在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

本实验的总体目标是分析小胶质细胞中微小RNA的表达。首先通过解剖获取脑组织和脊髓组织，随后对中枢神经系统（CNS）组织进行匀浆处理。第二步，利用Percoll密度梯度法分离CNS中的单核细胞，再通过流式细胞术鉴定小胶质细胞群体。

接下来，分离小胶质细胞的RNA，并分析样品的质量。最后，对特定的微小RNA进行实时PCR检测。最终，可通过ΔΔCT法来展示特定微小RNA在小胶质细胞中的相对表达水平。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，原因在于无法从中枢神经系统中分离出足够数量的单个核细胞，或样品受到髓鞘和细胞碎片的污染。这两种情况均会导致制备质量低下，分别表现为 RNA 浓度过低或蛋白质污染。本次实验操作将由我与 vir 共同演示。

所有小鼠灌注完成后，解剖其脑组织和脊髓。每次取一个脑组织和一个脊髓，放入15毫升Dounce匀浆器中，并向组织中加入5毫升PBS。轻轻研磨10至20次后，将匀浆液通过70微米细胞滤筛，分别收集到50毫升锥形管中，在4°C条件下以834 × g离心5至7分钟。

弃去上清液后，将两到三只小鼠的脑和脊髓匀浆物重悬于 5 至 7 毫升 70% Percoll 中。然后覆盖 7 毫升 40% Percoll，并在 20°C 下以 850 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。弃去位于 70% Percoll 上层的受损细胞、髓鞘及碎片。

然后收集70%与40% Percoll溶液界面处的单个核细胞，并用PBS稀释收集的细胞，稀释比例至少为1:1。离心后弃去上清，将细胞沉淀重悬于0.5毫升PBS中，并转移至1.7毫升Eppendorf管中。取50微升密度梯度分离的细胞转移至新的1.7毫升Eppendorf管中，再向管中加入350微升FACS缓冲液。

然后向离心管中加入5至10微升抗FCR抗体，冰上孵育细胞10至15分钟。将细胞样品分装到两个小离心管中，每管一份。向其中一管加入1微升抗CD11B抗体和2微升抗CD45抗体。

将细胞在冰上继续孵育10至15分钟。将第二个管标记为阴性对照，并置于冰上。染色抗体孵育后，向两个管中各加入一毫升fax缓冲液，在微量离心机中以1200 ×g离心五分钟。

然后将沉淀重悬于400微升含1%多聚甲醛的PBS中固定，并涡旋振荡管子以防止结块。最后，使用阴性对照细胞样品和BD补偿微球进行流式细胞术分析。首先，通过皮下注射的方式，使用150毫克MOG 35-55多肽（溶于4毫克/毫升完全弗氏佐剂中）免疫一组5至10只、8至12周龄的C57BL/6小鼠，以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。然后在免疫当天（第0天）和免疫后第2天腹腔注射百日咳毒素。

按照上述方法分离并染色细胞后，在分选前将沉淀重悬于400微升PBS中，而非固定液中。然后，向两个1.7毫升离心管中各加入300微升含10% FBS的PBS，用于收集样品。最后，采用本代表性密度图所示的门控策略，对小胶质细胞和巨噬细胞群体进行高纯度分选。

分选后，重新分析小胶质细胞和巨噬细胞群体，以确定分离细胞样本的纯度。将分选后的细胞群体在微量离心机中以1200 × g离心5至7分钟，小心去除上清液，并将细胞沉淀在干冰上速冻。随后，将冷冻的细胞沉淀转移至普通冰上。

解冻时，加入300微升Nirvana试剂盒中的裂解缓冲液，然后用移液器轻轻吹打细胞溶液5至7次。接着加入30微升匀浆添加剂，涡旋振荡细胞悬液30秒，随后将离心管置于冰上10分钟。然后加入300微升酸性酚-氯仿，涡旋振荡离心管30秒。

然后在9,500 × g条件下离心5分钟使细胞沉淀，小心转移上层含有水相的300微升上清液至一个新的1.7毫升离心管中。加入375微升100%乙醇，混匀溶液。将整个管内容物转移至Nirvana试剂盒中的过滤柱中，在9,500 × g条件下离心1分钟。随后弃去滤过液。

使用Nirvana试剂盒中的洗涤液一，向套管中加入700微升，洗涤后在9,500 × g条件下离心1分钟。再用500微升Nirvana试剂盒中的洗涤液二重复洗涤两次。使用60微升预热的无核酸酶水洗脱套管中的RNA。

最后，使用 NanoDrop 分光光度计评估在进行实时定量反转录 PCR 以检测小胶质细胞和巨噬细胞样本中的微小 RNA 后所提取 RNA 的纯度和浓度。此处第一幅图展示了针对荧光标记的 mere 1 24 和 snow RNA 55 PCR 产物所生成的定量反转录 PCR 扩增曲线。图中还显示了从小胶质细胞或骨髓来源巨噬细胞中分离的对照组 snow RNA 55 RNA 样本中，荧光标记的特异性 PCR 产物量随 PCR 循环次数变化的典型扩增曲线。

请注意，分析不同细胞群中 snow RNA 55 表达的 CT 值是通过基线与 Q-R-T-P-C-R 曲线线性范围下部的交点确定的，图中由绿色和蓝色垂直线指示。在第二张图中，显示了小胶质细胞或骨髓来源巨噬细胞的实验 mere 1 24 RNA 样品中荧光标记的特异性 PCR 产物量与 PCR 循环次数的关系。请注意，分析不同细胞群中 mere 1 24 表达的 CT 值同样是通过基线与 Q-R-T-P-C-R 曲线线性范围下部的交点确定的，图中由绿色和蓝色垂直线指示。

在确定每个样本的CT值后，例如本表中所示正常小鼠和EAE小鼠的小胶质细胞及骨髓来源巨噬细胞（BM dms）中snow RNA 55和mere 1 24的表达，用实验样本mere 1 24的CT值减去对照样本snow RNA 55的CT值，以计算每个样本重复孔的ΔCT值。然后，用其他样本的ΔCT值减去参照样本的ΔCT值，计算出ΔΔCT值。最后，各样本基因表达的相对水平通过2的负ΔΔCT次方计算，如本密度图所示。

在成功从正常中枢神经系统分离小胶质细胞的情况下，95%至98%的细胞应为CD11b阳性、CD45低表达的小胶质细胞，细胞悬液中另有2%至5%为CD11b阳性、CD45高表达的血管周巨噬细胞，而CD11b阴性、CD45高表达的淋巴细胞或CD11b阴性、CD45阴性的星形胶质细胞、少突胶质细胞或细胞碎片的比例则低于1%。相比之下，在质量较差的制备样本中，会出现大量CD11b阴性、CD45阴性的细胞或细胞碎片污染，例如星形胶质细胞或髓鞘颗粒，导致细胞不适合用于RNA提取及后续分析。此外，还可能存在CD11b阴性、CD45高表达的细胞，提示由于灌注不充分导致血液淋巴细胞污染。在此密度图中，展示了神经炎症期间存在于中枢神经系统中的三类细胞群体：CD11b阳性、CD45低表达的小胶质细胞，CD11b阳性、CD45高表达的巨噬细胞，以及CD11b阴性、CD45高表达的淋巴细胞。

通过凝胶电泳分析，展示了优质与劣质分离所获得的RNA质量差异。当RNA被有效分离时，可见清晰的RNA梯度标记物和核糖体RNA；而当分离过程不理想时，则出现弥散条带及低分子量的降解产物。这些最终数据表明，在正常成年小胶质细胞、患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的小胶质细胞以及发育早期阶段小鼠分离的小胶质细胞中，仅存在微量的1 24表达。

在第一个柱状图中，正常中枢神经系统的小胶质细胞中 mere 1 24 的相对表达量远高于骨髓来源的巨噬细胞。类似地，尽管患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞 mere 1 24 RNA 表达有所增加，但小胶质细胞的 mere 1 24 RNA 表达量仍高出五倍。最后一个柱状图展示了利用该方法还可评估小鼠在发育过程中（1周、2周和4周龄）小胶质细胞中 mere 1 24 表达水平的变化，并与成年8周龄小鼠进行比较。

务必确保分离的细胞数量充足且质量良好，这将保证整个实验获得理想的结果。