Name: 内向整流钾通道的小分子调节剂的高通量筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 了解利用荧光铊通量检测技术对内向整流钾通道进行高通量筛选的方法。该技术通过384孔板检测小分子调节剂，为神经科学和药理学研究提供可靠的药物发现工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目1R21NS073097-01和1R01DK082884（J.S.D.）以及美国国立卫生研究院基金会资助项目PIER11VCTR的支持。

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
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<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
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<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

数据处理： 数据采集完成后，分析中的一个常见步骤是将每个孔的荧光响应值 F 对其在实验开始时的初始值 F0 进行归一化处理。这一操作通常被称为“静态比值”，记作“F/F0"。 当 F0 主要由指示剂染料信号主导时，静态比值法可在很大程度上校正诸如光照不均、信号采集差异以及细胞数量不一致等多种因素。然而，当染料信号较弱或系统中背景荧光或反射较强时，除非在计算静态比值前已对背景信号进行了适当处理，否则该方法将难以有效。数据归一化后，通常需将荧光波形简化为一个单一数值，用于量化活性并筛选阳性结果。最常用的方法是拟合加入 Tl+ 后 10 秒内的数据点，以获得诱导荧光上升的初始斜率。在阳性结果筛选中，一种常用策略是假设测试化合物群体中的绝大多数均为无活性化合物（即零假设成立）。据此计算测试群体的均值和标准差，并将偏离均值三个标准差以上的样本判定为阳性结果。
针对长时间化合物孵育的方案拆分：在检...

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The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table><tbody><tr><td>pcDNA5/TO</td><td>Invitrogen</td><td>V1033-20</td><td>四环素诱导型表达载体</td></tr><tr><td>T-REx-HEK293 细胞</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td>四环素诱导型细胞系</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX/Plus 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S11550</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Blasticidin S</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>无钙镁HBSS</td><td>Mediatech</td><td>21022CV</td><td>细胞洗涤</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-0.25%</td><td>Mediatech</td><td>25053CI</td><td>细胞解离</td></tr><tr><td>四环素盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>T9823</td><td>诱导剂</td></tr><tr><td>透析胎牛血清</td><td>ATLANTA Biologicals</td><td>S12650</td><td>铺板培养基</td></tr><tr><td>FluoZin-2</td><td>Invitrogen</td><td>F24189</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>染料负载</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>测定缓冲液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td>测定缓冲液</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C3771</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>硫酸铊</td><td>Aldrich</td><td>204625</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Tl&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 刺激缓冲液</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>八通道电子移液器</td><td>Biohit</td><td>E300</td><td>384孔板中的细胞铺板</td></tr><tr><td>BD PureCoat 氨基包被 384 孔板</td><td>BD 生物科学</td><td>356719</td><td>检测用微孔板</td></tr><tr><td>Echo 认证的 384 孔聚丙烯微孔板（384PP）</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>化合物来源微孔板</td></tr><tr><td>384孔聚丙烯微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi 试剂分配器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>ELx405 微孔板洗板机</td><td>BioTek</td><td>ELx405HT</td><td>自动细胞洗涤</td></tr><tr><td>Echo液体处理系统</td><td>Labcyte</td><td>Labcyte Echo 550</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 自动化液体处理平台</td><td>安捷伦科技</td><td>标准模型</td><td></td></tr><tr><td>滨松 FDSS 6000</td><td>滨松</td><td></td><td>动力学成像板式读数仪</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1&lt;/strong&gt;材料与试剂清单&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

高通量筛选内向整流钾通道的小分子调节剂

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

内向整流钾（Kir）通道家族的特定成员被认为是多种疾病的潜在药物靶点，包括高血压、心房颤动和疼痛1,2。然而，由于缺乏良好的药理学工具，目前在理解其治疗潜力甚至基本生理功能方面的进展较为缓慢。事实上，与电压门控钾（Kv）通道S4超家族相比，内向整流通道家族的分子药理学研究远远落后；对于Kv通道，已发现多种具有纳摩尔亲和力且高度选择性的肽类毒素调节剂3。蜜蜂毒液毒素tertiapin及其衍生物是Kir1.1和Kir3通道的有效抑制剂4,5，但由于肽类具有抗原性以及生物利用度低、代谢稳定性差和组织穿透能力弱等缺点，其在治疗和实验应用中均受到限制。因此，开发具有优良药理学特性的高效且选择性的小分子探针，将是全面理解Kir通道生理功能及其治疗潜力的关键。
美国国立卫生研究院（NIH）共同基金支持的分子文库探针生产中心网络（MLPCN）为学术界科学家提供了开展探针发现研究的机会，以针对药理学研究尚不充分的分子靶点和信号通路进行探索6。MLPCN为研究人员提供进入工业级筛选中心的渠道，并提供药物化学和信息学支持，以开发小分子探针，阐明基因及其基因网络的功能。进入MLPCN的关键步骤是建立一种稳定、特异的靶点或通路特异性检测方法，该方法需适用于高通量筛选（HTS）。
在此，我们介绍如何建立一种基于荧光的铊（Tl+用于高通量化合物筛选的Kir通道功能通量测定7,8,9,10该检测基于K的通透性+ 通道孔至K+ 同系物 Tl+一种市售的荧光Tl+ 报告染料用于检测铊离子（Tl⁺）的跨膜通量+ 通过孔道。目前至少有三种市售染料适用于Tl+ 通量检测：BTC、FluoZin-2 和 FluxOR7,8本方案描述了使用FluoZin-2进行检测方法的开发。尽管FluoZin-2最初被开发并作为锌离子指示剂销售，但在Tl⁺存在时，其荧光发射也表现出显著且剂量依赖性的增强。+ 结合。在FluxOR问世之前，我们就开始使用FluoZin-27,8 并持续如此9,10然而，三种染料的检测方法开发步骤基本相同，用户应根据自身具体需求确定最适合的染料。我们还讨论了该检测方法必须达到的性能基准，方可被考虑纳入MLPCN。由于Tl+ 可轻松穿透大多数 K+ 通道，该检测方法应适用于大多数 K+ 通道靶点

使用四环素诱导型表达系统可为区分内源性通路和目标Kir通道中的Tl+流提供便捷的内部对照。图1展示了一些在不同类型实验中使用的细胞铺板图示例，其中未诱导或四环素诱导的细胞孔位以不同颜色标示。图2A显示了用于确定检测开发和化合物筛选中最佳Tl+浓度的源板图，颜色梯度代表从100%到0.002%的3倍稀释系列Tl+浓度。图2B展示了一个代表性的荧光强度图，冷色调至暖色调分别表示低至高的Tl+流值。本实验使用了图1C所示的细胞铺板图。对Tl+浓度-反应曲线（CRC）拟合四参数逻辑函数（图2C），用于确定Tl+的EC80值为15%。图3A显示了用于测定检测体系对DMSO耐受性的源板图，第1列和第24列仅含有检测缓冲液，颜色梯度表示从10%到0.01%的2倍稀释系列DMSO浓度。...

本文介绍了用于建立和验证定量荧光检测方法以测量内向整流钾（Kir）通道活性，进而用于高通量化合物筛选的技术方案。

内向整流钾（Kir）通道家族的特定成员被认为是多种疾病的潜在药物靶点，包括高血压、……

本实验的总体目标是发现能够调节内向整流钾通道活性的新型化合物。首先，将表达目标 KIR 通道的四环素诱导型 HK293 细胞接种至 384 孔板中；第二步是用一种名为 fluo-2 的荧光铊离子报告染料对细胞进行负载。接下来，洗去细胞中未掺入的染料，并替换为含有阴性对照或待测化合物的检测缓冲液。最后一步是向孔中加入刺激缓冲液，以启动铊离子流入。最终，使用荧光酶标仪鉴定那些能够改变铊离子通过KIR通道转运的化合物。效果较差。与现有的技术（如人工膜片钳电生理学）相比，该方法的主要优势在于使研究人员能够同时进行数百次实验，并且每天可完成数千次实验。该方法使研究人员能够对包含数千种小分子的文库进行筛选，以发现内向整流钾通道的调节剂。在进行铊通量实验的前一天，将细胞解离，并按照随附的手稿中所述方法定量测定细胞悬液的密度。接下来，使用含有10%透析胎牛血清的BH培养基，在BD PureCoat Amin包被的384孔板的每个孔中接种20,000个稳定转染了目标KIR通道基因的单克隆细胞，可使用Thermo MultiDrop Combi或多通道移液器进行接种。次日，在显微镜下检查该板，确保细胞已贴壁，并均匀分布在各孔底部。然后使用 ELX 405 微孔板清洗仪将细胞培养基替换为 HBSS 检测缓冲液，每孔 20 µL。接着，通过短暂离心试管，将 50 µg 的 Fluo-2 粉末溶解于 100 µL 无水 DMSO 中，配制 2:00 AM D 负载溶液。现在向染料中加入 50 µL 的 20%（重量/体积）Pluronic F127 DMSO 溶液，通过轻轻吹打混匀。然后将 150 µL Fluo-2 AM Pluronic F127 加入 35 mL HBSS 检测缓冲液中，轻轻混匀。接下来，向每个已含有 20 微升 HBSS 检测缓冲液的孔中加入 20 微升染料上样缓冲液。将细胞在室温下孵育约一小时，使细胞充分加载染料。通过将 0.5 克碳酸氢钠新鲜溶解于 50 毫升 5 倍铊刺激缓冲液中，制备铊刺激板。然后将50 µL该溶液加入至聚丙烯384孔板的每个孔中。在细胞于凌晨2:00 AM完成flus负载后，使用ELX 405酶标洗板机洗涤该板。接着，向每个孔中加入20 µL或40 µL HBSS检测缓冲液，该板即准备好用于实验。将铊试剂板和细胞板放入Hema Matsu功能药物筛选系统或具有集成液体分配功能的等效动力学成像板式读板机中，并使用适用于荧光素类染料（如Fluo-4）的适当滤光片。随后，设置单次加样程序，向含有40 µL HBSS检测缓冲液的细胞板相应孔中加入10 µL 5倍浓缩的铊溶液。然后以1 Hz的采样频率记录至少10秒的基线荧光信号。当细胞铺板、洗涤和染料加载条件达到最佳时，整块板各孔间的荧光信号应保持均匀且稳定。同时，使用集成的384通道移液器同时向每个孔中加入铊离子刺激缓冲液，并继续记录至少两分钟，以捕获铊离子诱导的荧光上升速率和峰值，用于后续离线分析。在接下来的一系列实验中，通过在384孔板的每列和每行每隔一个孔接种对照抑制剂，并在其余孔中加入DMSO作为溶剂对照，来评估该检测方法的均匀性和可重复性。使用多通道移液器。通过将靶向 KIR 通道的抑制剂以先前确定的浓度（每孔 80 µL，含 0.1% DMSO 载体）加入 384 孔聚丙烯板中，制备化合物 DMSO 板。操作时从 A1 孔开始加入已知抑制剂，随后交替至 B2 孔，依此类推，直至 B24 孔。从 B1 孔开始，使用 DMSO 重复此操作，依次进行至 A24 孔。现在将细胞板、化合物板和铊刺激板装入酶标仪中。然后设置一个双加样程序，将 20 微升浓度为两倍的化合物系列加入到含有 20 微升 HBSS 检测缓冲液的细胞板对应孔中。将化合物加入细胞板中，在室温下孵育最多20分钟。记录至少10秒的两个荧光通道的基础荧光值。然后向细胞板的每个孔中加入10微升5倍浓度的铊缓冲液。在随后的三天内重复该实验，以确定结果的可重复性。利用DMSO处理细胞和药物处理细胞的铊离子通量数据，计算Z'因子（Z prime）值。Z'因子是一种用于评估两组孔间变异性的统计指标，其计算公式基于P组和N组的均值与标准差，其中P代表未抑制的通量值，N代表完全抑制的通量值。Z'因子值在三个不同日期均大于或等于0.5的实验被认为适用于高通量筛选。这些图示为在不同类型的实验中所使用的细胞铺板布局图示例。未诱导或四环素诱导细胞所在的孔位以不同颜色标示。该图展示了用于确定检测方法开发和化合物筛选中最佳铊浓度的源板图。颜色梯度代表从100%到0.002%的三倍稀释系列，此处为典型的荧光强度图，颜色由冷色调至暖色调表示铊通量值由低到高。图中所示的细胞铺板图通过四参数逻辑函数拟合铊浓度-反应曲线（CRC），用于确定80%有效浓度（EEC80）为15%的铊。该图显示了用于测定分析方法中 DMSO 耐受性的源板图。第 1 列和第 24 列仅含有分析缓冲液，而颜色梯度表示从 10% 到 0.01% 的两倍稀释系列，此处还展示了一个代表性荧光强度图，其中较低的铊离子流值以深蓝色表示。此处汇总了从含有指定浓度 DMSO 的孔中记录的平均铊离子流值。现在此图显示了用于建立已知 KIR 通道抑制剂浓度-反应曲线的源板图。每种化合物用不同颜色表示，通常以三倍稀释系列加样。此处展示了一个代表性的荧光强度图，该图显示了在方法开发和优化后，抑制剂对铊离子流的剂量依赖性抑制作用。铊通量检测还可用于执行多种常规药理学检测。该检测方法此前已被改进用于电压门控和配体门控钾离子通道、非选择性阳离子通道，甚至钾转运体的研究。请注意，操作铊时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套并进行适当的废液处理。

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科研

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Biology

生物学

内向整流钾通道的小分子调节剂的高通量筛选

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高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

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