使用酶促细胞融合检测法分析SNARE介导的膜融合

本实验的总体目标是通过β-半乳糖苷酶的激活表达来定量检测由SNARE介导的细胞融合事件。首先在COS-7细胞表面异位表达v-和t-SNARE蛋白，以实现这一目标。实验的下一步是将表达v-SNARE蛋白的细胞与表达t-SNARE蛋白的细胞混合。

这会导致SNARE介导的细胞融合以及β-半乳糖苷酶的激活表达。最终，通过分光光度计检测细胞融合所诱导的β-半乳糖苷酶活性。该技术相较于现有方法（如显微镜下SAL区域检测法）的主要优势在于，能够分析多种SNARE组合。

从定量角度来看，尽管该方法可用于理解由SNARE介导的膜融合机制及其调控过程，也可用于高通量研究。演示该实验流程的将是来自我实验室的博士后Doc Na Hassan以及技术员David Humphrey。该操作在转染前一天进行加样。

在24孔板中，每个孔放置直径为12毫米的玻璃盖玻片，为实验中每种表达不同质粒的细胞组合准备两个孔。每孔接种30,000个COS-7细胞，细胞培养于添加了4.5克/升葡萄糖和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中用于转染。向每孔加入0.25微克TTA质粒和一组表达质粒。

本实验中，将目的翻转蛋白（flipped proteins of interest）转染至T细胞，具体操作为：加入0.25微克编码TRE缺失Z的质粒，以及一组编码目的翻转蛋白的互补质粒。本例中包括snap 25、syntaxin 1和syntaxin 4。随后，按照制造商说明书，使用lipectomy试剂对cost 7细胞进行转染，并将细胞培养24小时。转染24小时后，用添加了补剂的多聚甲醛固定细胞10分钟。固定完成后，用PBS++缓冲液洗涤细胞三次，每次一次，共三次，然后用添加了补剂的FBS封闭细胞30分钟。

封闭后，用抗 mic 单克隆抗体在室温下孵育细胞，9E10 抗体孵育 30 分钟，随后用 PBS++ 洗涤四次。再加入稀释比例为 1:500 的 FITC 标记的二抗，孵育 1 小时。再次用 PBS++ 洗涤四次后，将标记的细胞置于市售的抗荧光淬灭封片剂中封片。

细胞现已准备好进行共聚焦显微镜观察。转染前一天，将120万个COS-7细胞接种至每个100毫米组织培养皿中，或将20万个COS-7细胞接种至6孔板的每个孔中，每种质粒组合均需设置。接种后，将细胞培养24小时。次日，向细胞中加入质粒进行转染。对于V细胞，向每个100毫米培养皿中的细胞转染表达目标翻转蛋白的质粒以及5微克的pTet-Off质粒。

在100毫米培养皿中，用空载体与P te以与V细胞相同的相对浓度共转染对照细胞。在将所有质粒加入V细胞和对照细胞后，向这些孔中加入衣霉素（tcom mycin），以抑制vamps的N-糖基化。在6孔板的每孔中，将1微克PBIG质粒与表达目的蛋白的互补质粒共同转染至T细胞中。

按照制造商的说明，用脂质体转染试剂对共培养的七种细胞进行转染。转染后继续培养细胞24小时。转染24小时后，使用无酶细胞解离缓冲液将V细胞从培养皿中分离。首先用20毫升PBS洗涤细胞一次。

然后加入 5 mL 无酶解离缓冲液。在室温下孵育 10 分钟后，通过轻轻敲击培养板使细胞脱落，并在显微镜下检查细胞是否已脱离。如果脱离的细胞少于一半，则再等待 5 分钟，并再次敲击培养板。

在解离缓冲液中继续孵育，直至超过一半的细胞脱落。然后使用血细胞计数板对V细胞进行计数。接着将V细胞重悬于添加了补充物的Heis缓冲液DMEM中，细胞浓度约为480,000个细胞/毫升。

现在向每个含有T细胞的孔中加入1毫升重悬的V细胞，并将培养板放回培养箱中。在细胞共培养6小时、12小时或24小时后，用PBS洗涤细胞，然后加入裂解缓冲液。接着，将细胞从孔中刮下并转移至离心管中进行离心。

离心后，将上清液转移至新管中，并根据制造商提供的说明书，使用 commercially available assay 检测 β-半乳糖苷酶的表达水平；在该实验方案中，务必在90分钟后加入1 M碳酸钠以终止霍乱毒素反应，从而对结果进行评分。使用分光光度计在420纳米处测定吸光度。当CO7细胞转染了翻转的snare质粒后，翻转的snare蛋白在细胞表面表达。

采用流式细胞术检测细胞表面snare蛋白的表达水平。为了比较不同vamp蛋白的膜融合能力，需要使其表达水平保持一致。因此，对转染过程中使用的每种翻转snare质粒的浓度进行了滴定，并优化了转染条件。

在这些条件下，细胞表面分别以相同水平表达了 vamp 1、3、4、5、7 和 8 以及 syntaxin 1 和 4；利用介导突触胞吐作用的神经元 SNARE 蛋白来测试该检测方法的可行性。事实上，当表达 vamp 2 的 V 细胞与表达 SYNTAXIN 1 和 SNAP 25 的 T 细胞混合时，检测到强烈的 β-半乳糖苷酶表达。然而，当 vamp 2 或 SNAP 25 任一蛋白未表达时，仅检测到基础水平的 β-半乳糖苷酶活性，表明细胞融合及 β-半乳糖苷酶的表达总体上依赖于 v-SNARE 与 t-SNARE 的相互作用。其中，SYNTAXIN 1、SNAP 25、vamp 1、vamp 3 和 vamp 8 表现出相当且最高的融合活性。

相比之下，基础水平的β-半乳糖苷酶（beta GAL）活性表明，该蛋白组合不会驱动膜融合，这与VAMP5和STX1（SYNTAXIN 1）/SNAP-25之间的融合情况不同。在进行酶促融合实验时，务必注意加入衣霉素（unicamycin）以防止Esna蛋白的糖基化，同时加入DTT以防止Esna蛋白之间形成二硫键。

观看本视频后，您应能充分理解如何进行细胞融合实验。