Name: 侵入细胞DISC1蛋白种类的产生，纯化及表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 学习DISC1蛋白聚集体的生成、纯化及表征方法，用于研究细胞侵袭性与神经精神疾病。本实验展示两种纯化方案，比较其在细胞培养及体内神经元中的侵袭效率差异。

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本工作由NEURON-ERANET DISCover项目（BMBF 01EW1003）资助C.K.和J.P.H.，德国研究基金会（DFG）（Ko 1679/3-1；GRK1033）资助C.K.。V.B.获得杜塞尔多夫大学医学院研究委员会基金的资助。

1. 聚集体供体细胞的制备：转染单体红色荧光蛋白（mRFP）或增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记的人全长（FL）DISC1
<ol>
 <li>在十个 10 cm 培养皿中分别接种 1.5 × 106 个/10 cm 培养皿的人神经母细胞瘤 NLF（NLF；费城儿童医院，宾夕法尼亚州费城）细胞，并过夜培养。NLF 细胞在添加了 10% 胎牛血清、青霉素/链霉素和 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基中培养。次日，细胞融合度应达到 70–80%。</li>
 <li>使用 15 μg 质粒 DNA 和 Metafectene 转染试剂（Biontex，德国马丁斯里德）对每个 10 cm 培养皿进行瞬时转染。简言之，对于一个 10 cm 培养皿，将 15 μg 质粒 DNA 和 30 μl Metafectene 加入 750 μl Opti-MEM 中，混匀后室温孵育 20 分钟。其中五个培养皿转染 pcDNA3.1 mRFP/eGFP 标记的人全长 DISC1 质粒，另外五个培养皿仅转染 eGFP 质粒。</li>
</ol>
2. 从转染的供体细胞中纯化包涵体
本文所述方案结合了从脑组织中纯化路易小体的方法13以及分离大分子聚集体和aggresome的方案14。由于已有方法均依赖去垢剂的使用，因此在细胞侵袭性检测中应用时，分离不含去垢剂的蛋白质尤为关键。
<ol>
 <li>转染后48小时，在荧光显微镜下观察eGFP和mRFP/eGFP-DISC1的表达情况，并确认aggresome的形成（图1）。</li>
 <li>用pH 7.4的PBS洗涤细胞，每份样品加入400 μl PBS刮取细胞，添加1×蛋白酶抑制剂混合物（Roche, Indianapolis, IN），使用Precellys24匀浆仪（Bertin technologies, France）裂解细胞。具体操作：将1 ml细胞悬液加入2 ml裂解管中，并加入10颗陶瓷珠。以3次、每次60秒的脉冲程序进行裂解。该过程中的机械力可能导致样品温度升至37 °C以上，因此裂解后应立即将样品置于冰上冷却。</li>
 <li>将细胞样品置于冰上冷却，加入10 mM MgCl2和40 U/ml DNase A，于37 °C孵育60分钟。</li>
 <li>配制pH 7.4 PBS中的80%、50%和20%蔗糖溶液（w/v），每种各10 ml。</li>
 <li>在15 ml离心管中制备蔗糖梯度，依次加入2 ml 80%蔗糖、50%蔗糖和20%蔗糖溶液。倾倒时应缓慢进行，避免扰动已形成的下层。将消化后的裂解液小心铺加在梯度顶部，于4 °C以1000 × g离心15分钟。</li>
 <li>用移液器小心收集50%-80%蔗糖层之间的界面物质，与5倍体积的pH 7.4 PBS混合。于4 °C以1000 × g离心15分钟。重复洗涤两次。此界面中的aggresome具有荧光，可在紫外光下通过显微镜观察。</li>
 <li>弃去上清液，将沉淀物重悬于250–500 μl pH 7.4 PBS中。该沉淀即为纯化的aggresome（图2）。</li>
</ol>
3. 使用 mRFP/eGFP-DISC1 聚集体处理受体 SH-SY5Y 细胞
<ol>
 <li>在24孔板的每个孔中，将5 × 104个稳定表达GFP-DISC1(598-854)的受体SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞接种于无菌玻璃盖玻片上。SH-SY5Y细胞培养于添加青霉素/链霉素、非必需氨基酸（NEAA）和10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12培养基中。</li>
 <li>24小时后，向每孔加入10 μl样品，继续培养48–72小时。</li>
 <li>用pH 7.4的PBS洗涤细胞3次，加入0.04%台盼蓝孵育5分钟以淬灭胞外荧光。</li>
 <li>用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS（pH 7.4）在冰上固定细胞10分钟，用无菌H2O洗涤一次，然后将盖玻片用含DAPI的ProLong Gold封片剂（Invitrogen, USA）封固于载玻片上。</li>
 <li>通过Z轴层扫成像观察外源施加的aggresome与受体细胞表达的招募蛋白的共定位，确认其摄取/侵入情况。</li>
</ol>
然而，外源蛋白的摄取/侵入并不一定能够与宿主细胞蛋白的募集同步检测到。在本示例中，mRFP标记的DISC1包涵体募集了宿主细胞表达的可溶性GFP标记的DISC1(598-854)蛋白（见图3）。图像使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜或蔡司Axiovision Apotome2显微镜拍摄。
4. 重组DISC1(598-785)的生成
在之前的一项研究中，我们基于自缔合结构域的存在情况，分析了多种DISC1蛋白片段的自我相互作用能力。在所有测试的蛋白片段中，人源DISC1(598-785)表现出最强的多聚化倾向4（图4）。因此，将人源DISC1(598-785)克隆至含有N端6个组氨酸标签的pET15b载体（Novagen，Madison，Wisconsin）中，在大肠杆菌E. coli BL21-(lDE3) Rosetta（Novagen，美国）中表达，并在8 mol/L尿素的变性条件下进行纯化，具体方法如前所述4。简而言之，该实验流程概述如下。
<ol>
 <li>BL21-(DE3) Rosetta E. coli 在含有5 mM盐酸精氨酸、5 mM MgSO₄的2 × 500 ml 2YT培养基中培养， 100 μg/ml 羧苄青霉素 35 μg/ml 氯霉素，直至 OD600：0.6–0.8，并用 1 mM IPTG 诱导 DISC1(598-785) 表达。 </li>
 <li>DISC1(598-785) 在 4 小时内表达 37 °C通过离心收集细菌，终止表达。 </li>
 <li>细菌沉淀用 50 ml TE 缓冲液（50 mM TRIS-HCl pH 8.0，5 mM EDTA）重悬，其中含有 2 mM PMSF 和 1% TX-100， 250 μg/ml 溶菌酶，20 mM MgCl2 以及400 U/50 ml DNase I。为确保完全裂解，反应液在室温下轻轻搅拌孵育30分钟。</li>
 <li>加入10 mM β-巯基乙醇（ME）和500 mM NaCl，再孵育30分钟。 </li>
 <li>在 20,000 g 下离心细菌包涵体 30 分钟 4 °C. </li>
 <li>将沉淀重悬于50 ml含有50 mM Tris（pH 8.0）、5 mM 咪唑、500 mM NaCl、8 M 尿素和10 mM β-巯基乙醇的提取缓冲液中，于20,000 g离心30分钟以去除碎片 4 °C. </li>
 <li>用裂解缓冲液洗涤 Ni-NTA 琼脂糖基质。将重悬并预清除的蛋白提取物与 Ni-NTA 基质在室温下孵育 2 小时。 </li>
 <li>用含有12 mM 咪唑的裂解缓冲液洗涤Ni-NTA树脂。 </li>
 <li>用含有 50 mM Tris、500 mM NaCl、300 mM 咪唑、8 M 尿素、1 mM PMSF、5 mM EDTA 和 10 mM β-巯基乙醇的 15 ml 洗脱缓冲液缓慢洗脱蛋白。 </li>
 <li>将蛋白在含有10 mM β-ME的PBS（pH 7.4）中逐步透析。 </li>
</ol>
从1 L细菌起始培养物中可分离获得最多50 mg的重组DISC1(598-785)蛋白。
α-突触核蛋白重折叠
进行α-突触核蛋白实验时，将500 μg重组蛋白（Sigma-Aldrich，美国）溶解于PBS中，浓度为1 mg/ml。为获得寡聚体，按照先前发表的方法10，在37 °C下复性过夜。
5. 用 DyLight594 标记重组 DISC1(598-785)
<ol>
 <li>在进行后续标记步骤之前，DISC1(598-785) 蛋白质必须去除β-ME。因此，将蛋白质以1:2,000的比例在pH 7.4的PBS中透析三次。</li>
 <li>根据制造商说明书，使用DyLight 594 maleimide（Thermo Scientific, USA）对标记1 mg的DISC1(598-785)。简言之，将1 mg/ml的蛋白质溶解于pH 7.4的PBS中，并加入5 mM TCEP以恢复游离巯基。向反应体系中加入20 μl DMF溶解的染料，在室温下孵育2小时。</li>
 <li>将蛋白质以1:2000的比例在pH 7.4的PBS中透析三次，每次2小时。</li>
</ol>
为了进一步提高标记蛋白的纯度，需在Ni-NTA柱上进行基于His6-标签的亲和纯化。
<ol start="4">
 <li>用 10 ml PBS pH 7.4 洗涤 1 ml Ni-NTA 介质（Qiagen, Germany）。</li>
 <li>将标记并透析后的蛋白质缓慢上样至柱中，使其缓慢流过柱子。</li>
 <li>用 3 × 20 ml PBS pH 7.4 洗涤蛋白质。</li>
 <li>用 PBS pH 7.4 加 500 mM 咪唑逐滴洗脱蛋白质，同时监测 Ni-NTA 柱上的有色条带，以减少洗脱液体积。</li>
 <li>将洗脱液在 1:2000 稀释条件下，于 10 mM NaPi pH 7.4 缓冲液中透析 3 次，每次 2 小时。</li>
 <li>使用无菌的 0.45 μm 注射器滤器过滤洗脱液，分装为 5 份 100 μl 样品，并在液氮中速冻。每份 100 μl 分装样品中的蛋白质总量应为 0.5 - 1 μg/ml。</li>
</ol>
可选的浓缩步骤
<ol start="10">
 <li>对于大鼠立体定位注射，使用离心浓缩仪（Eppendorf Concentrator 5301）将蛋白质浓缩10倍。最终缓冲液条件为100 mM NaPi。
 </li>
</ol>
α-突触核蛋白标记
 重组α-突触核蛋白的标记和纯化（Ni-NTA柱）与DISC1(598-785)同时进行。起始总材料量为500 μg，而DISC1(598-785)为1 mg。
6. 用标记的重组 DISC1 (598-785) 蛋白处理受体 SH-SY5Y 细胞
<ol>
 <li>在24孔板的每个孔中，将5×104个稳定表达GFP-DISC1(598-854)的SH-SY5Y人神经母细胞瘤受体细胞接种于无菌玻璃盖玻片上。</li>
 <li>向细胞培养基中加入标记蛋白，终浓度为5–10 μg/mL，孵育48–72小时。</li>
 <li>用pH 7.4的PBS洗涤细胞3次，再用0.04%台盼蓝处理5分钟，以淬灭细胞外荧光。</li>
 <li>用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS（pH 7.4）在冰上固定细胞10分钟，随后用无菌H2O洗涤一次，并将盖玻片用含DAPI的ProLong Gold封片剂（Invitrogen，USA）封固于载玻片上。</li>
 <li>通过激光扫描共聚焦显微镜获取Z轴层扫图像，观察外源添加的重组蛋白与受体细胞所表达的招募蛋白之间的共定位，以确认蛋白的摄取或侵入。然而，内源性蛋白的招募可能并不总是与宿主细胞蛋白的侵入同步发生，此时Z轴层扫图像仍可用于确认该蛋白的侵入特性。</li>
</ol>
在本示例中，重组的 DISC1(598-785)* 至少部分招募了宿主细胞表达的可溶性 GFP 标记的 DISC1(598-854) 蛋白（见图 5A）。对于重组的 α-突触核蛋白，仅显示入侵而无招募现象（图 5B）。图像使用蔡司 LSM 510 共聚焦显微镜或蔡司 Axiovision Apotome2 显微镜拍摄。
将浓缩的（约 4 μl，2.5 μg/μl）标记DISC1(598-785)* 注射至mPFC后，该蛋白会在注射部位周围扩散，即使在用pH 7.4的PBS中含4% PFA灌注动物后，仍可通过罗丹明滤光片组检测到。在本示例中，DISC1(598-785)被一定数量的神经元摄取，并可通过Z轴层扫成像进行监测（图6）。
通常情况下，注射除本实验所用之外的其他蛋白质不一定导致细胞侵袭。侵袭事件主要取决于蛋白质的性质，但纯净的蛋白样品是进行后续分析的先决条件。
7. 代表性结果
由NLF细胞纯化的重组FL DISC1-eGFP形成的aggresome侵入受体SH-SY5Y细胞的效率较低（约0.3%） 5通过共聚焦显微镜观察到的共定位现象（图3). 如先前报道，DISC1(598-785) 表达并从 E. coli 形成多聚体 4 以约20%的效率具有相同的细胞侵袭能力 5 (图 5A）与作为阳性对照平行使用的α-synuclein结果相似（图5B). 标记的重组DISC1(598-785)蛋白，自 E. coli 对神经元也具有细胞侵袭性 体内 当多聚体蛋白被立体定位注射到大鼠内侧前额叶皮层时（图6；Pum，Bader，Huston，Korth，未发表。
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="显示蛋白质在20µm尺度下定位的细胞红色激发荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 瞬时表达FP-DISC1（红色）的NLF神经母细胞瘤细胞。可在细胞内检测到红色荧光聚集体。
 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="显示红色染色颗粒的荧光显微镜图像，比例尺为50微米。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 在蔗糖梯度中纯化后，带有mRFP标签的DISC1包涵体。
 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="荧光显微镜图像，DISC1定位：GFP、mRFP融合蛋白；细胞成像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 被侵入的aggresome的荧光图像。将mRFP标记的全长DISC1 aggresome纯化后，与过表达可溶性GFP标记的DISC1(598-854)的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞共同孵育。通过激光扫描显微镜（Zeiss LSM 510）进行Z轴层扫成像，监测标记aggresome的摄取情况。
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="尺寸排阻色谱图，显示蛋白质多聚体峰及洗脱体积分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 含有 S704 和 C704 单核苷酸多态性（SNP）的重组 DISC1(598-785) 的凝胶过滤层析谱。两种变异体均表现出有序寡聚化的破坏以及高分子量多聚体的形成（红色箭头）。此图片改编自 Leliveld et al., Biochemistry 2009 的发表文章。
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="细胞荧光显微镜；GFP-DISC1、DyLight594、DAPI染色；蛋白质定位分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 标记DyLight的重组DISC1(598-785)蛋白侵入细胞的荧光Z轴层扫图像。表达可溶性GFP-DISC1(598-854)的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞与标记的重组蛋白在5 μg/ml浓度下共孵育。（A）红色聚集体显示重组DISC1(598-785)蛋白的侵入，黄色点状结构提示可溶性GFP-DISC1(598-854)被招募至聚集体中。（B）重组α-突触核蛋白（红色）可侵入细胞，但无招募现象，侵入频率约为20%。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="免疫荧光显微镜图像；α-NeuN，神经元中DAPI染色；合并图像；蛋白质定位。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 注射标记的重组DISC1(598-785)蛋白的免疫荧光图像。Z轴层扫成像证实，在用神经元核抗体（NeuN，绿色）染色的大鼠皮层神经元中存在重组DISC1(598-785)蛋白。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本研究描述了从转染的神经母细胞瘤细胞系中纯化mRFP/eGFP-DISC1包涵体的方法，以及重组DISC1蛋白的制备与标记，并将其应用于受体细胞的细胞侵袭实验。 体外 以及 在体内.
天然mRFP/eGFP-DISC1包涵体的纯化方法源于分离路易体样结构及较大聚集体的已有方案13, 14，但经过改进以避免使用去垢剂，并最大限度降低因去垢剂促进细胞膜穿透而导致假阳性细胞侵入的风险。
未来可能的一项改进是通过超声处理进一步提高包涵体的纯度，以彻底将残留的膜结构和细胞骨架与包涵体分离。通过提高整体纯度，记录到的大包涵体的总入侵事件数量可能会增加5。我们建议的三相蔗糖梯度法是否足以适用于其他蛋白质种类的包涵体，尚需验证；在此意义上，本文所述方案应视为个体化优化的起点。在我们的实验中，纯化的包涵体表现出良好的稳定性，额外的洗涤步骤（不含去污剂）以去除蔗糖残留，并未显著降低总体得率。
在之前的一项研究中，我们描述了DISC1的寡聚体组装依赖于其C末端特定的多聚化结构域4（图4）。我们选择该片段在E. coli中进行重组可溶性表达，并通过Ni-NTA柱进行后续纯化。为了监测其多聚化状态，并将其细胞侵入能力与已知具有细胞侵入性的蛋白（如α-synuclein）进行比较，我们使用荧光染料DyLight594标记DISC1(598-785)，并比较其与等量标记的α-synuclein的细胞侵入能力。与天然的全长DISC1包涵体相比，该重组DISC1片段的细胞侵入能力显著增强，这可能归因于其更小的分子尺寸和更高的纯度。同样，纯度似乎是影响细胞侵入能力的关键因素。
在我们的示例中，具有侵袭性的aggresomes招募了靶细胞系中以外源重组方式表达的可溶性同源蛋白 即 细胞分散形式。荧光蛋白的表达（例如 在受体细胞系中表达GFP或RFP具有优势，因为它可通过Z轴层扫成像实现侵入性aggresome与重组蛋白在受体细胞内的共定位。 
具有细胞侵袭性的 DISC1 aggresomes 以及在 E. coli 中表达并纯化的多聚体片段，可能是与 DISC1 相关的蛋白构象病（DISC1opathies）15 的一个决定性特征。
问题排查：
蔗糖梯度纯化后获得的aggresome产量较低：
本方案中介绍的蔗糖梯度适用于eGFP/mRFP-DISC1(FL)包涵体。由其他蛋白质组成的包涵体可能具有不同的尺寸，因此其他使用者应优化蔗糖浓度。
重组蛋白纯化不充分：
在重组蛋白纯化过程中存在的任何细菌污染物，也将在后续实验步骤中被标记。为避免污染，需将蛋白进行SDS-PAGE电泳，并通过考马斯亮蓝染色确认重组蛋白纯度至少达到95%。为确保最高质量和产量，该实验方案需针对每种特定蛋白进行优化。
重组蛋白标记效率低：
任何含有游离巯基（SH基团）的污染物都会降低蛋白质标记的效率。因此，必须进行充分的透析以及基于Ni-NTA的纯化。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>培养基取决于宿主细胞系。最佳的受体细胞系应由使用者自行确定。</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11320-033</td><td>培养基取决于受体细胞系，最佳受体细胞系应由使用者自行确定。</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Metafectene</td><td>Biontex</td><td>T020-1.0</td><td>其他转染试剂也可能有效，但未在本实验方案中进行测试。</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>实验采用Qiagen公司的Ni_NTA琼脂糖，其他供应商的产品也应适用。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏</td><td>04716728001</td><td>在包涵体纯化过程中无需使用无RNase的DNase。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td>无血清培养基同样有效</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>SH-SY5Y 和 NLF 培养基的补充剂</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td>SH-SY5Y 培养基补充剂</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>有毒试剂</td></tr><tr><td>DyLight 594 Maleimide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>46608</td><td>将还原型半胱氨酸反应性染料转化为稳定的硫醚&amp;#8211;其他键结类型。也可提供其他颜色。</td></tr><tr><td>ProLong Gold 加 DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>这种抗荧光淬灭液体封片剂在我们的使用中表现出更优的效果。</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td>将1片溶于500 &amp;mu;l H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 为 100 倍浓缩液。</td></tr><tr><td>合成α-突触核蛋白</td><td>Sigma</td><td>S7820</td><td>按照文中所述进行复性。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;特定试剂表&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>Bertin Technologies</td><td>03119.200.RD000</td><td>我们未测试过除该设备以外的其他机械匀浆器。其他无去污剂的匀浆方法也可能有效，但尚未在此方案中进行测试。</td></tr><tr><td>5301 浓缩仪（Speedvac）</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td>仅在需要浓缩蛋白质时使用。</td></tr><tr><td>LSM 510 和 Axiovision Apotome2 </td><td>蔡司</td><td>参见制造商目录</td><td>两台显微镜均具备进行Z轴层扫成像的能力，这是对侵入事件进行可靠且严谨评估的先决条件。</td></tr><tr><td>细胞培养塑料器皿</td><td>Nunc</td><td>10 cm 培养皿 #172958，24 孔板 #142475</td><td>使用不同的塑料材料可能会影响重组蛋白或aggresomes与塑料表面之间的相互作用。我们未测试除本文所述之外的其他材料。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;span class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;特定材料与设备清单&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;编号&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;缓冲液名称&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;蛋白质聚集被视为慢性退行性脑部疾病的一般特征，例如神经退行性疾病中的阿尔茨海默病（Aβ、tau）、帕金森病（α-synuclein）、亨廷顿病（polyglutamine、huntingtin）等。蛋白质聚集被认为源于蛋白质稳态失衡（proteostasis），即错误折叠蛋白的生成与降解之间出现失衡。值得注意的是，这些疾病在散发性病例中也发现相同蛋白质的聚集，而这些蛋白质仅在罕见的家族性突变变体中发生突变。精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病，在许多病例中伴随永久且不可逆的认知功能缺损。在一项候选基因研究中，我们探讨了“精神分裂症中断基因1”（Disrupted-in-schizophrenia 1, DISC1）——该基因最初在一个与慢性精神疾病相关的苏格兰家族中被克隆1,2——是否可在散发性精神分裂症患者脑组织中以不溶性聚集物的形式存在3。利用SMRI CC样本库，我们在约20%的CMD病例中（而非正常对照或神经退行性疾病患者）经生物化学分级分离后检测到嗜硫酰（sarkosyl）不溶性的DISC1免疫反应性。后续体外研究表明，DISC1的聚集倾向受疾病相关多态性S704C4的影响，且体外生成的DISC1聚集小体（aggresomes）具有细胞侵袭性5，类似于Aβ6、tau7-9、α-synuclein10、polyglutamine11或SOD1聚集物12所表现出的特性。这些发现促使我们提出假说：至少部分CMD病例（即存在DISC1聚集的病例）可能属于蛋白质构象病。本文描述了我们在哺乳动物细胞中生成DISC1聚集小体、通过蔗糖梯度纯化并用于细胞侵袭性研究的方法。同样地，我们还描述了如何生成 exclusively multimeric 的C端DISC1片段，对其进行标记和纯化以用于细胞侵袭性研究。使用重组的DISC1多聚体，我们实现了与类似标记的合成α-synuclein片段相当的细胞侵袭能力。我们还证明，当该片段通过立体定位注射至受体动物脑内时，可在体内被细胞摄取。&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;细菌培养基&lt;/td&gt; &lt;td&gt;16 g/l Bacto Tryptone，10 g/l Bacto Yeast extract，5 g/l NaCl，5 mM-arginine-HCl，5 mM MgSO₄，100 &amp;mu;g/ml 羧苄青霉素，35 &amp;mu;g/ml 氯霉素&lt;/td&gt; &lt;td&gt;培养细菌至 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt;：0.6–0.8 时，用 1 mM IPTG 诱导表达。&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;细菌重悬缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM TRIS-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 &amp;mu;g/ml 溶菌酶，20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 400 U/50 ml DNase I&lt;/td&gt; &lt;td&gt;将1 L过夜培养的细菌沉淀用50 ml重悬缓冲液重悬。&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;3.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;蛋白提取缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris pH 8.0，5 mM 咪唑，500 mM NaCl，8 M 尿素和 10 mM b-ME&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;4.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Ni-NTA 柱洗涤缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris pH 8.0，5 mM 咪唑，500 mM NaCl，8 M 尿素，10 mM b-ME，12 mM 咪唑&lt;/td&gt; &lt;td&gt;添加了12 mM咪唑的改良提取缓冲液&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;5.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Ni-NTA 柱洗脱缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM Tris，500 mM NaCl，300 mM 咪唑，8 M 尿素，1 mM PMSF，5 mM EDTA 和 10 mM β-巯基乙醇 &lt;/td&gt; &lt;td&gt;洗脱缓冲液含有10 mM β-ME，后续需进行透析。 &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;6.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;PBS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;8 g/l NaCl，0.2 g/l KCl，1.44 g/l Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;人类表型本体&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，调节pH至7.4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;7.&lt;/td&gt; &lt;td&gt;标记缓冲液&lt;/td&gt; &lt;td&gt;含5 mM TCEP的PBS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;4&quot;&gt;&lt;span class=&quot;蛋白质聚集被认为是慢性退行性脑部疾病的一般特征，例如神经退行性疾病中的阿尔茨海默病（Aβ、tau）、帕金森病（α-synuclein）、亨廷顿病（polyglutamine、huntingtin）等。蛋白质聚集被认为是由蛋白质稳态失衡（proteostasis）所致，即错误折叠蛋白的生成与降解之间出现失衡。值得注意的是，在这些疾病的散发性病例中也发现了相同蛋白质的聚集，而这些蛋白质仅在罕见的家族性突变变体中发生突变。精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病，在许多情况下伴随永久且不可逆的认知功能缺损。在一项候选基因研究中，我们探讨了“精神分裂症相关中断基因1”（Disrupted-in-schizophrenia 1, DISC1）——该基因最初在一个与慢性精神疾病相关的苏格兰家族中被克隆——是否可在散发性精神分裂症病例的脑组织中以不溶性聚集物的形式存在。利用SMRI CC样本，我们在约20%的精神疾病（CMD）病例中，经生化分级分离后检测到嗜硫氧还蛋白（sarkosyl）不溶性的DISC1免疫反应性，而在正常对照或神经退行性疾病患者中未见此现象。后续体外研究表明，DISC1的聚集倾向受疾病相关多态性S704C的影响，且体外生成的DISC1包涵体具有细胞侵袭性，类似于Aβ、tau、α-synuclein、polyglutamine或SOD1聚集物所表现出的特性。这些发现促使我们提出假说：至少在部分CMD病例中，特别是存在DISC1聚集的病例，可能属于蛋白质构象病。本文描述了我们在哺乳动物细胞中生成DISC1包涵体的方法，通过蔗糖梯度纯化这些包涵体，并将其用于细胞侵袭性研究。同时，我们也介绍了如何生成一种 exclusively 多聚体形式的C端DISC1片段，对其进行标记和纯化，以用于细胞侵袭性实验。使用重组的DISC1多聚体，我们获得了与类似标记的合成α-synuclein片段相当的细胞侵袭能力。我们还证明，当该片段通过立体定位注射至受体动物脑内时，可在体内被细胞摄取。&quot;&gt;&lt;strong&gt;配方表&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; </td></tr></tbody></table>

细胞侵入性 disc1 蛋白物种的生成、纯化与表征

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

蛋白质聚集被认为是慢性退行性脑部疾病的一般特征，例如神经退行性疾病阿尔茨海默病（Aβ、tau）、帕金森病（α-synuclein）、亨廷顿病（多聚谷氨酰胺、huntingtin）等。人们认为蛋白质聚集的发生是由于蛋白质稳态失衡（i.e. 错误折叠蛋白质的生成与降解之间失衡）所致。值得注意的是，这些疾病在散发性病例中也发现相同的蛋白质聚集，而这些蛋白质在家族性罕见变异体中是突变的。
精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病，在许多情况下伴随永久且不可逆的认知功能缺损。在一项候选基因研究中，我们探讨了精神分裂症相关基因1（Disrupted-in-schizophrenia 1, DISC1）——该基因最初在一个与慢性精神疾病相关的苏格兰家族中被克隆——是否可在散发性精神分裂症病例的脑组织中形成不溶性聚集体。1, 2，是否可在散发性精神分裂症患者脑组织中发现其不溶性聚集物3利用SMRI CC，我们在约20%的CMD病例中经生物化学分级分离后检测到Sarkosyl不溶性的DISC1免疫反应性，而在正常对照个体或神经退行性疾病患者中均未发现。随后的研究 体外 揭示了DISC1的聚集倾向受到疾病相关多态性S704C的影响4，且在体外生成的 DISC1 aggresomes 具有细胞侵袭性 体外 具有细胞侵袭性5，这与之前报道的 A&beta;6tau7-9, &alpha;α-突触核蛋白10，多聚谷氨酰胺11或 SOD1 聚集体12这些发现促使我们提出，至少部分伴有CMD且存在DISC1聚集的病例可能属于蛋白质构象病。
 本文描述了如何在哺乳动物细胞中生成DISC1包涵体，通过蔗糖梯度离心纯化，并将其用于细胞侵袭性研究。同样，我们还阐述了如何制备 exclusively 多聚化的C端DISC1片段，对其进行标记和纯化以开展细胞侵袭性研究。利用重组的DISC1多聚体，我们获得了与相似标记的合成α-突触核蛋白片段相当的细胞侵袭能力。 &alpha;α-突触核蛋白片段。我们还证明该片段在立体定位注射到受体动物脑内后可被体内摄取 在体内 当立体定位注射至受体动物脑内时。

细胞培养来源的全长 DISC1 蛋白包涵体的生成、纯化及细胞侵袭性研究，以及标记的多聚体重组 DISC1 蛋白片段的研究 E. coli 进行了描述。在细胞培养中的受体细胞和神经元中均显示了细胞侵袭性。 在体内 立体定向脑内接种后

细胞侵入性 DISC1 蛋白物种的生成、纯化与表征

蛋白质聚集被认为是慢性退行性脑部疾病的一般特征，例如神经退行性疾病中的阿尔茨海默病（Aβ、tau）、帕金森病（α-synuclein）、亨廷顿病（polyglutamine、huntingtin）等。蛋白质聚集被认为源于蛋白质稳态失衡（proteostasis），即错误折叠蛋白的生成与降解之间出现失衡。值得注意的是，这些疾病在散发性病例中也发现相同蛋白质的聚集，而这些蛋白质仅在罕见的家族性突变变体中发生突变。精神分裂症是一种慢性进行性脑部疾病，在许多病例中伴随永久且不可逆的认知功能缺损。在一项候选基因研究中，我们探讨了DISC1（Disrupted-in-schizophrenia 1）——一个在苏格兰一个与慢性精神疾病相关的家族中克隆出的基因1,2——是否可在散发性精神分裂症患者脑组织中以不溶性聚集物的形式存在3。利用SMRI CC，我们在约20%的精神分裂症（CMD）病例中，经生化分级后检测到嗜硫氧环素（sarkosyl）不溶性的DISC1免疫反应性，而在正常对照或神经退行性疾病患者中未见此现象。后续体外研究表明，DISC1的聚集倾向受疾病相关多态性S704C4的影响，且体外生成的DISC1包涵体具有细胞侵袭性5，类似于Aβ6、tau7-9、α-synuclein10、polyglutamine11或SOD1聚集物12所表现出的特性。这些发现促使我们提出假说：至少部分精神分裂症（CMD）病例，特别是存在DISC1聚集的病例，可能属于蛋白质构象病。本文描述了我们在哺乳动物细胞中生成DISC1包涵体、通过蔗糖梯度纯化并用于细胞侵袭性研究的方法。同样，我们还描述了如何生成 exclusively 多聚体形式的C端DISC1片段，对其进行标记和纯化以用于细胞侵袭性研究。使用重组的DISC1多聚体，我们实现了与类似标记的合成α-synuclein片段相当的细胞侵袭能力。我们还证明，当该片段通过立体定位注射至受体动物脑内时，可在体内被摄取。

以下实验操作的总体目标是制备纯化的盘状结构。这些结构具有侵入受体细胞的能力。将展示两种不同的方法来实现该目标，首先介绍第一种方法。在NLF人神经母细胞瘤供体细胞中过表达形成荧光蛋白盘状结构的一号融合蛋白。随后用PBS洗涤细胞，收集并裂解细胞，裂解过程未使用去污剂。消化DNA后，采用蔗糖梯度系统纯化核糖体。通过该方法纯化的Agrios细胞侵袭效率较低。另一种方法是在大肠杆菌中过表达重组disc one蛋白的第598至785位氨基酸。随后用DITE 594标记该蛋白片段，并通过NI-NTA层析柱进行透析和纯化，以去除任何未结合的染料及多聚体disc。通过该方法产生的片段具有高效的细胞侵袭能力，可用于评估宿主细胞的侵袭情况。可使用纯化的荧光蛋白圆盘、one risomes 或标记的重组圆盘。将 one 片段与目标受体细胞共同孵育。随后加入Trian blue以淬灭细胞外荧光，并通过共聚焦显微镜观察侵袭情况。迄今为止，蛋白质聚集尚未被认定为精神分裂症等慢性精神疾病的一个特征。尽管精神分裂症中一种蛋白的异常是细胞侵袭性的候选因素，但蛋白质聚集是蛋白质构象疾病的一个标志性特征。本文通过两种方法证明，DISC1蛋白聚集体具有细胞侵袭性，因此DISC1相关疾病或DISC1神经病变属于蛋白质构象异常疾病。这两种方法分别是：首先，从神经母细胞瘤细胞系中纯化全长DISC1 ASOS蛋白；其次，在大肠杆菌中表达C端多聚体DISC1片段，并进行纯化及荧光染料标记。尽管第一种方法仅导致较低的细胞侵袭效率，即仅有约0.3%的细胞摄取了纯化的微粒体，但纯化的重组蛋白片段可感染高达20%的暴露细胞。此处描述的方法应可推广至其他已明确证实存在顶体形成或多聚体组装的蛋白质。每10个10厘米培养皿中。在补充的 RPMI 1640 培养基中接种 1.5 × 10⁶ 个人类神经母细胞瘤和 LF 细胞，并过夜培养。次日，细胞应达到 70% 至 80% 汇合度，标记五个培养皿用于转染 PC DNA 3.1 MRFP 和 EGFP 标记的人全长 disc 一，另五个培养皿用于单独转染 EGFP 质粒。每 10 厘米培养皿中，加入 15 微克质粒 DNA、30 微升 met affecting 和 750 微升。在微量离心管中加入Opti MEM，通过移液器反复吹打混匀，室温孵育20分钟。随后进行细胞转染，将DNA转染试剂溶液逐滴加入细胞中，于37摄氏度、5% CO₂条件下继续培养。转染48小时后，通过荧光显微镜检测mRFP全长Disc1的表达情况，并确认agro小体的形成。部分细胞中含有大量荧光蛋白包涵体，如图所示。本方案结合了一种从脑组织中纯化路易小体的方法以及分离较大聚集体或聚集体区域的方案，因为已有方法均基于去垢剂的使用，而为了在细胞侵袭性检测中应用，分离不含去垢剂的蛋白质至关重要。接下来，吸除培养基，用 PBS 洗涤，并加入含有蛋白酶抑制剂混合物的 400 微升 PBS。然后刮取细胞，将一毫升细胞悬液和 10 个陶瓷珠加入一个两毫升的裂解管中。使用预冷的细胞裂解24型匀浆器，以三个62纳秒脉冲裂解细胞。该过程的机械力可能导致样品温度升至37摄氏度以上，因此应在冰上冷却样品。裂解完成后，在冰上冷却细胞，然后加入10毫摩尔/升氯化镁和每毫升40单位的DNAA，于37摄氏度振荡孵育60分钟。分别配制 10 毫升的 80%、50% 和 20%（质量/体积）蔗糖 PBS 溶液。然后在 15 毫升锥形管中制备蔗糖梯度，依次加入 2 毫升 80% 蔗糖溶液、2 毫升 50% 蔗糖溶液和 2 毫升 20% 蔗糖溶液。缓慢倾倒梯度溶液，并注意不要扰动已加入的下层溶液。将消化后的裂解液小心地铺在梯度液上方，于4°C、1000 × g条件下离心15分钟。离心结束后，用移液器仔细收集50%至80%蔗糖层之间的界面，并与五个体积的溶液混合，转入15 mL锥形管中，于4°C、1000 × g条件下再次离心15分钟。小心弃去上清液，保留含有沉淀的致密区域。在此界面再重复洗涤两次。农杆菌集落具有荧光性，最后一次洗涤后可在显微镜下通过紫外光观察。弃去上清液，将沉淀重悬于 250 至 500 微升 PBS 中。此沉淀物含有纯化的农杆菌集落。向含有SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞的24孔板的每个孔中加入10 µL MRFP标记的单层囊泡（asome）悬液，这些细胞在无菌玻璃盖玻片上稳定表达C末端融合可溶性GFP。在37°C下孵育48至72小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，并用0.04%台盼蓝孵育5分钟以淬灭胞外荧光。然后用 PBS 洗涤以去除台盼蓝。接着将培养皿置于冰上，加入 4% PFA 和 PBS 固定细胞 10 分钟。随后用无菌水洗涤一次，并使用抗荧光淬灭封片剂（ProLong Gold）将盖玻片封固在载玻片上。通过受体细胞在Zack图像中表达的招募蛋白与外源性施加的攻击区域共定位，确认外源性入侵的摄取情况。该Zack区域深度约为六微米。以200纳米为步长拍摄的24张图像。MRFP标记的农杆菌区荧光（红色）招募了细胞质中的GFPC末端结构域。绿色显示的一个片段与红色共定位时呈现黄色，表明农杆菌区已进入受体细胞质，并招募了原本可溶性的Disc1蛋白。在本实验步骤中，将使用 DITE 5 94 标记人源 Disc1 蛋白。该标记方法可实现对重组蛋白的直接示踪，无需额外进行免疫染色。首先，按照随附文件所述方法制备蛋白，通过透析去除β-巯基乙醇：将蛋白溶液按 1:2000 比例稀释于两升 PBS 缓冲液中，重复透析三次。接下来，用DITE 5 94 IDE标记1毫克的圆片1，将一毫克每毫升的蛋白质溶解于PBS中，并加入5毫摩尔的TCEP以恢复游离的TH基团，向反应体系中加入20微升DMF溶解的染料，在室温下孵育两小时。使用截留分子量为10,000道尔顿的SLI透析盒，在PBS中以1:2000的比例透析蛋白质三次，每次两小时。接下来，为进一步提高标记蛋白质的纯度。在NI-NTA柱上进行基于His标签的亲和纯化。用10毫升PBS洗涤1毫升NI-NTA介质，然后将标记的透析蛋白上样至柱中，并使其流经柱子。随着蛋白质与NTA介质结合，溶液将逐渐失去部分蓝色，未标记的游离染料会留在流穿液中。待蛋白溶液完全上样后，用20毫升PBS洗涤柱子三次，以洗脱蛋白质，然后向柱中加入2毫升含有500毫摩尔咪唑的PBS。将阀门调至低速，同时监测 N NI NTA 柱上的有色条带，逐滴洗脱。需要说明的是，该有色洗脱组分含有标记的重组蛋白，将 EIT 转移至 SLI 透析盒中，并在透析后用稀释至 1:2000 的 10 毫摩尔 NAPI 缓冲液透析三次，每次两小时，每次使用两升缓冲液。将 EIT 通过 0.45 微米无菌注射器滤器过滤，然后分装为五份 100 微升样品，立即在液氮中速冻。每100微升分装样品中的总蛋白量应为0.5至1微克/毫升。为评估蛋白的侵入性，向含有受体SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的24孔板的每个孔中加入含5至10微克/毫升标记的重组Disc1蛋白的培养基。在无菌玻璃盖玻片上持续表达可溶性GFP标签Disc1 C末端，孵育48至72小时。淬灭细胞外荧光后，固定并封片，操作步骤与处理农杆菌区域细胞相同，随后通过扎克成像（Zack Imaging）确认外源施加的重组蛋白是否入侵。当标记的蛋白被摄取后，可在共聚焦显微镜生成的图像中观察到其位于受体细胞轮廓内部。该扎克成像的扫描深度约为五微米，共24步，每步220纳米。此处，呈红色的重组 Disc1 蛋白片段（598 至 785 位氨基酸）被表达可溶性 C 末端绿色荧光蛋白（GFP）标记 Disc1（呈绿色）的受体细胞摄取，以评估 Disc1 蛋白的侵袭性。由 MRFP 全长标记的 Disc1 蛋白聚集体（acrosomes）从 NLF 细胞中纯化，并按照本图所示方法施加于受体 SH-SY5Y 细胞。如图所示，MRFP 标记的 Disc1 顶体侵入了表达可溶性 GFP 标记 C 末端 Disc1 的人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞。此外，带有MRFP标签的disc one asome能够将可溶性GFP标签的disc one招募到不溶性聚集体中，以确定DIA轻标记的重组disc one的侵袭性。如图所示，将重组disc one蛋白（以红色显示）应用于表达可溶性GFP disc one的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，黄色点状信号表明可溶性GFP标记的C端disc one被招募至聚集体中。从大肠杆菌表达并纯化的重组disc one蛋白在体内也表现出对神经元的细胞侵袭性，当将该多聚体蛋白通过立体定位注射至大鼠内侧前额叶皮层时，Zack成像证实了重组disc one蛋白存在于大鼠皮层神经元中，该结果通过神经元核特异性抗体染色得以确认。我们刚刚向您展示了两种用于生成盘状蛋白一聚集体以研究细胞侵袭的方法。通过使用其中任意一种方法，我们可以在不涉及外源DNA转染所导致的重组基因表达等潜在干扰变量的情况下，研究细胞摄取盘状蛋白一聚集体所产生的细胞效应。这些技术可用于在体外研究盘状蛋白一蛋白病理的生物学效应，也可通过脑内接种或其他给药方式在动物模型中进行体内研究。我们相信，这些技术最终也可能通过略微修改针对特定蛋白质的实验方案，而应用于其他蛋白质聚集体。进行此操作时，务必要留出充足时间，仔细分析共聚焦显微镜图像。

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共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

学习DISC1蛋白聚集体的生成、纯化及表征方法，用于研究细胞侵袭性与神经精神疾病。本实验展示两种纯化方案，比较其在细胞培养及体内神经元中的侵袭效率差异。

细胞侵入性 DISC1 蛋白物种的生成、纯化与表征

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