</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Life Technologies Inc</td><td>AM9937</td><td>无核酸酶水</td></tr><tr><td> 384孔透明光学反应板</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>4309849</td><td>可根据不同实时PCR仪器替换为其他规格板（例如96孔板）</td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器（15 ml）</td><td>Wheaton Science Products.</td><td>358044</td><td> 聚四氟乙烯/玻璃材质</td></tr><tr><td>40 &amp;mu; 尼龙细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>大型离心机</td><td>Sorval</td><td>RT 6000B</td><td>转子直径 18.5 cm</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>转子直径 6.5 cm</td></tr><tr><td>实时PCR仪</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>AB 7900 HT</td><td>可替换为其他仪器</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciencess</td><td>LSR II</td><td>可替换为其他仪器</td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria</td><td>可替换为其他仪器</td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时pcr检测小胶质细胞中的微小rna

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

小胶质细胞是属于骨髓细胞系并驻留在中枢神经系统（CNS）中的细胞1这些细胞在与神经炎症相关的多种疾病的病理过程中发挥着重要作用，例如多发性硬化症（MS）。2在正常中枢神经系统中，小胶质细胞表达巨噬细胞标志物 CD11b，并通过低水平表达 CD45 等活化标志物而呈现静息表型。当中枢神经系统发生病理事件时，小胶质细胞被激活，表现为 CD45 及其他标志物的表达上调。3影响中枢神经系统中小胶质细胞表型和功能的因素尚未得到充分研究。微小RNA（miRNAs）是一类长度约22个核苷酸、不断扩展的保守分子家族，参与多种正常的生理过程，如细胞生长和分化。4 以及炎症等病理状况5miRNA 通过与靶 mRNA 的互补序列结合，下调特定靶基因的表达，在包括巨噬细胞在内的天然免疫细胞活化过程中发挥重要作用6 和小胶质细胞7为了研究定义小胶质细胞表型和生物学功能以及区分小胶质细胞与其他类型巨噬细胞的miRNA介导通路，对中枢神经系统（CNS）驻留小胶质细胞不同亚群中特定microRNA的表达水平进行定量评估至关重要。目前用于检测中枢神经系统中miRNA表达的常用方法包括对全脑组织进行定量PCR以及 原位 杂交。然而，对整个组织匀浆进行定量PCR无法评估小胶质细胞中miRNA的表达，因为小胶质细胞仅占神经组织细胞的5–15%。杂交 原位 可在组织切片中评估特定细胞类型内microRNA的表达，但该方法并非完全定量。本文报道一种定量且灵敏的方法，通过实时PCR检测从正常中枢神经系统（CNS）或实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，一种多发性硬化症的小鼠模型）诱导的神经炎症状态下分离的小胶质细胞中的miRNA。该方法可用于测量在正常中枢神经系统或与多种病理状态（包括多发性硬化症、脑卒中、创伤性损伤、阿尔茨海默病和脑肿瘤）相关的神经炎症过程中，小胶质细胞内microRNA的表达水平。

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

小胶质细胞是属于骨髓细胞系并定位于中枢神经系统（CNS）的细胞1。这些细胞在多种神经系统疾病的病理过程中发挥重要作用……

本实验的总体目标是分析小胶质细胞中微小RNA的表达。首先通过解剖获取脑组织和脊髓组织，随后对中枢神经系统（CNS）组织进行匀浆处理。第二步，利用Percoll密度梯度法分离CNS中的单核细胞，再通过流式细胞术鉴定小胶质细胞群体。接下来，分离小胶质细胞的RNA，并分析样品的质量。最后，对特定的微小RNA进行实时PCR检测。最终，可通过ΔΔCT法来展示特定微小RNA在小胶质细胞中的相对表达水平。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，原因在于无法从中枢神经系统中分离出足够数量的单个核细胞，或样品受到髓鞘和细胞碎片的污染。这两种情况均会导致制备质量低下，分别表现为 RNA 浓度过低或蛋白质污染。本次实验操作将由我与 vir 共同演示。所有小鼠灌注完成后，解剖其脑组织和脊髓。每次取一个脑组织和一个脊髓，放入15毫升Dounce匀浆器中，并向组织中加入5毫升PBS。轻轻研磨10至20次后，将匀浆液通过70微米细胞滤筛，分别收集到50毫升锥形管中，在4°C条件下以834 × g离心5至7分钟。弃去上清液后，将两到三只小鼠的脑和脊髓匀浆物重悬于 5 至 7 毫升 70% Percoll 中。然后覆盖 7 毫升 40% Percoll，并在 20°C 下以 850 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。弃去位于 70% Percoll 上层的受损细胞、髓鞘及碎片。然后收集70%与40% Percoll溶液界面处的单个核细胞，并用PBS稀释收集的细胞，稀释比例至少为1:1。离心后弃去上清，将细胞沉淀重悬于0.5毫升PBS中，并转移至1.7毫升Eppendorf管中。取50微升密度梯度分离的细胞转移至新的1.7毫升Eppendorf管中，再向管中加入350微升FACS缓冲液。然后向离心管中加入5至10微升抗FCR抗体，冰上孵育细胞10至15分钟。将细胞样品分装到两个小离心管中，每管一份。向其中一管加入1微升抗CD11B抗体和2微升抗CD45抗体。将细胞在冰上继续孵育10至15分钟。将第二个管标记为阴性对照，并置于冰上。染色抗体孵育后，向两个管中各加入一毫升fax缓冲液，在微量离心机中以1200 ×g离心五分钟。然后将沉淀重悬于400微升含1%多聚甲醛的PBS中固定，并涡旋振荡管子以防止结块。最后，使用阴性对照细胞样品和BD补偿微球进行流式细胞术分析。首先，通过皮下注射的方式，使用150毫克MOG 35-55多肽（溶于4毫克/毫升完全弗氏佐剂中）免疫一组5至10只、8至12周龄的C57BL/6小鼠，以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。然后在免疫当天（第0天）和免疫后第2天腹腔注射百日咳毒素。按照上述方法分离并染色细胞后，在分选前将沉淀重悬于400微升PBS中，而非固定液中。然后，向两个1.7毫升离心管中各加入300微升含10% FBS的PBS，用于收集样品。最后，采用本代

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小胶质细胞的小分子RNA检测在正常中枢神经系统的实时PCR技术在神经发炎

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

小胶质细胞活化和小胶质细胞增生是慢性神经退行性变的关键反应。本文介绍了相关方法...

体内 神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于确定纳米颗粒对神经毒性的影...

小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外...

快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。...

从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

我们描述了一种利用磁珠激活细胞分选（MACS）技术从小鼠下丘脑（或类似的较小脑区结构）中快速分离小胶质细胞的实验方案。经MACS分选获得的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析并可接种培养以进行 体外...

通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。...

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）是一种用户友好的分析流程，无需编程专业知识，可对免疫荧光图像中的单个小胶质细胞形态进行半自动分析。该软件已在啮齿类动物脂多糖诱导的神经炎症模型中得到验证，能够稳定检测与激活相关的形态学变化，实现标准化、可扩展的小胶质细胞表型分析。...

微胶质细胞参数绘图软件（MMPS）：一种用于定量分析微胶质细胞形态的开源、用户友好型工具

了解利用实时PCR技术检测中枢神经系统小胶质细胞中小分子RNA表达的方法。本方案通过密度梯度离心分离单核细胞，结合流式细胞术鉴定细胞群体，为研究神经炎症中的基因调控机制提供可靠手段。

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

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