Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

以下程序的总体目标是生成纯化的椎间盘。一个聚集体能够侵入受体细胞。第一种方法将演示实现此目标的两种不同方法。

asome 形成荧光蛋白 disc one 融合蛋白在 NLF 人神经母细胞瘤供体细胞中过表达。然后用收集的 PBS 洗涤细胞，并在不使用去污剂的情况下放置。消化 DNA，并使用蔗糖梯度系统纯化农业区。

通过该方法纯化的 Agrios 具有较低的细胞侵袭效率。另一种方法是在大肠杆菌中过表达重组 disc one 蛋白的氨基酸 5 98 至 7 85。然后用 DITE 5 94 标记蛋白质片段，使用 NI NTA 基质透析和纯化，去除任何剩余的未结合染料多聚体圆盘。

该方法产生的一个片段具有很高的细胞侵袭效率，以评估宿主细胞的侵袭。纯化的荧光蛋白盘、一个 risomes 或标记的重组盘。将一个片段与感兴趣的受体细胞一起孵育。

然后添加 Trian 蓝以淬灭细胞外荧光，并通过共聚焦显微镜观察侵袭。到目前为止，蛋白质聚集尚未成为精神分裂症等慢性精神疾病的公认特征。在精神分裂症中被破坏的地方，一种蛋白质是候选细胞，蛋白质聚集体的侵袭性是蛋白质确认疾病的标志性特征。

在这里，我们用两种方法表明，椎间盘一蛋白聚集体是细胞侵袭性的，因此椎间盘一相关疾病或椎间盘一神经病变是蛋白质确认性疾病。这两种方法首先是全长圆盘的纯化，一种是从神经母细胞瘤细胞系中纯化 ASOS，另一种是 C 末端多聚体圆盘的表达。大肠杆菌中的一个片段以及用荧光染料进行纯化和标记。

虽然第一种方法只导致 oh 0.3% 的细胞吸收纯化的微粒体的低效细胞侵袭，但 pur 重组蛋白片段感染高达 20% 的暴露细胞。此处描述的方法应该可以转移到顶体形成或多聚体组装已令人信服地证明的其他蛋白质。在 10 个 10 厘米的培养皿中。

补充的 RPMI 1640 培养基中，将 1.5 倍 10 接种到六个人神经母细胞瘤和 LF 细胞中，并生长过夜。第二天，细胞应 70% 至 80% 汇合，标记 5 个培养皿，用于转染 PC DNA、3.1、MRFP 和 EGFP 标记的人全长圆盘 1 和 5，用于单独转染 EGFP 质粒。对于每个 10 cm 培养皿，混合 15 μg 质粒 DNA、30 μL met 影响质粒 DNA 和 750 μL 质粒 DNA。

Opti MEM 放入微量离心管中，通过上下吹打制成，在室温下孵育 20 分钟。然后转染细胞，加入 DNA 转染试剂溶液，滴加到细胞中，在 37 摄氏度和 5%CO 2 下孵育细胞转染后 48 小时监测 MRFP 全长圆盘一的表达，并在荧光显微镜下确认农业区的形成。一些细胞含有大量荧光蛋白，如图所示。

该方案结合了从脑组织中纯化路易体的方法和分离较大聚集体或农业区的方案，因为已经存在的方法基于去污剂的使用，因此分离不含去污剂的蛋白质用于细胞侵袭性测定至关重要。接下来，用 PBS 吸出培养基洗涤液，并加入 400 微升含有蛋白酶抑制剂混合物的 PBS。然后刮擦细胞，将 1 毫升细胞悬液和 10 个陶瓷珠加入 2 毫升裂解管中。

在细胞前 Lyse 24 匀浆器上使用三个第 62 脉冲裂解细胞。该过程的机械力可能会将样品内的温度升高到 37 摄氏度以上。因此，应注意将样品放在冰上冷却裂解程序后，在冰上冷却细胞后，加入 10 毫摩尔氯化镁 40 单位/毫升 DNAA，并在 37 摄氏度下摇动孵育 60 分钟。

在 PBS 中制备每体积 80%、50% 和 20% 蔗糖重量各 10 毫升。然后在 15 毫升锥形管中，从 2 毫升 80% 蔗糖开始制备蔗糖梯度，然后是 2 毫升 50% 和 2 毫升 20% 蔗糖。慢慢倒入渐变，注意不要打扰已经倒入的层。

接下来，将消化的裂解物铺在梯度上，并在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 离心 15 分钟。断开后，用移液管小心地收集 50% 至 80% 蔗糖层之间的界面，并与 5 体积的 15 ml 锥形管离心机在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 混合 15 分钟。小心地去除上清液，保留含有沉淀的农业区。

在此界面中再重复洗涤两次。Agri 区是荧光的，可以在最后一次洗涤后在紫外线下在显微镜下看到，弃去上清液并将沉淀重悬于 250 至 500 微升 PBS 中。该颗粒包含纯化的农业区。

将 10 微升 MRFP 圆盘、1 个 asome 悬浮液添加到含有 SHSY 5 Y 人神经母细胞瘤细胞的 24 孔板的每个孔中。组成型表达可溶性 GFP 圆盘，一个 C 端在无菌玻璃盖玻片上，并在孵育后孵育 48 至 72 小时。用 PBS 洗涤细胞 3 次，并用 0.04% trian 蓝淬灭细胞外荧光 5 分钟。

然后用 PBS 洗涤以去除 trian 蓝。接下来，将培养皿放在冰上，加入 4% PFA 和 PBS 10 分钟以固定细胞。然后用无菌水洗涤一次，并将盖玻片安装在带有 DPI 封固剂的延长金的载玻片上。

确认外源性侵袭的摄取。通过与 Zack 图像中受体细胞表达的募集蛋白共定位来应用聚集区。这个 Zack 的深度约为 6 微米。

以 200 纳米的步长拍摄 24 张照片。红色所示的 MRFP 圆盘 1 农业区的荧光募集了胞质 GFPC 末端圆盘。一个以绿色共定位显示的片段显示为黄色，表明农业区已进入受体胞质溶胶并募集了以前可溶的 disc one 蛋白。

在协议的这一部分中，人盘将用 DITE 5 94 标记。该 D 允许直接监测重组蛋白，而无需额外的免疫染色。首先将随附文件中所述制备的蛋白质从束巯乙醇中释放出来，方法是在 2 升稀释度为 1 至 2000 的 PBS 中透析 3 次。

接下来，用 DITE 5 94 IDE 标记 1 毫克圆盘，将 1 毫克/毫升蛋白质溶解在 PBS 中，并加入 5 毫摩尔 TCEP 以回收游离 TH 基团，向反应中加入 20 微升 DMF 溶解染料，并在室温下使用截留分子量为 10 的 SLI 透析盒孵育 2 小时， 000. 道尔顿在 PBS 中以 1：2000 的比例将蛋白质透析 3 次，每次 2 小时。接下来进一步提高标记蛋白的纯度。

在 NI NTA 柱上进行基于 hiss 标签的亲和纯化。用 10 毫升洗涤 1 毫升 NI NTA 基质。然后，PBS 将标记的透析蛋白涂在色谱柱上，让它在色谱柱上运行。

由于蛋白质与 NTA 基质的结合，溶液会慢慢地失去一部分蓝色，未标记的游离染料将保留在流出物中。一旦输入蛋白质溶液。在色谱柱中，用 20 ml PBS 洗涤色谱柱 3 次以洗脱蛋白质，向色谱柱中加入 2 mL含有 500 毫摩尔烯的 PBS。

将阀设置为慢速并逐滴洗脱，同时监测 N NI NTA 色谱柱上的彩色条带。需要注意的是，洗脱液的这种有色组分含有标记的重组蛋白，将 EIT 转移到 SLI 透析盒中，并在透析后以 1 至 2000 的稀释度将 EIT 透析 3 次至 10 毫摩尔 NAPI，每次 2 小时，每次 2 L。将 EIT 推入无菌 0.45 微米针式过滤器，然后分装 5 倍 100 μL 样品，并在液氮中快速冷冻。

蛋白质总量应为每 100 微升等分试样中每毫升 0.5 至 1 微克。为了评估蛋白质的侵袭性，将含有 5 至 10 μg/毫升标记的重组盘 1 蛋白的培养基添加到含有受体 SH SY 5 Y 人神经母细胞瘤细胞的 24 孔板的每个孔中。组成表达可溶性 GFP 标签的圆盘，一个 C 端，位于无菌玻璃盖玻片上，孵育 48 至 72 小时。

淬灭细胞外荧光，固定和安装细胞，就像对 agri zone 处理的细胞所做的那样，通过 Zack 成像确认外源应用的重组蛋白的侵袭。当标记的蛋白质被摄取时，在共聚焦显微镜生成的图像中，它会在受体细胞的周边被检测到。这个 Zack 以 24 级 220 纳米的步长包含大约 5 微米的深度。

在这里，红色所示的重组圆盘 1 片段 5 98 至 7 85 被表达可溶性 C 末端 GFP 标记的圆盘 1 的受体细胞摄取，以绿色显示，以确定圆盘的侵袭性。一种蛋白质聚集体，由 MRFP 标记的全长圆盘 1 组成的农业区，从 NLF 细胞中纯化，并应用于受体 SH SY 5 Y 细胞，如图所示。A-M-R-F-P 标记的椎间盘 1 顶体侵入表达可溶性 GFP 的可溶性 GFP 的 5 Y 细胞 1 号椎间盘 1。

此外，MRFP 标记的椎间盘 1 asome 能够将可溶性 GFP 标记的椎间盘 1 募集到不溶性聚集体中，以确定 DIA 光标记的重组椎间盘 1 的侵袭性，应用于表达可溶性 GFP 椎间盘 1 的 SH SY 5 Y 神经母细胞瘤细胞，如图所示。以红色显示的重组椎间盘一蛋白麦芽侵入受体细胞，黄点表示可溶性 GFP 标记的 C 末端椎间盘一被募集到聚集体中，当多聚体蛋白立体定向注射到大鼠的内侧前额叶皮层时，从大肠杆菌中表达和纯化的重组椎间盘一也对体内神经元具有细胞侵袭性。Zack 成像证实用抗神经元核抗体染色的大鼠皮层神经元中存在重组 disc one 蛋白。

我们刚刚向您展示了两种生成 disc one 聚集体以研究细胞侵袭的方法。使用这些方法中的任何一种，我们都可以研究 disc one 聚集摄取的细胞效应，而不会通过转染外源 DNA 来产生重组基因表达的潜在混杂变量。这些技术可用于研究 disc one 蛋白病理学在体外细胞中的生物学效应，以及在动物模型中通过脑内接种或其他给药在体内的生物学效应。

我们相信，这些技术最终也可以通过对每种特定蛋白质采用的方案进行轻微修改而转移到其他蛋白质聚集体。执行此程序时，请务必花时间认真分析共聚焦显微镜图像。