原发性脑肿瘤组织的干细胞检测与流式分选处理

该程序的总体目标是在体外研究脑肿瘤起始细胞。这是通过首先机械和酶解离原发性人类肿瘤，然后在无干细胞血清培养条件下培养它们来实现的。下一个球体的形成将在三到五天内进行监测。

然后再次酶消化肿瘤球，并通过流式细胞术评估其表面标志物。最后一步是将所需的细胞分类到 96 孔板或 PL 网格载玻片中以进行进一步表征。最终，可以通过限制稀释分析和单细胞R-T-P-C-R来评估分选群体的自我更新能力和差异基因表达。

与现有方法（例如体积肿瘤分析）相比，该技术的主要优点是它可以前瞻性地分离脑肿瘤起始细胞或癌症干细胞群。当我们将最初用于正常神经干细胞的培养条件应用于各种人类脑肿瘤时，我们第一次想到了这种方法，并发现这种专门为证明该程序的干细胞样群体选择的培养方法将是博士后研究员 CHITRA AL 研究生 bran Van Manen 和 Sarah Nolte， 和我们的流式细胞术技术员 Nicole McFarland，均来自我们的实验室首先将 200 微升解冻液添加到 15 毫升人工脑脊液或 A 脑脊液中，然后将试管放入 37 摄氏度的水浴中。此时也将氯化铵溶液带至室温。

然后将 5 毫升脑脊液放入脑肿瘤组织标本容器中，旋转容器进行冲洗，然后将其从液体中排出以去除红细胞。现在将组织转移到无菌的 100 毫米培养皿中，并使用细剪刀和镊子将组织分解成浆状稠度。然后使用 10 毫升普通移液器和镊子收集样本，并将组织碎片转移到含有预热 A 脑脊液的管中。

使用liase，将试管以30 RPM和37摄氏度的速率放在培养箱摇床上。然后15分钟后，通过7D微米细胞过滤器将组织裂解物过滤到50毫升锥形管中。在室温下以 280 GS 旋转滤液 5 分钟。

然后小心地取出 snat 并评估所得颗粒的大小和颜色。接下来，将沉淀重悬于一毫升PBS中，然后根据沉淀大小和红细胞污染加入适量的氯化铵溶液。然后在室温下孵育五分钟后，在PBS中第二次洗涤后将细胞旋转下来，将沉淀重悬于五毫升神经干细胞完全培养基中，然后将细胞悬液转移到超低结合的60毫米组织培养板中前几天。

根据需要用一到两毫升培养基加满培养物，仅当颜色变黄时才更换培养基。首先将肿瘤球体培养物转移到 15 毫升锥形管中。加入两到三毫升无菌PBS以彻底冲洗板，然后将洗涤液添加到肿瘤球管中。

旋转细胞后，取出 snat 并将沉淀重悬于一到两毫升无菌 PBS 中，然后加入 10 微升 liase。该技术的一个挑战是在加工过程中保持实体瘤干细胞的活力。在培养和灌装过程中对细胞的任何作都需要轻柔的触摸。

接下来，将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育。三分钟后，取出并目视评估悬浮液。如果看到多个团块，请使用 1000 微升移液器吸头轻轻迭代细胞簇。

现在用五毫升无菌PBS洗涤细胞，然后在去除S上清液后，将沉淀重悬于500至1000微升无菌PBS加2毫摩尔EDTA中。最后，在使用 Trian blue 评估细胞数量和活力后，将 PBS 加 EDTA 中的细胞计数调整为每毫升 100 万个细胞。首先，每次测试将 100 微升细胞悬液转移到单独的 12 x 75 毫米流量管中。

加入适当的抗体后，将样品在冰上孵育 30 分钟，然后每管两毫升 PBS 加 EDTA 洗掉任何未结合的抗体。现在倒出洗涤液，吸干试管，然后将细胞沉淀重悬于300微升PBS加EDTA中。然后向每个试管中加入 10 微升七种 A A D 活力染料。

将试管在冰上孵育至少 15 分钟后，细胞即可进行流式细胞术分析。使用阴性对照样品调整前向和侧向散射参数后，在感兴趣的细胞周围绘制一个类似于此代表性顶部图中所示的区域。根据需要调整用于在前二十年内放置阴性细胞的荧光检测器上的电压。

接下来，使用活力染料7 A a d创建第二个区域，用于排除死细胞，类似于该代表性顶图中所示的区域。然后将散射门和活细胞门应用于所有荧光图，并使用单个染色对照减去任何光谱重叠。最后，运行示例。

通过将不同稀释度的解离细胞分选到每孔单个细胞的单个孔中，开始限制稀释测定，该孔板含有200微升NSC培养基神经球，通常在7天内形成，并且可以计算单细胞R-T-P-C-R在过去7天内培养物中随后形成球体的速率。将感兴趣的群体中的单个细胞分选到充足的网格载玻片的反应位点后，将一微升预混液添加到每个反应位点的中心，然后立即用五微升天花板溶液涂覆每个位点。然后使用高速载玻片循环仪，将载玻片孵育三个温度循环。

逆转录后，向每个反应位点加入三微升DN a的无抗蚀水。然后将整个混合物从每个反应位点转移到单独的 PCR 管中。最后，为了进行实时定量，在BioRad循环仪上运行样品。

第一张图显示了一位代表性胶质母细胞瘤患者的磁共振成像扫描。解离的肿瘤细胞可以用神经表面干细胞标志物CD133和CD15标记，并通过流式细胞术进行分析，如本代表性点图所示。在这里，显示了代表性单细胞 R-T-P-C-R 反应的扩增图。

从这样的图中获得的CT值可用于计算目标基因的相对表达水平。观看此视频后，您应该对如何酶解离和培养原发性脑肿瘤组织以富集干细胞群有很好的了解。您还将了解如何通过执行有限稀释分析或单细胞 R-T-P-C-R 来研究分选干细胞群的自我更新能力和差异基因表达。