高通量筛选内向整流钾通道的小分子调节剂

本实验的总体目标是发现能够调节内向整流钾通道活性的新型化合物。首先，将表达目标 KIR 通道的四环素诱导型 HK293 细胞接种至 384 孔板中；第二步是用一种名为 fluo-2 的荧光铊离子报告染料对细胞进行负载。

接下来，洗去细胞中未掺入的染料，并替换为含有阴性对照或待测化合物的检测缓冲液。最后一步是向孔中加入刺激缓冲液，以启动铊离子流入。最终，使用荧光酶标仪鉴定那些能够改变铊离子通过KIR通道转运的化合物。效果较差。

与现有的技术（如人工膜片钳电生理学）相比，该方法的主要优势在于使研究人员能够同时进行数百次实验，并且每天可完成数千次实验。该方法使研究人员能够对包含数千种小分子的文库进行筛选，以发现内向整流钾通道的调节剂。在进行铊通量实验的前一天，将细胞解离，并按照随附的手稿中所述方法定量测定细胞悬液的密度。接下来，使用含有10%透析胎牛血清的BH培养基，在BD PureCoat Amin包被的384孔板的每个孔中接种20,000个稳定转染了目标KIR通道基因的单克隆细胞，可使用Thermo MultiDrop Combi或多通道移液器进行接种。次日，在显微镜下检查该板，确保细胞已贴壁，并均匀分布在各孔底部。

然后使用 ELX 405 微孔板清洗仪将细胞培养基替换为 HBSS 检测缓冲液，每孔 20 µL。接着，通过短暂离心试管，将 50 µg 的 Fluo-2 粉末溶解于 100 µL 无水 DMSO 中，配制 2:00 AM D 负载溶液。

现在向染料中加入 50 µL 的 20%（重量/体积）Pluronic F127 DMSO 溶液，通过轻轻吹打混匀。然后将 150 µL Fluo-2 AM Pluronic F127 加入 35 mL HBSS 检测缓冲液中，轻轻混匀。

接下来，向每个已含有 20 微升 HBSS 检测缓冲液的孔中加入 20 微升染料上样缓冲液。将细胞在室温下孵育约一小时，使细胞充分加载染料。通过将 0.5 克碳酸氢钠新鲜溶解于 50 毫升 5 倍铊刺激缓冲液中，制备铊刺激板。

然后将50 µL该溶液加入至聚丙烯384孔板的每个孔中。在细胞于凌晨2:00 AM完成flus负载后，使用ELX 405酶标洗板机洗涤该板。接着，向每个孔中加入20 µL或40 µL HBSS检测缓冲液，该板即准备好用于实验。

将铊试剂板和细胞板放入Hema Matsu功能药物筛选系统或具有集成液体分配功能的等效动力学成像板式读板机中，并使用适用于荧光素类染料（如Fluo-4）的适当滤光片。随后，设置单次加样程序，向含有40 µL HBSS检测缓冲液的细胞板相应孔中加入10 µL 5倍浓缩的铊溶液。然后以1 Hz的采样频率记录至少10秒的基线荧光信号。

当细胞铺板、洗涤和染料加载条件达到最佳时，整块板各孔间的荧光信号应保持均匀且稳定。同时，使用集成的384通道移液器同时向每个孔中加入铊离子刺激缓冲液，并继续记录至少两分钟，以捕获铊离子诱导的荧光上升速率和峰值，用于后续离线分析。在接下来的一系列实验中，通过在384孔板的每列和每行每隔一个孔接种对照抑制剂，并在其余孔中加入DMSO作为溶剂对照，来评估该检测方法的均匀性和可重复性。

使用多通道移液器。通过将靶向 KIR 通道的抑制剂以先前确定的浓度（每孔 80 µL，含 0.1% DMSO 载体）加入 384 孔聚丙烯板中，制备化合物 DMSO 板。操作时从 A1 孔开始加入已知抑制剂，随后交替至 B2 孔，依此类推，直至 B24 孔。

从 B1 孔开始，使用 DMSO 重复此操作，依次进行至 A24 孔。现在将细胞板、化合物板和铊刺激板装入酶标仪中。然后设置一个双加样程序，将 20 微升浓度为两倍的化合物系列加入到含有 20 微升 HBSS 检测缓冲液的细胞板对应孔中。

将化合物加入细胞板中，在室温下孵育最多20分钟。记录至少10秒的两个荧光通道的基础荧光值。然后向细胞板的每个孔中加入10微升5倍浓度的铊缓冲液。

在随后的三天内重复该实验，以确定结果的可重复性。利用DMSO处理细胞和药物处理细胞的铊离子通量数据，计算Z'因子（Z prime）值。Z'因子是一种用于评估两组孔间变异性的统计指标，其计算公式基于P组和N组的均值与标准差，其中P代表未抑制的通量值，N代表完全抑制的通量值。

Z'因子值在三个不同日期均大于或等于0.5的实验被认为适用于高通量筛选。这些图示为在不同类型的实验中所使用的细胞铺板布局图示例。未诱导或四环素诱导细胞所在的孔位以不同颜色标示。

该图展示了用于确定检测方法开发和化合物筛选中最佳铊浓度的源板图。颜色梯度代表从100%到0.002%的三倍稀释系列，此处为典型的荧光强度图，颜色由冷色调至暖色调表示铊通量值由低到高。图中所示的细胞铺板图通过四参数逻辑函数拟合铊浓度-反应曲线（CRC），用于确定80%有效浓度（EEC80）为15%的铊。

该图显示了用于测定分析方法中 DMSO 耐受性的源板图。第 1 列和第 24 列仅含有分析缓冲液，而颜色梯度表示从 10% 到 0.01% 的两倍稀释系列，此处还展示了一个代表性荧光强度图，其中较低的铊离子流值以深蓝色表示。此处汇总了从含有指定浓度 DMSO 的孔中记录的平均铊离子流值。

现在此图显示了用于建立已知 KIR 通道抑制剂浓度-反应曲线的源板图。每种化合物用不同颜色表示，通常以三倍稀释系列加样。此处展示了一个代表性的荧光强度图，该图显示了在方法开发和优化后，抑制剂对铊离子流的剂量依赖性抑制作用。

铊通量检测还可用于执行多种常规药理学检测。该检测方法此前已被改进用于电压门控和配体门控钾离子通道、非选择性阳离子通道，甚至钾转运体的研究。请注意，操作铊时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取预防措施，例如佩戴手套并进行适当的废液处理。