围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞
2012年11月25日
该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。
第一步是使用采血套装组装装置。从这段8厘米长的无菌导管上截取一根25又四分之三规格的针头。使用鲁尔锁接头，可购买直径为100微米的玻璃毛细管针头，或使用Sutter P-97拉针仪自行制备，然后吸取无菌生理盐水以填充导管内的死腔。
将一根玻璃毛细管连接到无菌塑料管的末端，通过针头推出少量生理盐水，以确保连接正确且无泄漏。在显微镜下观察，查看所施加的压力以及液体从细尖端喷出的速率，我们将使用有色溶液来代表病毒载体或干细胞。将此装置置于无菌培养皿中，先抽吸一些空气，然后吸入注射溶液。
为了我们的实验目的，我们使用了 P5 小鼠。在这张图片中，您可以看到吻部。眼睛的位置被眼睑覆盖。
虚线显示将要进行切口的睑缘和重睑线。使用直的万氏剪刀沿闭合的眼睑做1.5毫米的切口。用裂隙压迫镊子分开眼睑，并将眼球轻压突出，使睑缘略位于眼球后方。
进行巩膜切口时，必须能够识别几个解剖标志。角膜与巩膜交界处由角膜缘标记。在巩膜内侧，依次为视网膜色素上皮层、视网膜，然后是玻璃体。对于色素较深的动物，可在眼球赤道部或后部中点处，使用15度显微手术刀划擦表面以定位切口位置。
在切口处将可见到一块深棕色的色素组织。如果切口位置过于深入，你会看到液体流出，这代表已经触及玻璃体，说明切口过深。
穿过RPE视网膜。此切口可用于玻璃体内注射。现在，使用你自己的动物模型。
此时切口已完成。额外的切口和划痕将释放玻璃体，以便进行视网膜下注射，目的是将微毛细玻璃管插入视网膜下腔，即位于视网膜与视网膜色素上皮（RPE）之间。如果切口过深，则针头可能穿过视网膜进入玻璃体。应将针头平行于眼球外壁插入。
进入视网膜下腔。对推动杆施加轻柔压力，开始注入液体。如果针头位置正确，会感受到适度的回弹阻力，并在视网膜下腔形成视网膜下隆起（BLE）。
如果针头位于玻璃体内，则回流压力会明显减小。为避免明显的反流，在拔出针头前应将注射器活塞保持原位额外15秒，以使眼内压力稳定。
使用弯头敷料镊子轻柔地将眼球推回眼睑后方至眼眶内。这是另一例子，显示视网膜下注射时染料填充了视网膜下腔，在白化动物中清晰可见。气液界面的弯月面可帮助您观察到注射结束的时刻。
在色素较深的眼睛中进行液体注射略具挑战性。仔细插入针头可获得良好的效果。
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概述
该手术技术展示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。该过程涉及精确递送治疗剂的装置的精细组装。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因治疗
- 干细胞研究
- 眼科学
背景
- 基因治疗旨在通过将遗传物质导入细胞来治疗或预防疾病。
- 干细胞具有再生受损组织的潜力。
- 视网膜下腔是眼部干预的关键区域。
- 小鼠模型在视觉研究的临床前研究中被广泛使用。
研究目的
- 演示一种用于递送基因治疗载体的外科手术技术。
- 探索干细胞在治疗视网膜疾病中的潜力。
- 优化眼部精确注射的方法。
使用的方法
- 从采血套装组装装置。
- 制备用于注射的玻璃毛细管针头。
- 吸取无菌生理盐水以填充装置。
- 在操作过程中使用有色溶液代表病毒载体或干细胞。
主要结果
- 该装置可实现对视网膜下腔的可控注射。
- 在显微镜下成功观察到液体的排出。
- 展示了该技术在基因治疗应用中的可行性。
- 对未来视网膜疾病治疗具有潜在意义。
结论
- 该技术为基因治疗递送提供了一种可靠的方法。
- 尚需进一步研究以评估长期疗效。
- 它为视网膜疾病创新治疗开辟了新途径。
常见问题
行业重要性概述
该手术技术可实现将基因治疗载体和干细胞精确递送至围产期小鼠眼球的视网膜下腔，有助于眼病治疗手段的临床前验证。通过最大限度减少组织损伤并确保靶向准确性，该方法提高了视网膜疾病模型早期发现工作流程的可重复性。该技术为治疗候选物的评估提供了一个可扩展的平台，可在推进至大型动物研究或IND申报前研究之前进行验证。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在与疾病相关的视网膜微环境中对基因治疗载体进行功能验证。
- 操作价值：通过确认药物递送至目标视网膜细胞层，支持靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过可视化视网膜下腔内泡状结构的形成，定量评估载体或细胞的分布情况。
- 操作价值：标准化注射参数，确保在不同研究队列中化合物或细胞给药的可重复性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过允许对围产期模型中的移植或表达进行纵向评估，有助于实现机制性风险降低。
- 操作价值：支持关键的临床前安全性和有效性特征分析所需的剂量-反应测试。
流程与工作流整合
该方法可整合到从靶点验证、先导物筛选到临床前评价的整个发现流程中，尤其适用于眼基因和细胞治疗领域。
- 发现生物学： 在视网膜微环境中验证关于载体趋向性、启动子活性或干细胞植入效果的假设。
- 筛选： 递送标准化体积的治疗剂，以实现候选物质的比较性筛选。
- 分析： 提供可视化和空间读数（例如水疱大小、荧光信号），用于量化递送效果。
- 转化研究： 通过在生理相关的新生小鼠眼球模型中验证递送效果，连接基础发现与临床前研究。
- 企业级复用： 建立可重复使用的手术平台，用于对多种载体或细胞系进行迭代测试。
运营与企业影响
- 科学价值：通过确认递送剂的亚细胞定位，提高对靶点结合的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化设备组装和注射技术，增强实验可重复性。
- 战略价值：通过在体内实现早期功能验证，减少生物学风险评估所需时间。
- 项目影响：基于递送效率和组织完整性的量化指标，支持决策推进或终止项目。
实施注意事项
- 需要具备显微外科专业技术以及对新生小鼠眼部解剖结构的熟悉。
- 依赖于精密仪器，包括显微外科刀片、镊子和玻璃毛细管制备工具。
- 需要进行标准化培训，以最大限度减少不同操作者在切口深度和针头定位上的差异。
- 在应用于不同小鼠品系时，必须考虑因色素沉着差异导致的可视化困难。
- 该技术受限于避免玻璃体穿刺并确保视网膜下注射到位所需的技术熟练度。
