Name: 人类神经内分泌肿瘤细胞株为研究人类神经内分泌肿瘤治疗的三维模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 了解利用琼脂糖覆盖层培养人类神经内分泌肿瘤细胞形成三维球状体的方法。该技术通过HistoGel包埋实现组织学分析，为神经内分泌肿瘤药物筛选提供简单可靠的体外模型。

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我们衷心感谢陈文金博士在MATLAB程序方面的帮助，以及新泽西癌症研究所组织病理学设施和显微镜设施的支持。我们还感谢审稿人提出的评论和建议。本研究由雷蒙德和贝弗利·萨克勒研究基金会资助。

1. 1% 琼脂糖包被的 24 孔板的制备
<ol>
 <li>在250-500 ml的瓶中，将1 g琼脂糖（RPI, A20090-500）加入100 ml去离子水中，并在高压灭菌器中进行高压灭菌（121 °C，15 psi，15 min）。将含有已灭菌琼脂糖的瓶子转移至70 °C水浴中。琼脂糖冷却至70 °C时即可使用，此过程约需一小时。务必始终确保琼脂糖处于无菌状态。</li>
 <li>准备24孔平底板（Falcon, 353047）；只要能在相差显微镜下成像，任何品牌的24孔平底板均可使用。</li>
 <li>在生物安全柜中，使用Eppendorf多通道移液器向每孔加入200 μl琼脂糖，并轻轻旋转培养板使琼脂糖均匀覆盖孔底。200 μl琼脂糖可形成适当的凹面结构，有利于类球体形成一致的球形结构。若琼脂糖少于200 μl，可能无法完全覆盖孔底；若超过200 μl，则可能无法形成凹面，导致所形成的类球体形状不规则。</li>
 <li>琼脂糖包被的24孔板约10分钟后即可使用。（可选）在接种细胞前，向每孔加入100 μl培养基，以使琼脂糖与培养基预先平衡。</li>
 <li>或者，在琼脂糖完全凝固后，向每孔加入100 μl生长培养基，并用无菌封板膜（Nunc, 236366）密封。这些培养板可在4 °C保存最多一周。</li>
</ol>
2. 单细胞悬液的制备
<ol>
 <li>所有实验均在生物安全柜中采用标准无菌技术进行，除非另有说明，所有培养物均在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。</li>
 <li>人胰腺神经内分泌肿瘤BON-1细胞在含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen，16000-044）的DMEM/F12培养基（Invitrogen，10565）中，于100 mm × 20 mm无菌组织培养皿（Corning，430167）中维持培养。</li>
 <li>当单层BON-1细胞达到70–80%融合度时，吸除培养基。用PBS洗涤细胞两次，加入1 ml TrypLE（Invitrogen，12604），在37 °C孵育5分钟，使细胞从培养皿上脱落。TrypLE与胰蛋白酶类似，但在15–30 °C以及4 °C下均具有稳定性。在显微镜下观察，确保所有细胞均已从培养皿上脱离。</li>
 <li>向消化后的细胞中加入9 ml生长培养基，并用移液器反复吹打数次，以确保形成均匀的单细胞悬液。</li>
 <li>使用70-μm细胞筛网（Fisher，22363548）过滤细胞。</li>
 <li>收集细胞，并使用Guava PCA-96 Base系统（Millipore）进行细胞计数。</li>
 <li>在含10% FBS的无酚DMEM/F12生长培养基中，制备每毫升5,000个细胞的悬液。</li>
</ol>
3. 类球体培养
<ol>
 <li>将200 μl单细胞悬液覆盖至琼脂糖包被的24孔板中，并用无菌封口膜密封24孔板以防止蒸发。</li>
</ol>
注意：接种的细胞数量应根据第6天类球体的大小通过实验确定；类球体直径在300–400 μm时是开始药物处理的理想尺寸；接种1,000个BON-1和H727细胞。
——我们不建议在第6天之后开始药物处理，因为3D细胞的活力在第10天左右开始下降（数据未显示，论文正在撰写中）。
<ol start="2">
 <li>将上述包被琼脂糖的24孔板（含BON-1细胞）置于轨道摇床上，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中以低于40 rpm的极慢振荡速度过夜培养。随后将这些培养板转移至稳定平台，继续维持细胞培养。</li>
 <li>每隔3天向上述各孔中加入200 μl生长培养基。注意不要扰动类球体结构。加样时应将移液器枪头轻触孔壁，沿孔壁缓慢加入培养基，使其沿壁流入孔内。</li>
 <li>在显微镜下观察24孔板中类球体的形成情况。</li>
</ol>
4. 药物处理
<ol>
 <li>当类球体在第6天直径达到约300-400 μm时，对3D类球体进行药物处理。此时间点记为药物处理的第0天。</li>
 <li>在第6天，每孔培养板中含有约400 μl培养基。为确保每孔中药物处理的终浓度为1x，需将各剂量药物原液在5 ml生长培养基中进行3x系列稀释，稀释液置于15 ml锥形管中，足以满足8个重复实验的需求。</li>
 <li>将24孔板中每行的类球体分为溶剂对照组、剂量1、剂量2、剂量3、剂量4和剂量5组。每块24孔板上每种剂量处理设4个重复（见表1）。我们通常至少使用2块24孔板处理3D类球体，从而使每种剂量处理至少有8个重复。</li>
 <li>将24孔板在4 °C条件下以800 rpm离心5分钟，以确保密封膜上的所有冷凝液滴进入孔内。由于3D类球体具有漂浮特性，不移除各孔中的培养基，以避免干扰类球体。</li>
 <li>沿每孔孔壁小心加入200 μl上述配制好的各剂量处理液。</li>
 <li>用密封膜密封24孔板，并将培养物置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育。</li>
 <li>如有必要，在72-96小时后，用相应剂量的处理液再次对各孔中的类球体进行处理。</li>
</ol>
5. 监测三维球状体培养
<ol>
 <li>在药物处理后的各个选定时间点（0、24、48、72 小时），使用配备 5 倍物镜的蔡司 Axiovert 200/M 倒置相差显微镜，对 24 孔板中每孔的类球体进行成像。</li>
</ol>
注意：可在任何具有校准比例尺的光学显微镜下拍摄图像 μm 以及像素。使用5倍物镜最为理想，因为使用10倍物镜时类球体很快会超出成像视野。
<ol start="2">
 <li>可使用蔡司 AxioVision 4.8.2 软件结合原始图像手动进行类球体分析。</li>
 <li>或者，可使用自行开发的 MATLAB 程序对类球体的大小进行自动或半自动估算。该自动程序采用活动轮廓算法4，在给定图像中精确定位类球体的轮廓，并自动测量其长轴（L）和短轴（W）。同一算法的半自动版本允许用户在存在明显伪影时辅助启动程序。所有图像均需从原始图像导出为 TIFF 或 JPEG 文件格式，以便程序读取。类球体的体积估算公式为 0.5 × L × W2。</li>
</ol>
6. NET 3D 类球体的 HistoGel 包埋
<ol>
 <li>从24孔板中收集10-24个类球体，用PBS洗涤两次，10%福尔马林固定2小时，再分别用50%和70%乙醇各洗涤15分钟两次，即可进行HistoGel包埋。或者，可将类球体保存在4 °C的70%乙醇中数月。</li>
 <li>将一管冷的HistoGel（Thermo Scientific, HG-4000-012）放入盛有水的烧杯中，将烧杯放入微波炉加热1分钟或直至凝胶完全液化，之后始终将其保留在同一盛水烧杯中。</li>
 <li>使用牙签将上述70%乙醇中的类球体转移至活检冷冻模具（Tissue-Tek, Sakura Finetek, 4565）中。确保所有类球体均被转移。静置约1分钟，使类球体沉降至模具底部。用Kimwipes尽量吸除模具中的液体，同时用一次性塑料巴斯德吸管非常轻柔地将类球体推至模具底部中央。此步骤在解剖显微镜下操作可能更为方便。</li>
 <li>向活检冷冻模具中加入一层温热的HistoGel，以固定类球体于模具底部；同时用牙签非常轻柔地保持类球体位于模具底部中央。HistoGel不宜过多，仅需足以稳定类球体即可。</li>
 <li>在室温下静置1-2分钟，或直至HistoGel凝固，然后用温热的HistoGel填充模具其余部分。</li>
 <li>在室温下静置约10分钟，使其完全凝固。</li>
 <li>在将类球体/HistoGel块从活检冷冻模具中取出前，先将其置于4 °C环境中1分钟，有助于完整脱模。随后将类球体/HistoGel块用Bio-wraps（Surgipath, 01090）包裹，并放入组织活检盒（Fisher Scientific, 15-182-701D）中。将活检盒置于含70%乙醇的容器中保存，随后按常规组织处理流程进行石蜡包埋5。</li>
 <li>石蜡块可切成3-μm厚的切片。切片可用苏木精和伊红染色以观察组织学变化，也可用于免疫组织化学染色。</li>
</ol>
7. 典型结果
人胰腺神经内分泌肿瘤细胞系 BON-1（由瑞典乌普萨拉大学 Kjell Oberg 提供给 Verto 研究所）、QGP-1（日本健康科学基金会，大阪，日本）以及人肺神经内分泌肿瘤细胞系 H727（ATCC）在涂有琼脂糖的 24 孔板上培养。如图所示 图1三种细胞系表现出不同的形态。BON-1 和 H727 细胞形成了三维球状体。在显微镜下，H727 细胞形成的球状体比 BON-1 细胞更紧密、更致密。我们推测，H727 细胞具有更强的细胞间黏附能力，因而形成了更紧密的细胞连接。QGP-1 细胞则形成较大的葡萄样多孔状团块，不被视为典型的球状体。由于近年来胰腺神经内分泌肿瘤研究日益受到关注，后续图示均以 BON-1 细胞为例。将 BON-1 细胞接种于琼脂糖包被的 24 孔板后，通常在第 3 天开始形成多细胞球状体rd 或 4th 天，类球体在第6天变得更为圆润th 天。由于营养和氧气的限制，球状体致密核心中的细胞大约在第10天开始死亡，到第17天，由于体积过大或某些情况下坏死核心被排出，球状体开始解体。这些球状体通常可生长至 1,000 μm 直径。 图2 展示了BON-1三维球体形成、生长和解体各阶段的切片。
当类球体直径达到约300–400 μm且细胞保持高存活率时（相关论文正在准备中），开始进行药物处理。选择第6天的3D类球体作为药物处理的起始时间点。已有文献报道，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对神经内分泌肿瘤（NET）细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用6。本研究选用组蛋白去乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA）作为示例，以说明药物处理对3D NET类球体的作用。图3A展示了TSA处理后3D类球体的形态变化。图3B展示了经TSA（Sigma, T8552）处理后3D类球体的体积变化。每个类球体的尺寸由自主开发的MATLAB计算机程序自动估算4，并增加了手动绘图步骤，以辅助识别图像中靠近边缘的类球体。在每个时间点，每种TSA剂量下至少测量8个类球体。每个3D类球体的体积按公式0.5 × 长 × 宽2计算。如图3A和3B所示，与对照组（vehicle）相比，图中所示各剂量TSA均在一定程度上抑制了BON-1 3D类球体的生长。其中，125 nM和250 nM TSA浓度显著抑制了3D类球体的生长，并在96小时时间点导致细胞死亡。
为了了解NET 3D类球体的组织学特征，对培养17天的3D类球体进行了H&amp;E染色和免疫组织化学（IHC）染色。图4A展示了一种用于HistoGel包埋的3D类球体处理方法，这是3D类球体石蜡包埋的关键步骤。图4B显示了培养17天后的3D类球体的H&amp;E染色结果，以及裂解型caspase-3（凋亡细胞标志物）和Ki-67（增殖细胞标志物）抗体的免疫组织化学染色结果。3D类球体核心区域的细胞大多处于坏死/凋亡状态，而外层细胞则处于活跃增殖状态。
<img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig1.jpg" alt="BON-1、H727、QGP-1细胞在三维培养中的类球体图像；生长模式的显微镜分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 神经内分泌肿瘤三维类球体的形态学特征。 三种人源神经内分泌肿瘤细胞系的三维类球体在琼脂糖包被的24孔板上形成。将1,000个BON-1、H727和QGP-1细胞接种于琼脂糖包被的24孔板中，并按照本方案所述的正常生理条件下培养。这些图像为培养10天后的BON-1和H727三维类球体，以及QGP-1细胞聚集体。 
<img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig2.jpg" alt="20天内类球体的形成过程；显微图像显示细胞聚集随时间（小时/天）的进展。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. BON-1 三维类球体的生长追踪。 BON-1 三维类球体的生长追踪：类球体的形成、生长及解体过程。根据实验方案，将1,000个BON-1细胞接种至琼脂糖包被的24孔板中。细胞在含10% FBS的标准DMEM/F12培养基中，于生理条件下在旋转摇床上过夜培养，随后转移至稳定平台并在相同条件下继续培养。通过使用蔡司Axiovert 200/M相衬显微镜配备5倍物镜，于接种后前5小时内每小时成像一次，之后每1至3天成像一次，以追踪三维细胞的生长情况。细胞首先聚集成团，随后形成多细胞聚集体、小类球体、较大类球体，最终类球体发生解体。
<img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig3.jpg" alt="TSA处理对3D球状体的影响；随时间变化的生长图像和体积图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. TSA处理对BON-1 3D球状体的影响。 （A）TSA处理后3D球状体的图像。处理组：V - 对照溶剂（0.0025% DMSO）；D1 - 剂量1（15.625 nM TSA）；D2 - 剂量2（31.25 nM TSA）；D3 - 剂量3（62.5 nM TSA）；D4 - 剂量4（125 nM TSA）；D5 - 剂量5（250 nM TSA）。处理时间点：0 H - 处理开始时的第6天3D球状体时间点；24 H、48 H、72 H和96 H为处理开始后的时间点。每个时间点均如前所述对3D球状体进行成像。（B）TSA处理后3D球状体的生长情况。通过Matlab程序在每个处理时间点（0、24、48、72和96小时）自动估算（A）中3D球状体的长轴（L）和短轴（W）。3D球状体的体积估算公式为0.5 × L × W2。图中球状体的体积为8个重复样本的平均值，误差线基于这8个重复样本计算得出。
<img alt="癌症治疗实验；类球体检测结果；剂量与重复实验对照表；数据分析。" src="/files/ftp_upload/4218/4218table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 药物处理在24孔板上的布局。
<img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4A.jpg" alt="3D 细胞块的 HistoGel 包埋过程；步骤包括温育、转移、凝固和包裹。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4A"> 
图 4A. 3D 类球体 HistoGel 包埋处理方法示意图。 一种用于 3D 类球体 HistoGel 包埋及免疫组织化学染色的方法（A）3D 类球体 HistoGel 包埋处理方法的总体流程。将 3D 类球体包埋于 HistoGel 中，使其处于活检冷冻模具的同一水平位置，随后将 HistoGel/类球体组织块用蓝色 Bio-wraps 包裹，并转移至黄色活检盒中，用于石蜡包埋。
<img src="/files/ftp_upload/4218/4218fig4B.jpg" alt="显微镜下的组织学染色：H&amp;E、Ki-67、Cleaved Caspase-3、细胞增殖分析。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4B"> 
图4B. 第17天3D类球体的H &amp; E染色与免疫组织化学染色。（B）第17天3D类球体的H &amp; E染色、Ki-67和Cleaved Caspase-3免疫组织化学染色。将石蜡包埋切片脱蜡，并使用CCI（Cell Conditioning Solution，Verana Medical System，#711-065-152）进行抗原修复。室温下分别以1:75和1:200的浓度孵育兔多克隆Ki-67抗体（Abcam，#Ab833）和Cleaved Caspase-3抗体（Cell Signaling Technology，#9661），孵育时间为1小时。随后在室温下以1:500浓度加入抗兔二抗（Jackson Immunolab，#711-065-152），孵育1小时，接着使用DABMap显色检测试剂盒（Ventana Medical Systems，#760-124）进行显色。切片经苏木精复染后，从二甲苯中脱水透明，最后封片。

<ol><li>Taal, B. G., Visser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+neuroendocrine+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of neuroendocrine tumours.</a> Neuroendocrinology. 80, 3-7 (2004).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

我们已展示了一种简单、可靠且可重复的方法，利用琼脂糖包被的24孔板从人源神经内分泌肿瘤细胞生成三维多细胞球体。该技术的成功之处在于，从固定数量的细胞开始培养，至第6天即可获得大小均一、形态规则的单个球体。关键步骤是在接种后前16–24小时内对含有NET细胞的培养板进行缓慢振荡。该方法同样适用于常见的人源乳腺癌细胞系MCF-7、人源结肠腺癌细胞系HT-29、人源非小细胞肺癌细胞系H1299以及人源胚胎肾细胞系HEK-293。这些细胞均可形成均一且致密的三维球体，适用于治疗性药物筛选（数据未显示）。尽管已有多种生成三维球体的方法被报道，7-10 此处报道的方法无需使用特殊培养板或试剂，因此操作简便且成本低廉。我们的未发表数据显示，在琼脂糖上培养的NET 3D类球体可模拟 体内 与单层二维细胞相比，NET异种移植瘤在几何结构和分子特征上均表现出相似性，这与利用其他人癌细胞系构建的三维球状体所报道的结果类似。11,12 3D细胞培养模型的局限性在于其无法完全替代测试 体内 任何药物或治疗方案的疗效，因为三维球状体类似于无血管肿瘤，这与 体内 在这方面，该方法将有助于弥合神经内分泌肿瘤治疗药物评估中的差距。 体外 到 体内 在某些方面。
由于悬浮的三维多细胞球体体积较大、几何形状复杂，且受限于共聚焦显微镜的成像能力，对这类多细胞球体进行免疫荧光染色非常困难。本文介绍了一种采用HistoGel包埋并进行石蜡包埋的处理方法，从而实现对三维多细胞球体连续切片的免疫组织化学染色。此外，我们自主开发的MATLAB程序可准确、可重复地估算球体大小，高效监测药物疗效，并可整合到针对神经内分泌肿瘤（NET）患者药物研发的高通量筛选体系中。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>70 µm 细胞滤网</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>无菌封口膜</td><td>Nunc</td><td>236366</td><td></td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A</td><td>Sigma</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-402-12</td><td></td></tr></tbody></table>

人源神经内分泌肿瘤细胞系作为研究人神经内分泌肿瘤治疗的三维模型

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

神经内分泌肿瘤（NETs）是一种罕见肿瘤，发病率为每10万人中2例，&#x200A;每年约有000例个体，占所有人类恶性肿瘤的0.5%。1 除了少数局限性病变患者可通过手术治疗外，系统性治疗几乎无法带来生存获益。因此，迫切需要更深入地理解神经内分泌肿瘤的生物学特性，特别是为不可切除或转移性神经内分泌肿瘤患者确定新的治疗靶点。三维细胞培养因其在模拟肿瘤微环境方面的相关性，正成为一种广受青睐的药物筛选方法。 体内 肿瘤组织结构与微环境2,3 三维多细胞球体相较于直接从二维细胞培养实验过渡到动物（小鼠）模型，能够以更及时且更低成本的方式提供有价值的信息。
为了促进针对NET患者的新疗法的发现，我们已开发出一种 体外 使用人源NET细胞系构建三维多细胞球模型。将NET细胞接种于经非黏附性琼脂糖包被的24孔板中，在生理条件（5% CO₂）下孵育。2，37 °C）下接种后静置培养16-24小时，期间保持极缓慢振荡。细胞从第3天开始形成多细胞球状体rd 或 4th 天。到第6天时，类球体变得更为圆润。th 第几天开始给药。通过相差显微镜观察NET类球体的形态、形状和大小，以评估药物处理的效果。类球体的大小通过自行开发的基于主动轮廓算法的MATLAB程序进行自动估算。此外，我们展示了一种简单的方法，用于对这些三维类球体进行HistoGel包埋处理，从而可应用常规组织学和免疫组织化学技术。 
这是首篇关于利用神经内分泌肿瘤（NET）细胞系生成三维球状体以研究治疗药物效果的报告。我们还对这些三维球状体进行了组织学分析，并展示了单一药物对NET球状体生长和增殖作用的示例。我们的结果表明，NET球状体在NET生物学研究及药物开发的进一步研究中具有重要价值。

我们介绍一种简单的琼脂糖覆盖平台，用于利用神经内分泌癌细胞系培养三维多细胞球体。该方法为研究治疗药物对神经内分泌肿瘤细胞的作用提供了一种非常便捷的途径。同时也有助于我们建立用于癌症治疗的人源神经内分泌肿瘤球体模型。

神经内分泌肿瘤（NETs）是一类罕见肿瘤，年发病率为每年每10万人中2例，占所有人类肿瘤的0.5%……

以下实验的总体目标是建立一种简便易行的方法，用于生成均匀的三维神经内分泌肿瘤类固醇，并建立一种简单的HistoGel包埋处理方法，以研究这些类固醇的组织学特征。该方法通过在24孔板上均匀涂覆基质胶（aeros），然后接种处于单细胞悬液状态的人类神经内分泌肿瘤细胞来实现。将培养板置于培养箱中，在转速低于40 RPM的轨道摇床上过夜孵育，随后转移至培养箱内稳定的架子上继续培养。在第三或第四天将形成球状体，通过相差显微镜监测其生长情况和完整性，以研究其组织学特征。将3D类固醇球体置于预热的HistoGel中，随后进行常规石蜡包埋处理，所得结果通过相差显微镜拍摄的图像显示神经内分泌肿瘤3D类固醇球体的生长情况。通过石蜡切片的苏木精-伊红（H&E）染色及免疫组织化学染色对3D类固醇球体的组织学特征进行分析。与现有方法相比，该技术的主要优势在于其操作简单、易于实施、结果可靠且成本效益高。该方法有助于快速筛选出针对神经内分泌肿瘤患者的治疗药物，从而推动药物发现领域的研究。通常情况下，初次接触该方法的研究人员在初期至少会面临难以培养出形态均匀、大小一致的三维类器官的困难。关键在于确保您的24孔板均匀地涂覆了琼脂糖，并且确保单细胞悬液充分分散且浓度准确。为了研究3D类固醇的组织学结构，我们需要进行包埋处理和免疫组织化学染色。3D类固醇的组织学包埋是关键步骤，将在今天稍后演示。为制备用于包被24孔板的1%琼脂糖溶液，取1克琼脂糖加入100毫升去离子水中，置于250至500毫升的瓶中，经高压灭菌以对琼脂糖进行灭菌。将瓶子放入70摄氏度的水浴中约一小时。为使气溶胶冷却至70摄氏度，必须始终保持气溶胶的无菌状态。在生物安全柜中，使用多通道移液器将200微升气溶胶加入两个24孔板的每孔中。本实验方案使用平底 24 孔板。只要能在相差显微镜下进行成像，任何类型的平底 24 孔板均可使用。将基质液轻轻旋转混匀，使其均匀覆盖孔底。加入 200 µL 基质液可形成理想的凹面，有利于类球体形成一致的球形结构。大约10分钟后，喷雾包被的24孔板即可使用。本实验所用的Bon-1细胞为人源胰腺神经内分泌肿瘤（NET）细胞，该细胞系在含10%胎牛血清（FBS）的D-M-E-M-F12培养基中，于37°C、5%二氧化碳的湿润化培养箱内的无菌组织培养皿中维持培养。当单层Bon-1细胞达到70%至80%融合度时，在生物安全柜中制备单细胞悬液。移除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，加入一毫升胰蛋白酶，37 摄氏度孵育五分钟以使细胞从培养皿上脱落。在显微镜下观察，确认所有细胞均已脱离培养皿，然后加入九毫升生长培养基终止胰蛋白酶消化。用移液器将眼细胞上下吹打数次，以确保形成均匀的单细胞悬液。使用70微米细胞滤网过滤细胞。细胞计数后收集滤过的细胞，用含10%胎牛血清的D-M-E-M-F12培养基配制成每毫升5,000个细胞的悬液。接种的细胞数量应根据第6天类球体的大小通过实验确定。理想情况下，类球体的直径应介于300至400纳米之间。因此，我们每孔每200微升接种1000个细胞。开始此操作时，将200微升单细胞悬液覆盖至预先准备好的24孔板中每个涂有aero的孔上，并用无菌封口膜密封24孔板以防止蒸发。将含有单细胞的aero涂层24孔板置于37°C、含5%二氧化碳的空气湿润培养箱中的轨道摇床上，以极慢的振荡速度过夜培养。次日上午，将培养板转移至稳定平台，并继续在培养箱中培养细胞，每三天一次。向每孔中加入 200 微升培养基。为避免扰动 phe，将移液枪头接触孔壁，使培养基沿孔壁流下。在显微镜下观察 24 孔板中 OID 的形成。在培养的第 6 天开始对 3D 类固醇进行药物处理。当类球体直径达到约 300 至 400 微米时，记为给药处理的第零天，给药时间为第六天。每孔培养板中含有约 400 微升培养基，以确保每孔中药物处理的终浓度为 1 倍浓度。为达到每种处理剂量的终浓度，需将药物储备液配制成目标浓度的三倍浓度，取适量药物储备液加入 5 毫升生长培养基中，混匀后置于 15 毫升锥形管中，该体积足够进行八次重复实验。24 孔板每行中的 PHE 分别定义为溶剂对照、剂量 1、2、3、4 和 5。每块 24 孔板上每种处理剂量设有四次重复。通常，3D 前体细胞（phe）需在至少 2 块 24 孔板中进行处理，以确保每个处理剂量至少有八个重复孔。在向各孔添加处理剂之前，先将 24 孔板离心，以确保封板膜内表面的冷凝水滴因 3D 类固醇的漂浮特性而完全落入孔内。离心后，各孔中的培养基无需移除。为避免干扰类球体，沿每个孔的孔壁小心加入每种剂量的处理液 200 微升。用封板膜密封 24 孔板，并在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的空气湿润培养箱中孵育培养物。在药物处理后的每个选定时间点，使用相差显微镜监测 3D 类固醇培养物。使用5倍物镜最为理想，因为使用10倍物镜时类器官会很快超出成像视野。在使用HistoGel包埋前，应在每个时间点对每孔中的类器官采集图像。将来自24孔板的三维类器官收集后，用10%福尔马林固定。将一管冷的HistoGel放入盛有水的烧杯中。将烧杯放入微波炉加热一分钟，或直至凝胶完全液化。在整个操作过程中，保持该管置于同一盛水的烧杯中。使用一次性塑料移液管，将所有类固醇转移至活检冷冻模具中。静置类固醇约一分钟，使其沉降至活检冷冻模具底部。用 Kim 擦拭纸尽量去除活检冷冻模具中的液体。使用牙签非常轻柔地将类固醇推至活检冷冻模具底部的中心位置。接着，用巴氏吸管轻轻操作，使类固醇始终保持在活检冷冻模具的中心位置。在活检冷冻包埋模具中加入一层温热的 HistoGel，不宜过多，仅需足以将类固醇稳定在中央即可。将含有类固醇的HistoGel在室温下静置1至2分钟，或直至HistoGel完全凝固。用预热的HistoGel填充活检冷冻模具的剩余部分，并在室温下静置约10分钟使其凝固。在将该OID HistoGel组织块从活检冷冻模具中弹出之前，进行下一步操作。将冷冻模具置于冰上静置一分钟，然后取出完整的类固醇HistoGel包埋块。用一块生物防护膜包裹包埋块，并将其放入组织与活检盒中。将组织与活检盒存放在装有70%乙醇的容器中。随后，当在标有气溶胶编码的24孔板上生长时，进行常规的石蜡包埋组织处理程序。不同的NET细胞系表现出不同的形态，如此处所示。人胰腺NET细胞系BON-1和人肺NET细胞系H727形成了三维类器官。相比之下，qgp one。人胰腺net细胞呈现出大的、葡萄状的多孔团块，这些团块不被视为类器官。在将one细胞接种于基质胶包被的24孔板后，多细胞类器官的形成通常在第三或第四天开始出现，并在第六天时类器官变得更为圆润。由于营养和氧气的限制，类固醇致密核心中的细胞大约在第10天开始死亡，到第17天时，类固醇开始解体。由于体积较大或在某些情况下坏死核心被排出，类固醇直径通常可生长至1000 µm。在本实验中，选择第6天的3D类固醇作为使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）进行处理的起始点。此前已有报道指出，组蛋白去乙酰化酶抑制剂对网状细胞具有抗增殖和促凋亡作用。这些图像记录了3D类固醇在处理开始时以及处理后24、48、72和96小时的形态变化。V 表示使用溶剂处理，此处为 DMSO。D 一至 D 五表示使用逐渐增加剂量的 TSA 进行处理，剂量大小为每个个体的。OID 由定制开发的 MATLAB 计算机程序自动估算。在每个时间点，每种 TSA 剂量处理至少测量了八个类球体，并将结果相对于溶剂对照组绘制在本图中。所有 TSA 剂量均对三维类器官表现出一定程度的生长抑制。在 TSA 浓度为 125 纳摩尔和 250 纳摩尔时，三维类固醇的生长受到强烈抑制，以了解净三维类固醇的组织学特征。对培养17天的3D类固醇进行H和E染色以及免疫组织化学染色。KI 67是增殖细胞的标志物，而cleaved caspase 3是凋亡细胞的标志物。结果表明，3D类固醇外层细胞处于活跃增殖状态，而核心区域的细胞大多为坏死或凋亡状态。在完成该操作步骤后，可进一步进行其他检测，例如细胞活力发光检测，以评估这些三维类固醇的细胞存活率。该技术建立后，可扩展至96孔板进行高通量筛选，从而促进癌症研究中的治疗药物发现。

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