Name: piggyBac转座子初级人类T细胞系统改造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学习使用piggyBac转座子系统对初级人类T细胞进行稳定基因改造的非病毒方法。本技术通过核转染实现长期转基因表达，为免疫学研究和T细胞治疗开发提供可靠平台。

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SS 部分得到 TBMM 项目中通过 HHMI 医学转化研究生培训资助的支持。MHW 部分得到美国退伍军人事务部职业发展奖以及 Harold M. Selzman 博士夫妇慷慨支持。本工作还部分得到 NIH 淋巴瘤 SPORE 资助项目 P50CA126752 和 NIH R01 DK093660 的支持。

第0天
1. 从人血液中分离外周血单个核细胞
<ol>
	<li>使用静脉穿刺法将20 ml新鲜人血采集至含钠-肝素的真空采血管中。</li>
	<li>按1:1（v/v）比例混合血液与高级RPMI 1,640培养基。</li>
	<li>向50 ml离心管中加入20 ml淋巴细胞分离液（25 °C）。缓慢将25–30 ml血液-RPMI 1,640混合液叠加于淋巴细胞分离液上方。</li>
	<li>以400 × g离心40分钟，不启用刹车。</li>
	<li>使用一次性移液管收集清晰层及模糊层，并转移至含10 ml 1× PBS（25 °C）的容器中，再用1× PBS补足体积至50 ml。</li>
	<li>以450 × g离心10分钟。</li>
	<li>彻底吸除上清液，加入20 ml高级RPMI 1,640培养基。</li>
	<li>以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入10 ml完全T细胞培养基，并补充5 ng/ml预热至37 °C的重组人IL-15（rhIL-15）。</li>
	<li>计数细胞数量，将细胞以每孔2 × 106个接种于24孔组织培养包被板中，培养基为含5 ng/ml rhIL-15的完全T细胞培养基。在周围孔中加入无菌水。于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育过夜。</li>
</ol>
第1天
2. 使用抗CD28和抗CD3抗体包被培养板以刺激T细胞
<ol>
	<li>将抗CD28和抗CD3抗体分别用无菌水稀释至每种抗体浓度为1 μg/ml。</li>
	<li>向一个未包被的24孔组织培养板中5个已标记的孔内，每孔加入500 μl上述每种抗体溶液。</li>
	<li>向其余孔中加入无菌水。用封口膜包裹培养板，并置于4 °C冰箱中。</li>
</ol>
3. 未刺激T细胞的核转染
<ol>
	<li>将T细胞培养基在37 °C预热，并添加5 ng/ml的rhIL-15。通过将500 μl的核转染补充剂1加入2.25 ml的核转染溶液中，制备完全核转染溶液。</li>
	<li>在1.5 ml微量离心管中分别加入5 μg转座子（Zeo-pT-CMV-eGFP）和转座酶（pCMV-piggyBac）。注意：可能需要优化转座酶和转座子DNA的用量，以实现最佳基因递送效果并最小化细胞毒性。质粒可通过申请向作者索取。</li>
	<li>从24孔组织培养板中收集PBMC至50 ml离心管中，计数细胞数量。保留2 × 106个细胞，用于流式细胞术对照。</li>
	<li>将7–10 × 106个细胞加入15 ml离心管中，以400 × g离心5分钟，吸除上清液后轻弹管底沉淀。</li>
	<li>向松散的细胞沉淀中加入100 μl T细胞完全核转染溶液。</li>
	<li>将溶液-细胞混合物加入含有质粒的离心管中。</li>
	<li>将溶液-细胞-质粒混合物加至核转染杯底部，注意避免产生气泡。</li>
	<li>使用程序U-014（未刺激的人T细胞，<a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a>）进行核转染。</li>
	<li>立即向核转染杯中加入500 μl预热的含rhIL-15的培养基，然后将细胞转移至24孔板的一个孔中，孔中已含有1.5 ml预热的含rhIL-15的培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中过夜培养。</li>
</ol>
第2天
4. T细胞的非特异性刺激
<ol>
	<li>收集细胞并确定细胞数量。保留 0.5 x 106 通过流式细胞术检测细胞，以确定GFP阳性细胞的频率。以未转染的PBMCs作为对照。</li>
	<li>吸弃非组织培养包被板中的CD3/28抗体溶液，每孔用T细胞培养基清洗一次。</li>
	<li>将核转染后的细胞重悬于 0.5 x 106 每毫升完全CTL培养基中加入5 ng/ml rhIL-15，重悬细胞。将转染后的细胞每2.0 ml加入非组织培养板的4个孔中。每孔加入0.5 × 106 非核转染细胞至5th 好。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育3天2.</li>
</ol>
第5天
<ol>
	<li>从未经包被的组织培养板中收集刺激后的T细胞。</li>
	<li>计数细胞，并将细胞重新接种至包被的24孔组织培养板中，密度为0.7 × 106 个细胞/mL，使用含5 ng/mL IL-15的T细胞培养基。</li>
</ol>
第7天
7. 基因表达分析
<ol>
	<li>收集细胞，用抗人CD8抗体（也可使用抗CD3和抗CD4抗体）染色，通过流式细胞术分析GFP表达百分比。</li>
</ol>
第8天（可选）
8. T细胞扩增
<ol>
	<li>转染后第8天，T细胞可重悬于含IL-15的T细胞培养基中，以每孔0.7 × 106个细胞的密度接种，以进行进一步扩增16。</li>
</ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法可实现对原代人T淋巴细胞的稳定转基因修饰。我们此前已测试了该方法的使用 piggyBac 转座子系统用于改造T细胞，使其表达报告基因（超过4周）、非免疫原性自杀基因、用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（超过100天），并赋予其对免疫抑制药物的抗性7,13-15非病毒性T细胞修饰技术用于过继性免疫治疗及其他应用时，成本应远低于逆转录病毒转导，因而有望得到更广泛的应用。新型高活性 piggyBac 增加稳定转基因修饰人T细胞制造的可行性9尽管本文未予详述，但可通过以下组合方法获得足量的稳定转染T细胞，以满足潜在的临床应用需求。 piggyBac-介导的基因转移和aK562（人工抗原呈递）饲养细胞，初始产量约为2 x 106 稳定转染的T细胞可扩增4到5个对数级，达到10以上10 4至5周内转导的T细胞数量达到1012 6至7周内7. 分析 piggyBac 人类T细胞中的整合位点未显示出对原癌基因的偏好性，但在采用上述核转染技术时...

<table><tbody><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5015</td><td></td></tr><tr><td>高级RPMI 1,640</td><td>LifeTechnologies</td><td>12633020</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3008803</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I 补充剂</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素-15重组蛋白</td><td>eBioscience</td><td>14-8159</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>人T细胞核转染试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC</td><td>Southern Biotech</td><td>9536-11</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD3</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养处理板</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24孔非组织培养处理板</td><td>BD Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;完全T细胞培养基成分&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 1x 高级 RPMI 1,640&lt;br/&gt; 5% 热灭活胎牛血清&lt;br/&gt; 2 mM GlutamaxIM-I</td></tr></tbody></table>

piggybac 转座子系统对人原代t细胞的改造

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

的 piggyBac 转座子系统在自然界中具有活性，最初来源于卷心菜夜蛾1,2. 这种非病毒系统基于质粒，最常见的是使用两种质粒，其中一种表达 piggyBac 转座酶以及含有目的基因的转座子质粒，该质粒在反向重复元件之间携带目的基因，这些反向重复元件是基因转移活性所必需的。 PiggyBac 通过“剪切-粘贴”机制介导基因转移，即转座酶将转座子片段整合到目标细胞基因组中。 PiggyBac 在多种昆虫中均表现出高效的基因递送活性1,2哺乳动物3-5以及人类细胞6，包括原代人T细胞7,8. 近期，一种超活性 piggyBac 转座酶的生成提高了基因转移效率9,10.
人类T淋巴细胞在癌症过继性免疫治疗中具有临床研究价值11值得注意的是，首个利用转座子修饰人类T细胞的临床试验 睡美人 转座子系统已获批准12我们先前已评估了其效用 piggyBac 作为一种非病毒性的人类T细胞基因修饰方法。我们发现 piggyBac 高效地对人T细胞进行遗传修饰，以导入报告基因和非免疫原性可诱导自杀基因7基因组整合位点分析显示，其整合过程对已知原癌基因内部或邻近区域并无偏好性13我们使用了 piggyBac 对细胞毒性T淋巴细胞进行基因修饰，使其表达靶向肿瘤抗原HER2的嵌合抗原受体，并发现经基因修饰的T细胞可介导对HER2阳性肿瘤细胞的靶向杀伤 体外 和 体内 在原位小鼠模型中14我们还使用了 piggyBac 生成对雷帕霉素具有抗性的T细胞，这在使用雷帕霉素的癌症治疗中应具有应用价值15.
本文介绍了一种利用piggyBac对原代人T细胞进行遗传修饰的方法。该方法包括从人血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），随后进行T细胞的培养、基因修饰和活化。在本报告中，T细胞被导入一种报告基因（eGFP），以便通过流式细胞术对基因表达进行分析和定量。
PiggyBac 可用于将多种目的基因导入人T细胞中进行修饰。尽管我们已利用piggyBac引导T细胞靶向肿瘤抗原14，但也曾利用piggyBac引入可诱导的安全开关，以便在需要时清除基因修饰的细胞7。由于piggyBac具有较大的载荷容量，还可实现对大型基因的转移，例如耐雷帕霉素的mTOR分子（15 kb）15。因此，本文介绍了一种非病毒性的方法，可用于多种目的的原代人T细胞稳定基因修饰。

示意图展示了利用报告基因（eGFP）对人类T淋巴细胞进行遗传修饰的各个步骤 图1这些质粒可向作者索取。图示展示了利用报告基因（eGFP）进行基因修饰的人T淋巴细胞的步骤。 图2. 为了使T细胞在培养中分裂、扩增和增殖，必须对其进行活化。对经过修饰的人T细胞在培养第1天和第7天通过流式细胞术分析其基因表达。图中显示的是来自一位供体的结果 图3. 细胞经别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD8抗体染色后，使用配备四色荧光滤光片组的FACSCalibur流式细胞仪及CellQuest软件（Becton Dickinson）分析eGFP（转基因）与APC荧光信号。我们此前已观察到CD4和CD8阳性T细胞均发生基因修饰，本文以CD8阳性细胞为例进行展示。7尽管本文仅针对单个转基因表达进行了分析， piggyBac 也已用于人类细胞的多基因（或多重）基因转移17第1天到第7天之间eGFP表达的下降可能是由于并非所有转染的细胞都发生了转座子DNA的稳定整合。
<p class="jov...

我们描述了一种利用非病毒型piggyBac转座子系统将外源基因导入原代人T细胞的遗传修饰方法。通过piggyBac转座子系统修饰的T细胞可实现外源基因的稳定表达。

piggyBac 转座子系统对人原代T细胞的改造

piggyBac 转座子系统是一种天然具有活性的系统，最初来源于卷心菜夜蛾（cabbage looper moth）1,2。该非病毒系统基于质粒，通常……

本实验的总体目标是利用非病毒转座子系统对原代人T细胞进行稳定基因修饰。首先，采集人血液，然后分离外周血单个核细胞，接着使用piggyBac转座子系统和目的转基因（如EGFP）对PBMC进行核转染。随后，刺激T细胞在体外培养中增殖。然后分析T细胞的转基因表达。最终，通过流式细胞术分析证明，利用piggyback转座系统修饰的T细胞可实现转基因的稳定表达。与人T细胞的质粒转染相比，转座子具有将转基因稳定整合以实现长期表达的优势。关键在于遵循一种非常特定的操作流程，在分离P BMCs期间以及核转染后进行处理。我们最初实施该方法是为了构建可表达不同基因的培养人源稳定细胞系。这一方法有助于回答免疫学领域中的关键问题，例如如何修饰T细胞以使其功能更佳。接下来将由我实验室的研究生sunon和saha通过静脉穿刺来演示该实验步骤。采集20毫升新鲜人血至含钠肝素的真空采血管中。将血液与高级RPMI 1640培养基按1:1比例混合。然后向50毫升离心管中加入20毫升淋巴细胞分离液。将25至30毫升稀释后的血液缓慢铺加在淋巴细胞分离液（lympho prep）上层，在400 × g条件下离心40分钟，期间不刹车。将清晰层和模糊层均转移至含有10毫升室温PBS的离心管中，再用PPBS将总体积补至50毫升。然后在450 × g条件下离心10分钟收集细胞，彻底吸除上清液，离心后用20毫升高级RPMI培养基重悬细胞并洗涤一次。将细胞沉淀重悬于10毫升完全T细胞培养基中，该培养基添加了5纳克/毫升重组人IL-15，随后将细胞计数并接种至24孔组织培养包被板中，每孔接种2 × 10⁶个细胞。然后向周围孔中加入无菌水。将P BMCs在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育过夜。用无菌水将抗CD28和抗CD3抗体稀释至浓度为每毫升1微克。将每种抗体溶液各500微升加入一个未包被的24孔细胞培养板中已标记的五个孔内。然后向其余孔中加入无菌水。用封口膜包裹培养板，并置于4摄氏度环境中。将T细胞培养基预热至37摄氏度，并添加5纳克/毫升的重组人IL-15。同时配制新鲜的完全核效应因子溶液。现在，在1.5毫升离心管中分别分装5微克的转座子和转座酶A。可能需要优化转座酶A和转座子DNA的用量以实现最佳基因递送效果。为尽量减少细胞毒性，将24孔组织培养板中的PBM CS收集至50毫升离心管中。细胞计数后，保留2 × 10⁶个P BMCs，用于后续流式细胞术检测时作为对照。接下来，将七百万至一千万个细胞加入一个15毫升离心管中，在400 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，并用手指轻弹沉淀物。向松散的细胞沉淀中加入100 µL T细胞完全核转染溶液。现在将溶液细胞混合物加入质粒中。接着，将溶液细胞质粒混合物加至核酸转染柱的底部。注意不要引入任何气泡。使用程序 U-014 对细胞进行核酸转染。对于未刺激的人T细胞，将细胞转移至含有1.5毫升预温培养基加R-H-I-I-L 15的孔中，在细胞培养箱中对转染后未刺激的T细胞进行过夜孵育。收集细胞后，测定细胞数量，并保留0.5 × 10⁶个未转染的PBMC作为对照，用于流式细胞术检测GFP阳性细胞的频率。随后，从非组织培养包被的培养板中吸除CD3/28抗体溶液，并用T细胞培养基清洗每孔，重悬细胞。将细胞浓度调整为每毫升0.5 × 10⁶个细胞。在完全CTL培养基中加入5纳克/毫升的重组人IL-15，每孔加入2.0毫升，将上述细胞分别接种于非组织培养板的四个孔中。向第五孔中加入0.5 × 10⁶个非核转染的细胞。将培养板置于37°C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育三天。第五天，从未经包被的组织培养板中收获经刺激的T细胞。随后将细胞接种于24孔包被的组织培养板中，密度为每毫升0.7 × 10⁶个细胞，培养基为含有5 ng/mL IL-15的T细胞培养基。收获细胞后，通过免疫染色检测CD8、CD3或CD4，以分析GFP表达百分比；若需要扩增T细胞，则使用流式细胞术分析细胞样本。然后在第8天，将转染后的细胞以每孔0.7 × 10⁶个细胞的密度接种到含有IL-15的T细胞培养基中，用于通过piggyBac介导的人T细胞基因修饰。原代人源细胞被转染两种质粒。转座子质粒在CMV启动子驱动下组成型表达piggyBac蛋白。转座子质粒包含GFP报告基因以及基因转移所需的piggyBac反向重复序列。可通过流式细胞术分析piggyBac转座子系统修饰的T细胞中稳定的GFP转基因表达。此处，细胞在第1天用PC偶联的抗CD8抗体染色，并检测EGFP和APC荧光。在CD8阳性细胞中，76.4%可检测到EGFP表达。从第1天到第7天EGFP表达量的下降，可能是由于并非所有转染细胞都实现了转座子DNA的稳定整合。现在您应该已较好地掌握了如何分离PBMC以及进行稳定基因转染的方法。使用piggyback转座系统对它们进行修饰。进行静脉采血时切勿忘记采用无菌技术。操作应迅速，以保持细胞活性。完成此操作后，可进一步开展其他方法，例如T细胞细胞毒性检测，以确定T细胞的抗原特异性。未来的实验将探索利用转座子进行基于T细胞的癌症及小鼠免疫治疗。

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

piggyBac转座子初级人类T细胞系统改造

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

PiggyBac 转座子介导的人类iPSC基因编辑：利用PiggyBac转座子系统在人类iPSC中整合目的基因的实验方案

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping...

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

本研究中，我们利用非病毒型转座子系统，从小鼠羊水细胞生成诱导性多能干细胞。...

利用转座子系统从小鼠羊水细胞生成多能干细胞

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一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

我们概述了一项为期9天的实验方案，用于转导并扩增恒河猴外周血单个核细胞，可获得数量充足、目的基因共表达效果优良的细胞，适用于细胞疗效输注研究。...

九天内实现原代T细胞的转导与扩增并维持中央记忆表型

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

基于电穿孔技术利用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行遗传修饰

本文介绍了一种从多种哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、猪和牛）中分离并转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的实验方案。该方法非常适用于在多种实验条件下开展眼部基因治疗的研究，可用于可转化至人类的离体 分析以及 在体研究。...

分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗

利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera...

高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

学习使用piggyBac转座子系统对初级人类T细胞进行稳定基因改造的非病毒方法。本技术通过核转染实现长期转基因表达，为免疫学研究和T细胞治疗开发提供可靠平台。

piggyBac 转座子系统对人原代T细胞的改造

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