SNARE蛋白介导的膜融合酶的细胞融合含量的分析
2012年10月19日
我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。
该程序的总体目标是通过 β 半乳糖的激活表达来量化圈套器介导的细胞融合事件。这是通过首先在 cost 7 细胞的表面异位表达 v 和 t 圈套蛋白来实现的。该程序的下一步是将表达 V 圈套蛋白的细胞与表达 T 圈套蛋白的细胞混合。
这导致圈套器介导的细胞融合和 β 半乳糖的激活表达。最终，使用分光光度计测量细胞融合诱导的 β 半乳糖活性。该技术或现有方法（如显微 SAL 区域测定）的主要优点是它可以分析多种圈套组合。
定量上，尽管这种方法可用于了解圈套器介导的膜融合的机制和调节。它也可以应用于吞吐量研究。演示该程序的博士后 Na Hassan 博士和我实验室的技术员 David Humphrey 在转染负荷的前一天。
带有 12 毫米玻璃盖玻片的 24 孔板为实验中表达独特质粒的每种细胞组合准备两个孔，这些盖玻片上。30， 000 颗种子需要 7 个在 DMEM 中培养的细胞，并补充 4.5 克/升葡萄糖和 10% FBS 进行转染。V 细胞向每个细胞中添加四分之一微克的 TTA 质粒和一组质粒表达。
在这种情况下，目标翻转蛋白翻转鞋面以转染 T 细胞，添加四分之一微克编码 TRE 缺乏 Z 的质粒，以及编码目标翻转蛋白的互补质粒集。在这种情况下，捕捉 25 个 syntaxin 1 和 syntaxin 4。现在根据制造商的说明用脂质切除术转染成本 7 并培养，细胞 24 小时，转染后 24 小时将细胞固定在补充的对甲醛中固定 10 分钟固定后，用 PBS plus plus 冲洗细胞 3 次，然后用补充的 FBS 封闭细胞 30 分钟。
封闭后，将细胞与抗 mic 单克隆抗体一起孵育。9 E 10 30 分钟，用 PBS plus plus 洗涤 4 次后，将细胞与 1 至 500 稀释度的 fitzy 偶联二抗孵育 1 小时。用 PBS plus plus 再洗涤四次后，将标记的细胞封片在市售的抗淬灭试剂中。
细胞现在已准备好在转染种子前一天进行共聚焦显微镜检查：对于每个待分析的质粒组合，120 万个细胞在每个 100 毫米组织培养皿中花费 7 个细胞，200， 000 个细胞在 6 个孔板的每个孔中花费 7 个细胞。准备一个，将细胞充分培养 24 小时。第二天，加入用于 V 细胞转染的质粒，转染表达目标翻转蛋白的质粒，并在每 100 毫米培养物中向细胞中转染 5 μg p tet。
Dish cot 在 100 mm 培养皿中用空载体转染对照细胞，并以与 V 细胞相同的相对浓度进行 P 脱除。将所有质粒添加到 V 细胞和对照细胞中后，将 tcom 霉素添加到这些孔中以防止鞋面的 N 糖基化。在 6 个孔板的每个孔中，用 1 μg PBIG 和表达目标蛋白的互补质粒转染 T 细胞。
现在根据制造商的说明，用 lip 转染成本 7 个细胞。然后培养细胞 24 小时，转染后 24 小时，用无酶细胞解离缓冲液将 V 细胞从培养皿中分离。首先用 20 毫升 PBS 洗涤细胞一次。
然后加入 5 毫升无酶解离缓冲液。在室温下孵育 10 分钟后，通过猛烈敲击板检查细胞是否在显微镜下脱落，细胞会脱落。如果分离的细胞少于一半，请再等待 5 分钟，然后再次敲击板。
在分离缓冲液中继续孵育，直到超过一半的细胞分离。然后用血细胞计数器计数 V 细胞。然后在补充的 heis 缓冲液 DMEM 中以每毫升约 480， 000 个细胞的浓度复苏 V 细胞。
现在向每个含有 T 细胞的孔中加入 1 毫升重悬的 V 细胞，并将板放回培养箱中。共培养细胞 6 小时、12 小时或 24 小时后，用 PBS 洗涤细胞并加入裂解缓冲液。接下来，从孔中刮下细胞并将它们转移到试管中进行离心。
离心后，将上清液转移到新试管中，并根据制造商在该实验步骤中的说明使用市售检测法测量 β 半乳糖的表达，确保在 90 分钟后通过添加 1 摩尔碳酸钠来停止霍乱公测反应对结果进行评分。在分光光度计上测量 420 纳米处的吸光度。当用翻转的圈套质粒转染 CO 7 细胞时，翻转的圈套蛋白在细胞表面表达。
流式细胞术检测细胞表面圈套蛋白的表达水平。为了比较它们的膜融合能力，鞋面需要在同一水平上表达。因此，对转染中使用的每个翻转的圈套质粒的浓度进行滴定并针对转染进行优化。
在此条件下，鞋面 1 、 3 、 4 、 5 、 7 和 8 以及 突触融合素 1 和 4 分别在细胞表面表达在同一水平，介导突触胞吐作用的神经元圈套用于测试该测定的可行性。事实上，当表达 vamp 2 的 V 细胞和表达 SYNTAXIN one snap 25 的 T 细胞结合时，检测到稳健的 β 半乳糖表达。然而，当鞋面 2 或 SNAP 25 未表达时，仅检测到基线 β 半乳糖酶活性，表明细胞融合和 β 半乳糖酶的表达依赖于 v 和 t 圈套的相互作用总体 SYNTAXIN 1、SNAP 25、鞋面 1、鞋面 3 和鞋面 8 具有相当且最高的融合活性。
相比之下，基线 β GAL 活性表明蛋白质组合不会驱动膜融合，例如鞋面 5 和 SYNTAXIN 1 之间的情况。捕捉 25.在进行酶融合测定时，重要的是要记住添加 unica mycin 以防止 esna 蛋白的糖基化，并添加 DTT 以防止 esna 蛋白之间形成二硫键。
观看此视频后，您应该对如何进行细胞融合分析有很好的了解。
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概览
本研究介绍了一种细胞融合测定法，通过激活β-半乳糖苷酶的表达来定量SNARE介导的膜融合事件。该方法允许分析多种SNARE组合，比现有技术具有显著优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 膜动力学
- 生化测定法
背景
- SNARE蛋白在膜融合中起着关键作用。
- 传统的膜融合研究方法存在局限性。
- 定量融合事件可以增强对细胞过程的理解。
- β-半乳糖苷酶作为融合活动的可靠报告器。
研究目的
- 开发一种新型测定法来定量SNARE介导的细胞融合。
- 使分析各种SNARE蛋白组合成为可能。
- 改进现有的膜融合事件研究方法。
使用的方法
- 在cost seven细胞中表达V和T SNARE蛋白。
- 组合表达不同SNARE蛋白的细胞。
- 诱导膜融合和β-半乳糖苷酶表达。
- 使用分光光度计测量β-半乳糖苷酶活性。
主要结果
- 成功定量SNARE介导的融合事件。
- 展示了分析多种SNARE组合的能力。
- 提供了一种测量融合活性的可靠方法。
- 显示比传统显微镜测定法具有优势。
结论
- 开发的测定法对研究SNARE介导的融合有效。
- 它为分析膜动力学提供了一种多功能方法。
- 该方法可以促进细胞生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This enzymatic cell fusion assay enables quantitative analysis of SNARE-mediated membrane fusion, supporting target validation in vesicle trafficking pathways. By converting microscopic fusion events into a spectrophotometric readout, the method provides scalable, reproducible data for mechanistic de-risking of fusion-related targets. The approach enhances predictive confidence in early discovery by allowing systematic comparison of v- and t-SNARE interactions across multiple combinations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing sufficiency of SNARE proteins to drive cellular membrane fusion.
- Operational Value: Enables functional validation of v-SNARE candidates (VAMPs 1,3,4,5,7,8) against standardized t-SNARE partners (syntaxin 1,4, SNAP-25).
- Scientific Value: Supports biological de-risking through quantitative comparison of fusion capacities under controlled expression levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (flipped SNARE-expressing COS-7 cells) for downstream compound screening against fusion inhibitors.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs (β-galactosidase activity at 420 nm) enabling assay reproducibility across SNARE combinations.
- Scientific Value: Facilitates high-throughput analysis of vesicle trafficking targets through multiplexable fusion readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling neuronal SNARE complexes (VAMP2/syntaxin 1/SNAP-25) implicated in synaptic exocytosis disorders.
- Operational Value: Provides translational continuity from discovery through preclinical validation via conserved SNARE mechanism quantification.
- Scientific Value: Enables mechanism-based go/no-go decisions by distinguishing fusion-competent (VAMP1,3,4,5,7,8/syntaxin 1,4) from non-fusion pairs (VAMP5/syntaxin 1).
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative fusion data that informs prioritization of vesicle trafficking modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of SNARE sufficiency in membrane fusion and pathway clarification of vesicle docking mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell preparation and reproducible spectrophotometric quantification of fusion events.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (β-galactosidase activity) enabling comparison of fusion kinetics across SNARE isoforms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating fusion activity in disease-relevant neuronal SNARE complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for systematic evaluation of SNARE-targeting compounds across multiple vesicle trafficking pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in SNARE-dependent fusion processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled expression of flipped SNAREs and normalized β-galactosidase readouts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative fusion thresholds for prioritizing vesicle trafficking targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions through comparative analysis of SNARE combination fusion efficiencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular transfection, cell culture, and spectrophotometric assay optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy setup for initial SNARE expression validation and cell dissociation equipment for co-culture preparation.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid titration protocols to ensure equivalent SNARE surface expression across conditions.
- Involves adaptation considerations for non-neuronal SNARE pairs requiring optimization of co-culture duration and lysis timing.
- Practical limitations include dependence on efficient cell fusion for signal generation and requirement for transcriptional reporter functionality in hybrid cells.
