Name: STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 학습하세요 말초 혈액에서 STEMCCA 렌티바이러스 벡터를 이용한 인간 유도 만능 줄기 세포 생성 방법을. 이 효율적인 재프로그래밍 프로토콜은 줄기세포 연구와 재생의학 응용에 활용됩니다.

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이러한 연구 GJM와 GM에 대한 NIH UO1HL107443-01 상에 의해 부분적으로 기금을했다.

1. 말초 혈 Mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연 및 확장 DAY 0 <ol><li> 나트륨 시트르산과 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브에 말초 혈 4 ML을 그립니다. 관에게 8-10 번 반전하고 실온에서 30 분에 1,800 XG에 원심 분리기. 이상적으로,이 단계는 컬렉션의 2 시간 이내에 완료해야합니다. </li><li> 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 버피 코트 (겔 장벽과 플라즈마 사이의 세포 층)을 pipetting하여 mononuclear 세포 (MCS)를 수집합니다. 15 분 300 XG에 여러 시간과 원심 분리기 반전, 멸균 인산 버퍼 생리 (PBS)로 10 ML에 총 볼륨을 가져와. </li><li> 멸균 PBS의 10 ML에있는 세포를 Resuspend과 셀 카운트를 수행합니다. 10 분 300 XG에서 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 1 2x10 6 세포를 전송합니다. </li><li> 확장 매체 2 ML (EM) (에서 세포를 Resuspend 50 μg / ML Asco을 포함 QBSF-60 줄기 세포 중rbic 산성, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL-3, 2 U / ML EPO는 40 NG / ML IGF-1, 1 μM의 Dexamethasone 및 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성)과에 이전 일 잘 12 잘 접시의. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양. </li><li> 300 x에 남아있는 세포를 원심 분리기 10 % DMSO를 포함하는 FBS에서 10 분, 동결 ~ 2x10 6 셀 / 유리 병에 g. </li><li> 냉동 PBMCs를 사용하여 프로토콜을 시작하려면 10 분 300 XG에 QBSF 매체와 원심 분리기 10 ML로 세포의 1 병을 해동. EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 판 중 하나를 잘에 전송할 수 있습니다. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양. </li></ol> DAY 3 DAY 6 <ol start="17"><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어. </li><li> 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend하고 12의 잘 하나 전송- 잘 판. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양. </li></ol> 2. STEMCCA Lentivirus과 PBMCs의 전달 9 일 <ol><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어. </li><li> 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 5 μg / polybrene 및 STEMCCA lentivirus의 ML을 포함하는 신선한 EM의 1 ML에있는 세포를 Resuspend (전부다 = 1 10)과 12 잘 접시의 잘 하나 전송됩니다. (lentiviral 입자의 생산을 설명하는 프로토콜은에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ) </li><li> 90 분에 25 ° C에서 2,250 rpm으로 판을 봐. </li><li> 스핀 후, 신선한 EM의 추가 한 ML을 추가 매체 2 ML의 총 5 μg / polybrene의 ML을 포함하고 37 ° C에서 판을 품다,5% CO 2 인큐베이터. </li></ol> 10 일 <ol start="16"><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어. </li><li> 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 접시의 한 우물 전송할 수 있습니다. 5% CO 2 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양. </li></ol> 3. 도금은 MEFs에 셀을 Transduced DAY 11 <ol><li> 코트 2x10 5 세포에서 0.1 % 젤라틴과 판 inactivated 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs)와 / 잘 MEF 매체 (IMDM 10 % FBS, 1 % 비 필수 아미노산을 포함, 100 μM의 β-에서 6 잘 접시의 우물 메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민, 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성). 감염 당 3 우물을 준비합니다. </li></ol> 하루에 12 <ol start="2"><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송<html> 그리고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻는다. </li><li> 10 NG / ML bFGF와 아스코르브 산 및 EM에 사용되는 것과 동일한 농도의 성장 요소를 포함하는 MEF 매체의 3 ML에있는 세포를 Resuspend 중간 (50 μg / ML 아스코르브 산, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL -3, 2 U / ML EPO, 40 NG / ML IGF-1, 1 μM Dexamethasone). </li><li> 플레이트 (1) 세포의 ML 당 잘 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의. / 잘 매체의 2.​​5 ML의 총 bFGF, 아스코르브 산, 및 성장 요인과 MEF 미디어의 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 25 500 rpm으로 판을 돌려 ° C를 30 분에. 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 판을 품다. </li></ol> DAY 14 <ol start="6"><li> 10 NG / ML bFGF와 50 μg / ML 아스코르브 산 (NO 성장 요소)를 포함 MEF 미디어 2.5 ML로 피드 전지는 매일. 기음과 각 피드와 부동 셀을 폐기합니다. </li><li> 로 (보통 일주일에 한 번) 필요한 추가 MEFs을 추가합니다. </li></ol>P &quot;&gt; ~ DAY 20 <ol start="8"><li> 일단 작은 식민지 피드 세포는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 매체 (DMEM/F12가 포함 된 20 %의 넉 아웃 세럼 교체, 1 % 비 필수 아미노산, 100 μM의 β-메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민 2 ML과 매일 표시 , 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성, 10 NG / ML bFGF). </li></ol> 4. 따기 및 iPSC 클론의 확장 ~ DAY 30-40 <ol><li> 12 잘 판 inactivated MEFs가 / 잘 hESC 매체 1 ML 플러스 Stemolecule Y27632 (ROCK 저해제) 10 μM을 포함하는으로 미리 놓는의 개별 우물에 각 식민지를 선택합니다. </li><li> 만 hESC 매체 (NO ROCK 억제제) 1 ML과 이후 매일 세포를 피드. </li></ol> 5. Pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 착색 <ol><li> 착색은 Millipore에서 키트 &#39;ES 세포 마커 샘플 키트 &quot;를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. </li></ol> 6. Integ의 절단정격 STEMCCA 벡터 <ol><li> 카세트를 재 프로그램의 절단은 Cre-IRES-Puro 표현 벡터에 따라 transfection 및 6에 설명 된대로 간단한 Puromycin 선택을 활용 이루어집니다. </li></ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 여기에서 갓 수집 말초 혈의 몇 밀리리터 격리 mononuclear 세포에서 인간 iPSCs를 생성하는 STEMCCA lentiviral 벡터의 사용을 설명합니다. 프로토콜은 먼 위치에서 획득 한 기증자 세포를 활용하면 냉동 PBMCs (버피 코트에서 직접 취득), 상당한 실질적인 의미의 상세를 재설정하는 데 사용할 수 있습니다. 재 프로그램의 유도하기 전에, 절연 PBMCs는 핵 재활 더받을 수있는 세포의 건강한 proliferating 인구를 렌더링 중요한 확장 단계를 받아야합니다. 이것은 쉽게 조혈 문화 조건에서 확장시 세포의 클러스터 &#39;포도 같은의 무리&#39;의 존재에 의해 관찰된다. 이하 5x10 5 세포 transduced 때, 세포는 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의 하나 또는 두 개의 우물에 도금 할 수 있습니다. 우리는 25일 후 전달에 몇 가지 경우에 hESC 같은 식민지를 관찰하는 데 필요한 시간에 몇 가지 변화를 경험하고 있습니다.ROCK 억제제의 사용은 새로운 iPSC...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과 </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 줄기 세포 중 </td><td> 품질 생물 </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12,440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> 넉 아웃 세럼 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> 개미-PM-2 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 / 패 혈성 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,140 </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅토 에탄올 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> 아스 코르 비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> 시그마 </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> 시그마 </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES 세포 마커 샘플 키트 </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

stemcca lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

네 전사 인자, Oct4, Klf4의 이소성 표현을 통해 Sox2와 cMyc는 인간의 체세포의 세포는 소위 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) 1-4 발생 만능 상태로 변환 할 수 있습니다. 환자 별 iPSCs는 배아 줄기 세포 (ESCs)를 둘러싸고 가능한 면역 거부를 무시할 것이다 윤리적 문제를 부족합니다. 따라서, iPSCs는 질병 모델링 연구, 약리 화합물의 심사 및 재생 치료 5에 대한 상당한 주목을 받고있다. 우리는 야마나카의 요인 6 인코딩 한 excisable polycistronic lentiviral의 줄기 세포 카세트 (STEMCCA)를 사용하여 서로 다른 폐 질환 환자에서 transgene 무료 인간 iPSCs의 생성을 보여 주었다. 이 iPSC 라인은 피부 섬유 아세포, 재 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 세​​포 유형에서 생성되었습니다. 일반적으로 섬유 아세포를 취득하면 세포의 확장에 의한 펀치 생검은 다음 피부가 필요합니다몇 구절에 대한 문화에 s입니다. 중요한 것은 그룹의 수는 iPSCs 7-9으로 인간의 말초 혈액 세포의 재 프로그래밍을보고했습니다. 한 연구에서, STEMCCA 벡터의 Tet의 inducible 버전은 혈액 세포가 동시에 반대 테트라 사이클린 transactivator 인코딩 constitutively 활성화 lentivirus에 감염 될 필요하는 9 고용되었다. 섬유 아세포는 대조적으로, 말초 혈 세포는 크게 환자의 불편 함과 고통을 감소 최소한 침략 절차를 통해 수령하실 수 있습니다. 제정 한 excisable 벡터를 사용하여 혈액 세포를 재 프로그램에 대한 간단하고 효과적인 프로토콜은 광범위한 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 응용을 촉진 할 수 있습니다. 또한, 주변 혈액 세포의 재 프로그래밍 피부 biopsies을 피할 수 (예. 탈선은 흉터) 또는 인해 기존의 질병 상태 preventi에해야하는 개인의 iPSCs의 생성을 허용펀치 biopsies에 NG 액세스 할 수 있습니다. 여기 constitutively 4 요소를 표현하는 하나의 floxed - excisable lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)에서 인간 iPSCs의 생성을위한 프로토콜을 보여줍니다. 갓 수집하거나 해동 PBMCs은 STEMCCA의 lentivirus와 transduced되기 전에 같은 매체를 포함하는 아스코르브 산에 10,11 설명 구일, SCF, IGF-1, IL-3와 EPO에 대해 확장됩니다. 셀은 다음 MEFs에 도금되어 있으며 ESC와 같은 식민지 두 주 감염 후 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 선택한 클론을 확장하고 pluripotency 마커 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 표현으로 테스트됩니다. 이 프로토콜은 혈액의 쉽게 접근 할 4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법론을 제공, 간단한 튼튼하고 매우 일치합니다.

우리는 하나의 lentiviral 벡터를 사용하여 PBMCs에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 그림 1A는 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 피가 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과로 수집하고 있으며, 원심 분리 후, mononuclear 세포는 폴리 에스터 젤과 플라즈마 (버피 코트) (그림 1b) 사이의 인터페이스에서 수령하실 수 있습니다. 절연 PBMCs 그 다음 구일에 대한 문화에 확장됩니다. 그림 2는 세포가 현저하게 나누어하는 보여주는 일 0 일 9시 PBMCs를 비교합니다. STEMCCA의 lentivirus와 약 10-15일 후 전달은 작은 밝은 식민지의 모습은 여전히​​ 정의되지 않은 식민지의 형태로, 관찰된다. hESC 매체의 추가 후, hESC 같은 식민지 쉽게 (그림 2D) 식별 할 수 있습니다. 이러한 식민지의 일부는 기...

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

네 가지 전사 인자인 Oct4, Klf4, Sox2 및 cMyc의 이소성 발현을 통해 인간 체세포를 다능성 상태로 전환할 수 있으며, ...

본 프로토콜은 4 mL의 말초혈액으로부터 인간 유도만능줄기세포를 효율적으로 생성하는 방법을 보여줍니다. 0일 차에 말초혈액 샘플에서 단핵세포를 분리하고 배양합니다. 리프로그래밍 stem co 벡터를 사용하여 일차 세포를 형질도입합니다.9일째에, 형질도입된 세포를 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포 위에 플레이팅하고 약 3주 동안 배양합니다. 확장 및 특성 분석을 위해 HESC 유사 콜로니를 분리합니다. SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81과 같은 다능성 마커의 발현에 대한 면역형광 염색 결과입니다.유도 인간 다능성 줄기세포의 효율적인 생성 방법을 시연합니다. 인간 유도 다능성 줄기세포를 생성하기 위해 줄기세포 항바이러스 벡터를 사용하는 방식은 기존의 다른 방법들에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 아마도 가장 매력적인 점은 접근 방식의 전반적인 단순함일 것입니다. 이는 공여 조직에 대한 쉬운 접근이 필요하며, 여기서 말하는 조직이란 쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액의 외래 성분을 의미합니다.이 방법의 가장 중요한 속성은 리프로그래밍의 효율성과 획득한 IPS 세포 클론의 품질입니다. 절차 시연은 저희 실험실의 박사후 연구원인 Andrea January Summer와 George Murphy 실험실의 대학원생인 Sarah Rozelle이 맡아 진행하며, 모든 과정은 0일 차에 이루어집니다.시트르산 나트륨이 포함된 vacutainer 세포 준비 튜브에 말초 혈액 4 mL를 채취합니다. 채혈 후 2시간 이내에 튜브를 8~10회 반전 혼합합니다. 단핵구를 수집하기 위해 상온에서 1,800 G로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.혈장(plasma)을 흡입하여 제거하고, 겔 장벽과 혈장 사이에 형성된 세포층인 버피 코트(buffy coat)를 피펫으로 분취합니다. 버피 코트를 멸균된 15 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮기고, 멸균된 PBS를 추가하여 총 부피를 10 milliliters로 맞춥니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준 후, 300 G에서 15분 동안 원심분리합니다.세포 펠렛을 10 milliliters의 멸균 PBS에 재부유시켜 세포 수를 측정한 후, 1~2 × 10⁶개의 세포를 멸균된 15 milliliter 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 수확하고 펠렛을 2 milliliters의 확장 배지에 재부유시킵니다. 그런 다음 분리된 단핵구를 12 Well 플레이트의 한

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

우리는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제안합니다. 원심분리를 통해 형질도입된 혈액 세포를 매트릭스 코팅된 플레이트에 도금함으로써 부유 세포에서 iPSC를 성공적으로 유도할 수 있습니다. 이 기술은 PBMC 및 CBMC와 같은 셀에 대한 간단하고 효과적인 재프로그래밍 프로토콜을 제안합니다.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

학습하세요 말초 혈액에서 STEMCCA 렌티바이러스 벡터를 이용한 인간 유도 만능 줄기 세포 생성 방법을. 이 효율적인 재프로그래밍 프로토콜은 줄기세포 연구와 재생의학 응용에 활용됩니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

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