内向整流钾通道的小分子调节剂的高通量筛选
January 27th, 2013
开发和验证测量活动的高通量化合物筛选的内向整流钾通道（基里巴斯）荧光定量检测方法。
该程序的总体目标是发现调节内向整流钾通道活性的新型化合物。这是通过首先将四环素诱导型 HK 2 9 3 细胞（表达感兴趣的 KIR 通道）接种到 384 孔板中来实现的。第二步是将名为 flu 的荧光铊报告基因染料加载到细胞中，一分为二。
接下来，从细胞中洗涤未掺入的染料，并用含有载体对照或测试化合物的测定缓冲液替换。最后一步是在孔中添加刺激缓冲液以启动铊通量。最终，荧光酶标仪用于识别改变铊离子通过 KIR 通道移动的化合物。穷。
与现有技术（如手动膜片钳电生理学）相比，该方法的主要优点是它使研究人员能够同时进行数百次实验，每天进行数千次实验。这种方法允许研究者筛选数千个小分子的文库，以发现向内整流钾通道的调节剂 铊通量实验前一天解离细胞并定量细胞悬液的密度，如随附手稿所述。接下来，使用含有 10% 透析 FBS 板的 BH 培养基 20， 000 个单克隆细胞，在 BD 纯涂层 Amin 包被的 384 孔板的每个孔中使用热多滴组合或多通道移液器，第二天，在显微镜下检查板，以确保细胞粘附并均匀分布在孔的底部。
然后使用 ELX 4 0 5 洗板机用 HBSS 测定替换细胞培养基。缓冲液为每孔 20 微升。之后，通过短暂离心试管以将 50 微克流感溶解在 100 微升无水 DMSO 中的两种粉末中，在凌晨 2：00 D 加载溶液中制备流感。
现在向染料中加入 50 微升每体积重量为 20% 的 onic F1 27 DMSO 溶液。轻轻移液混合它们。然后在凌晨 2：00 的 F1 27 至 35 毫升 HBSS 测定中加入 150 微升流感，缓冲并轻轻混合。
接下来，向已经包含 20 μL HBSS 测定的每个孔中加入 20 μL 染料上样缓冲液。缓冲区。在细胞上样染料时，在室温下孵育细胞约 1 小时。通过将 0.5 克碳酸氢钠新鲜溶解在 50 毫升 5 x 铊刺激缓冲液中来制备铊刺激板。
然后在上午 2：00 将细胞加载氟化物后，向聚丙烯 384 孔板的每个孔中加入 50 微升溶液。用 ELX 4 0 5 洗板机清洗板。接下来，加入 20 μL 或 40 μL 的 HBSS 测定。缓冲液放回每个孔中，板现在已准备好进行实验。
将铊和细胞板加载到 Hema Matsu 功能性药物筛选系统或具有集成液体分配功能的等效动力学成像读板器中，并使用适当的过滤器来处理基于荧光素的染料，例如 flu oh four。之后，设置单次添加方案，将 10 微升 5 X 铊系列添加到含有 40 微升 HBSS 测定缓冲液的细胞板的相应孔中。然后以 1 赫兹采样频率记录基线荧光至少 10 秒。
一旦建立了最佳的细胞接种、洗涤和 d 加载条件，孔间荧光在整个板上应该是均匀和稳定的。同时，使用集成的 384 通道移液器同时向每个孔中加入铊刺激缓冲液，并继续记录至少两分钟，以便捕获铊诱导的荧光增加的速率和峰值以进行离线分析。在接下来的一系列实验中，通过在 384 孔板的每一列和每行的每其他孔中接种对照抑制剂并将 DMSO 添加到其他孔中作为载体对照来评估测定的均匀性和可重复性。
使用多通道移液器。通过将先前确定的浓度为 80 μL/孔和 0.1% DMSO 载体的目标 KIR 通道抑制剂移液到 384 孔聚丙烯板中来制备复合 DMSO 板。这是通过添加已知的抑制剂来完成的，从 A 井 1 开始，然后替代 B 井 2，依此类推，直到 B 井 24。
重复此过程，DMSO 从井开始，B 1 开始，依此类推，直到 A 24 孔。现在将细胞、化合物和铊刺激板加载到读板器中。然后设置一个两次添加方案，将 20 微升两种 X 浓度化合物系列添加到含有 20 微升 HBSS 测定缓冲液的细胞板的相应孔中。
将化合物添加到细胞板中，并在室温下孵育长达 20 分钟。以两种荧光记录基线流感至少 10 秒。然后向细胞板的每个孔中加入 10 微升 5 x 铊缓冲液。
在随后的三天重复实验以确定结果的可重复性。在 DMSO 和药物处理的细胞中使用铊通量来计算 Z prime 的值。两个井群之间井间变异性的统计测量使用此公式根据 P 和 N 的平均值和标准差计算 Z 素数，其中 P 是未抑制的通量值，N 是完全抑制的通量值。
在三天内 ZPrime 值大于或等于 0.5 的分析被认为适用于高通量筛选。这些图是不同类型实验中使用的细胞接种图的一些示例。含有未诱导或四环素诱导细胞的孔的位置以不同的颜色表示。
该图显示了用于确定分析开发和化合物筛选的最佳铊浓度的源板图。颜色渐变表示从 100% 到 0.002% 铊的三倍稀释系列，这是一个具有代表性的荧光强度图，颜色从冷到暖，表示从低到高的铊通量值。此处显示的细胞电镀图具有四个参数 logistic 函数与铊 CRC 的拟合，用于确定 15% 铊的 EEC 80 值。
该图显示了用于确定分析的 DMSO 耐受性的源板图。第 1 列和第 24 列仅包含分析缓冲液，而颜色梯度表示从 10% 到 0.01%DMSO 的两倍稀释系列，下面是一个具有代表性的荧光强度图，其中低铊通量值用深蓝色表示。此处总结了从含有指定浓度的 DMSO 的孔中记录的平均铊通量值。
现在，该图显示了用于建立 KIR 通道已知抑制剂的浓度响应曲线的源板图。每种化合物都用不同的颜色表示，通常以三倍稀释系列的形式电镀。这里显示了一个具有代表性的荧光强度图，该图显示了铊通量 by-in 抑制剂在其开发和优化后的剂量依赖性抑制。
铊通量测定也可用于进行各种常规药理学测定。铊通量测定法以前已适用于电压和连接的钾通道、非选择性阳离子通道，甚至钾转运蛋白。不要忘记，使用 tellium 可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用手套和适当的废物处理。
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概述
本文介绍了开发和验证定量荧光检测法以测量内向整流钾（Kir）通道活性的方法。该程序旨在通过高通量筛选发现调节Kir通道活性的新化合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 药理学
背景
- 内向整流钾通道（Kir）在细胞兴奋性中起着至关重要的作用。
- 了解Kir通道调节可以带来新的治疗策略。
- 荧光检测法为筛选化合物提供了高通量方法。
- 铊通量是Kir通道活性的可靠指标。
研究目的
- 开发Kir通道活性的定量检测法。
- 促进潜在调节剂的高通量筛选。
- 识别改变铊离子通过Kir通道移动的化合物。
使用的方法
- 将表达Kir通道的四环素诱导的HK293细胞接种到384孔板中。
- 用荧光铊报告染料加载细胞。
- 清洗未结合的染料并用含对照或测试化合物的检测缓冲液替换。
- 加入刺激缓冲液以启动铊通量，并用板式读数仪测量荧光。
主要结果
- 识别显著改变铊离子移动的化合物。
- 验证检测法在高通量筛选中的有效性。
- 证明检测法的重复性和可靠性。
- 发现新的Kir通道调节剂的潜力。
结论
- 开发的检测法是筛选Kir通道调节剂的有价值工具。
- 它可以帮助发现新的治疗化合物。
- 未来的研究可能会对已识别的化合物进行进一步验证。
常见问题
Executive Industry Relevance
Developing robust assays for ion channel targets remains a bottleneck in early drug discovery, particularly for inward rectifier potassium channels where pharmacological tools are limited. This fluorescence-based thallium flux assay enables scalable, quantitative screening of small-molecule libraries to identify modulators with therapeutic potential. By supporting hit identification and lead optimization workflows, the method addresses a critical gap in target validation for cardiovascular, neurological, and pain indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Kir channel function through dose-dependent fluorescence readouts that correlate with ion flux activity.
- Operational Value: Supports screening of thousands of compounds daily, accelerating target hypothesis testing compared to low-throughput electrophysiology.
- Predictive Value: Generates quantitative data suitable for Z-prime calculation, ensuring assay reliability for go/no-go decisions in probe discovery campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses commercially available FluoZin-2 dye to detect transmembrane thallium flux, providing a standardized fluorescence signal for compound screening.
- Reproducibility: Requires consistent Z-prime values ≥0.5 across multiple days, establishing robustness for industrial-scale screening centers.
- Scalability: Compatible with 384-well plate formats and automated liquid handling, enabling integration into high-throughput screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Target Relevance: Directly supports investigation of Kir channels implicated in hypertension, atrial fibrillation, and pain, aligning with disease-modulating hypotheses.
- Lead Identification: Facilitates discovery of small-molecule modulators that can be optimized for selectivity and drug-like properties.
- Mechanistic De-risking: Provides functional validation of compound effects on channel activity, reducing ambiguity in downstream preclinical profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from primary screening to hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of compound libraries to identify activators or inhibitors of Kir channel function.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible fluorescence readouts suitable for primary hit selection in 384-well formats.
- Analytics: Enables calculation of EC80 values and inhibition curves from concentration-response data, supporting potency and efficacy comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing validated chemical probes for target engagement studies in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to most potassium channel targets due to thallium permeability, promoting cross-project assay standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readouts of channel modulation, improving target confidence.
- Operational Value: Standardizes assay execution across teams through defined protocols for cell loading, compound treatment, and flux measurement.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling rapid evaluation of large compound libraries, reducing reliance on low-throughput methods.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of Kir-targeted programs through reliable hit confirmation and reproducibility metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation for accurate flux measurements.
- Dependent on access to fluorescence plate readers with injectors and appropriate filter sets for FluoZin-2 or analogous dyes.
- Necessitates standardization of cell plating density, washing steps, and dye loading times to ensure well-to-well uniformity.
- Involves safety considerations due to thallium toxicity, requiring proper PPE, waste disposal, and containment procedures.
- Assay performance must be validated using known inhibitors to establish inhibition curves and Z-prime thresholds before large-scale screening.
