人源神经内分泌肿瘤细胞系作为研究人神经内分泌肿瘤治疗的三维模型

以下实验的总体目标是建立一种简便易行的方法，用于生成均匀的三维神经内分泌肿瘤类固醇，并建立一种简单的HistoGel包埋处理方法，以研究这些类固醇的组织学特征。该方法通过在24孔板上均匀涂覆基质胶（aeros），然后接种处于单细胞悬液状态的人类神经内分泌肿瘤细胞来实现。将培养板置于培养箱中，在转速低于40 RPM的轨道摇床上过夜孵育，随后转移至培养箱内稳定的架子上继续培养。

在第三或第四天将形成球状体，通过相差显微镜监测其生长情况和完整性，以研究其组织学特征。将3D类固醇球体置于预热的HistoGel中，随后进行常规石蜡包埋处理，所得结果通过相差显微镜拍摄的图像显示神经内分泌肿瘤3D类固醇球体的生长情况。通过石蜡切片的苏木精-伊红（H&E）染色及免疫组织化学染色对3D类固醇球体的组织学特征进行分析。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于其操作简单、易于实施、结果可靠且成本效益高。该方法有助于快速筛选出针对神经内分泌肿瘤患者的治疗药物，从而推动药物发现领域的研究。通常情况下，初次接触该方法的研究人员在初期至少会面临难以培养出形态均匀、大小一致的三维类器官的困难。

关键在于确保您的24孔板均匀地涂覆了琼脂糖，并且确保单细胞悬液充分分散且浓度准确。为了研究3D类固醇的组织学结构，我们需要进行包埋处理和免疫组织化学染色。3D类固醇的组织学包埋是关键步骤，将在今天稍后演示。为制备用于包被24孔板的1%琼脂糖溶液，取1克琼脂糖加入100毫升去离子水中，置于250至500毫升的瓶中，经高压灭菌以对琼脂糖进行灭菌。

将瓶子放入70摄氏度的水浴中约一小时。为使气溶胶冷却至70摄氏度，必须始终保持气溶胶的无菌状态。在生物安全柜中，使用多通道移液器将200微升气溶胶加入两个24孔板的每孔中。

本实验方案使用平底 24 孔板。只要能在相差显微镜下进行成像，任何类型的平底 24 孔板均可使用。将基质液轻轻旋转混匀，使其均匀覆盖孔底。加入 200 µL 基质液可形成理想的凹面，有利于类球体形成一致的球形结构。

大约10分钟后，喷雾包被的24孔板即可使用。本实验所用的Bon-1细胞为人源胰腺神经内分泌肿瘤（NET）细胞，该细胞系在含10%胎牛血清（FBS）的D-M-E-M-F12培养基中，于37°C、5%二氧化碳的湿润化培养箱内的无菌组织培养皿中维持培养。当单层Bon-1细胞达到70%至80%融合度时，在生物安全柜中制备单细胞悬液。

移除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，加入一毫升胰蛋白酶，37 摄氏度孵育五分钟以使细胞从培养皿上脱落。在显微镜下观察，确认所有细胞均已脱离培养皿，然后加入九毫升生长培养基终止胰蛋白酶消化。

用移液器将眼细胞上下吹打数次，以确保形成均匀的单细胞悬液。使用70微米细胞滤网过滤细胞。细胞计数后收集滤过的细胞，用含10%胎牛血清的D-M-E-M-F12培养基配制成每毫升5,000个细胞的悬液。

接种的细胞数量应根据第6天类球体的大小通过实验确定。理想情况下，类球体的直径应介于300至400纳米之间。因此，我们每孔每200微升接种1000个细胞。

开始此操作时，将200微升单细胞悬液覆盖至预先准备好的24孔板中每个涂有aero的孔上，并用无菌封口膜密封24孔板以防止蒸发。将含有单细胞的aero涂层24孔板置于37°C、含5%二氧化碳的空气湿润培养箱中的轨道摇床上，以极慢的振荡速度过夜培养。次日上午，将培养板转移至稳定平台，并继续在培养箱中培养细胞，每三天一次。

向每孔中加入 200 微升培养基。为避免扰动 phe，将移液枪头接触孔壁，使培养基沿孔壁流下。在显微镜下观察 24 孔板中 OID 的形成。在培养的第 6 天开始对 3D 类固醇进行药物处理。

当类球体直径达到约 300 至 400 微米时，记为给药处理的第零天，给药时间为第六天。每孔培养板中含有约 400 微升培养基，以确保每孔中药物处理的终浓度为 1 倍浓度。为达到每种处理剂量的终浓度，需将药物储备液配制成目标浓度的三倍浓度，取适量药物储备液加入 5 毫升生长培养基中，混匀后置于 15 毫升锥形管中，该体积足够进行八次重复实验。24 孔板每行中的 PHE 分别定义为溶剂对照、剂量 1、2、3、4 和 5。每块 24 孔板上每种处理剂量设有四次重复。

通常，3D 前体细胞（phe）需在至少 2 块 24 孔板中进行处理，以确保每个处理剂量至少有八个重复孔。在向各孔添加处理剂之前，先将 24 孔板离心，以确保封板膜内表面的冷凝水滴因 3D 类固醇的漂浮特性而完全落入孔内。离心后，各孔中的培养基无需移除。

为避免干扰类球体，沿每个孔的孔壁小心加入每种剂量的处理液 200 微升。用封板膜密封 24 孔板，并在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的空气湿润培养箱中孵育培养物。在药物处理后的每个选定时间点，使用相差显微镜监测 3D 类固醇培养物。

使用5倍物镜最为理想，因为使用10倍物镜时类器官会很快超出成像视野。在使用HistoGel包埋前，应在每个时间点对每孔中的类器官采集图像。将来自24孔板的三维类器官收集后，用10%福尔马林固定。

将一管冷的HistoGel放入盛有水的烧杯中。将烧杯放入微波炉加热一分钟，或直至凝胶完全液化。在整个操作过程中，保持该管置于同一盛水的烧杯中。

使用一次性塑料移液管，将所有类固醇转移至活检冷冻模具中。静置类固醇约一分钟，使其沉降至活检冷冻模具底部。

用 Kim 擦拭纸尽量去除活检冷冻模具中的液体。使用牙签非常轻柔地将类固醇推至活检冷冻模具底部的中心位置。接着，用巴氏吸管轻轻操作，使类固醇始终保持在活检冷冻模具的中心位置。

在活检冷冻包埋模具中加入一层温热的 HistoGel，不宜过多，仅需足以将类固醇稳定在中央即可。

将含有类固醇的HistoGel在室温下静置1至2分钟，或直至HistoGel完全凝固。用预热的HistoGel填充活检冷冻模具的剩余部分，并在室温下静置约10分钟使其凝固。在将该OID HistoGel组织块从活检冷冻模具中弹出之前，进行下一步操作。

将冷冻模具置于冰上静置一分钟，然后取出完整的类固醇HistoGel包埋块。用一块生物防护膜包裹包埋块，并将其放入组织与活检盒中。将组织与活检盒存放在装有70%乙醇的容器中。

随后，当在标有气溶胶编码的24孔板上生长时，进行常规的石蜡包埋组织处理程序。不同的NET细胞系表现出不同的形态，如此处所示。人胰腺NET细胞系BON-1和人肺NET细胞系H727形成了三维类器官。

相比之下，qgp one。人胰腺net细胞呈现出大的、葡萄状的多孔团块，这些团块不被视为类器官。在将one细胞接种于基质胶包被的24孔板后，多细胞类器官的形成通常在第三或第四天开始出现，并在第六天时类器官变得更为圆润。

由于营养和氧气的限制，类固醇致密核心中的细胞大约在第10天开始死亡，到第17天时，类固醇开始解体。由于体积较大或在某些情况下坏死核心被排出，类固醇直径通常可生长至1000 µm。

在本实验中，选择第6天的3D类固醇作为使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）进行处理的起始点。此前已有报道指出，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对网状细胞具有抗增殖和促凋亡作用。这些图像记录了3D类固醇在处理开始时以及处理后24、48、72和96小时的形态变化。

V 表示使用溶剂处理，此处为 DMSO。D 一至 D 五表示使用逐渐增加剂量的 TSA 进行处理，剂量大小为每个个体的。OID 由定制开发的 MATLAB 计算机程序自动估算。

在每个时间点，每种 TSA 剂量处理至少测量了八个类球体，并将结果相对于溶剂对照组绘制在本图中。所有 TSA 剂量均对三维类器官表现出一定程度的生长抑制。在 TSA 浓度为 125 纳摩尔和 250 纳摩尔时，三维类固醇的生长受到强烈抑制，以了解净三维类固醇的组织学特征。

对培养17天的3D类固醇进行H和E染色以及免疫组织化学染色。KI 67是增殖细胞的标志物，而cleaved caspase 3是凋亡细胞的标志物。结果表明，3D类固醇外层细胞处于活跃增殖状态，而核心区域的细胞大多为坏死或凋亡状态。

在完成该操作步骤后，可进一步进行其他检测，例如细胞活力发光检测，以评估这些三维类固醇的细胞存活率。该技术建立后，可扩展至96孔板进行高通量筛选，从而促进癌症研究中的治疗药物发现。