Name: SNARE蛋白介导的膜融合酶的细胞融合含量的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学习使用β-半乳糖苷酶报告基因定量分析SNARE蛋白介导的细胞膜融合事件。该方法可在COS-7细胞中分析多种SNARE组合，为研究膜融合机制提供可靠的定量工具。

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本研究由路易斯维尔大学的启动资金以及美国国立卫生研究院（NIH）授予 C.H. 的项目 CA135123 资助。

1. 细胞培养与转染
<ol>
 <li>COS-7 细胞在添加了 4.5 g/l 葡萄糖和 10% 胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。</li>
 <li>质粒转染使用 Lipofectamine 按照制造商说明（Invitrogen）进行。</li>
</ol>
2. 细胞表面SNARE表达的荧光显微镜分析
<ol>
 <li>转染前一天，将 3×104 个 COS-7 细胞接种于 24 孔板中的无菌 12 mm 玻璃盖玻片（Fisher Scientific）上。</li>
 <li>对于每孔中的 v-细胞，将编码 tTA 的质粒（pTet-Off，CLONTECH）0.25 μg 与表达翻转 VAMPs 的质粒各 0.25 μg 共同转染。</li>
 <li>对于每孔中的 t-细胞，将编码 TRE-LacZ 的质粒（pBI-G，CLONTECH）0.25 μg 与表达翻转 SNAP-25 及 syntaxin 1 或 4 的质粒各 0.25 μg 共同转染。</li>
 <li>转染后 24 小时，用含 0.1 g/l CaCl2 和 0.1 g/l MgCl2 的 PBS++ 缓冲液配制的 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，随后在含 10% FBS 的 PBS++ 中封闭 30 分钟。</li>
 <li>细胞与抗-Myc 单克隆抗体 9E10（未稀释的杂交瘤培养上清）在室温孵育 1.5 小时。</li>
 <li>用 PBS++ 洗涤四次后，细胞与 FITC 标记的二抗（Jackson Immunoresearch Laboratories）按 1:500 稀释度孵育 1 小时。</li>
 <li>再用 PBS++ 洗涤四次后，将标记的细胞用 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen）封片。</li>
 <li>在 Olympus 激光扫描共聚焦显微镜上采集共聚焦图像，并使用 Adobe Photoshop 软件处理图像。</li>
</ol>
3. 细胞表面SNARE表达的流式细胞分析
<ol>
 <li>转染前一天，将 2×105 个 COS-7 细胞接种至 6 孔板的每个孔中。</li>
 <li>转染翻转 SNARE、pTet-Off 和 pBI-G 质粒 24 小时后，用含 1% 多聚甲醛的 PBS++ 固定细胞 15 分钟，随后在含 10% 胎牛血清（FBS）的 PBS++ 中封闭 15 分钟。</li>
 <li>细胞与抗 Myc 单克隆抗体 9E10 在室温下孵育 60 分钟。</li>
 <li>用 PBS++ 洗涤三次后，细胞与 FITC 标记的二抗（1:200 稀释）在室温下避光孵育 45 分钟。</li>
 <li>再次用 PBS++ 洗涤三次后，使用细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。</li>
 <li>使用 BD Biosciences 的 FACSCalibur 流式细胞仪分析 15,000 个细胞，通过 CellQuest Pro 软件获取各样本的平均荧光强度。</li>
</ol>
4. 酶法细胞融合实验
<ol>
 <li>转染前一天，将 1.2×106 个 COS-7 细胞接种至每个 100-mm 组织培养皿中，将 2×105 个 COS-7 细胞接种至 6 孔板的每孔中。</li>
 <li>对于 v-细胞，将 0.5 - 5 μg 的翻转型 VAMP 质粒与 5 μg 的 pTet-Off 共同转染至每个 100-mm 培养皿中的细胞中。对照细胞则共转染空载体 pcDNA3.1(+) 和 pTet-Off。为防止 VAMP 1、4、5、7 和 8 的 N-糖基化，在转染期间于细胞培养基中加入衣霉素（10 μg/ml）。</li>
 <li>对于 6 孔板每孔中的 t-细胞，将 1 μg 的翻转型 SNAP-25 质粒和 pBI-G 与 0.5 μg 的翻转型 syntaxin1 质粒或 0.05 μg 的翻转型 syntaxin4 质粒共转染。</li>
 <li>转染后 24 小时，使用无酶细胞解离缓冲液（Invitrogen）将 v-细胞从培养皿中解离下来。用血细胞计数板计数后，将细胞重悬于含 10% FBS、6.7 μg/ml 衣霉素和 0.67 mM DTT 的 HEPES 缓冲 DMEM 培养基中。</li>
 <li>将 4.8×105 个重悬的 v-细胞加入已含有 t-细胞的每孔中。</li>
 <li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6、12 或 24 小时后，按照生产商说明书（Promega）使用含报告裂解缓冲液的 β-半乳糖苷酶酶检测试剂盒检测 β-半乳糖苷酶的表达。简言之，细胞用 PBS 洗涤两次，然后用报告裂解缓冲液裂解。细胞裂解液与等体积的检测 2× 缓冲液混合。以报告裂解缓冲液与检测 2× 缓冲液混合液作为空白对照。</li>
 <li>90 分钟后，加入 1 M 碳酸钠终止比色反应。</li>
 <li>使用 HITACHI 100-40 分光光度计在 420 nm 处测定吸光度。</li>
</ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

最初的细胞融合实验6通过荧光显微镜检测SNARE介导的细胞融合事件。本文中，我们描述了一种创新性实验方法，通过β-半乳糖苷酶的激活表达及分光光度测定来定量分析SNARE介导的细胞融合事件。利用该方法，我们通常可在单次实验中分析15至20种v-和t-SNARE组合。通过流式细胞术检测细胞表面SNARE的表达水平，我们对VAMP蛋白的表达量进行滴定，并比较其膜融合能力（图2和图4）。此外，利用酶学细胞融合实验，我们确定了细胞融合活性对细胞表面VAMP1蛋白密度的依赖性，并观察到VAMP1蛋白在细胞融合反应中无协同效应8，表明多个SNARE复合物无需协同作用即可完成细胞膜融合。
SNARE 蛋白中存在推测的 N-糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）。由于 N-糖基化会抑制翻转 SNARE 蛋白的融合活性6，已有两种方法被用于防止翻转 SNARE 蛋白的糖基化。第一种方法是在翻转 SNARE 构建体中引入糖基化位点突变6；第二种方法如本实验方案所述，在细胞融合反应中加入 N-糖基化抑制剂衣霉素（6....

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>COS-7 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>衣霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-5MG</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off</td><td>Clontech</td><td>K1620-A</td><td></td></tr><tr><td>pBI-G</td><td>Clontech</td><td>6150-1</td><td></td></tr><tr><td>脂质体转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18324-012</td><td></td></tr><tr><td>无酶细胞解离液</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 TET 抑制蛋白多克隆抗体</td><td>Millipore</td><td>AB3541</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记的驴抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-半乳糖苷酶酶学检测系统（含报告基因裂解缓冲液）</td><td>Promega</td><td>E2000</td><td></td></tr><tr><td>Model 100-40 紫外-可见分光光度计</td><td>Hitachi</td><td>C740843</td><td></td></tr></tbody></table>

使用酶促细胞融合检测法分析snare介导的膜融合

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

囊泡上的SNARE（soluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子attachment蛋白receptor）蛋白（v-SNARE）与靶膜上的SNARE蛋白（t-SNARE）之间的相互作用可催化细胞内囊泡融合1-4。重建实验对于解析SNARE介导的膜融合机制及其调控至关重要5。在细胞融合实验6,7中，SNARE蛋白在细胞表面异位表达。这些“翻转”的SNARE蛋白可驱动细胞间融合，证明SNARE足以介导细胞膜融合。由于细胞融合实验依赖显微镜分析，因此在定量分析多个v-SNARE和t-SNARE相互作用时效率较低。
本文介绍一种新的检测方法8，该方法通过激活β-半乳糖苷酶的表达来定量SNARE介导的细胞融合事件。该检测利用Tet-Off基因表达系统9的两个组分作为报告系统：四环素控制的转录激活因子（tTA）和一个在四环素反应元件控制下编码LacZ基因的报告质粒（TRE-LacZ）。我们将tTA转染至在细胞表面表达外翻v-SNARE蛋白的COS-7细胞（v细胞），并将TRE-LacZ转染至在细胞表面表达外翻t-SNARE蛋白的COS-7细胞（t细胞）。v细胞与t细胞之间依赖SNARE的融合导致tTA与TRE结合，从而启动LacZ的转录并表达β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶的活性通过分光光度法在420 nm处测定吸光度进行定量。
囊泡相关膜蛋白（VAMPs）是存在于多种高尔基体后囊泡区室中的v-SNAREs10-15。通过在相同表达水平下表达VAMP1、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7和VAMP8，我们利用酶法细胞融合实验比较它们的膜融合活性。该实验基于光谱测量，为分析SNARE介导的膜融合以及高通量研究提供了一种定量方法。

为了建立定量的细胞融合检测方法，我们利用了tTA与TRE结合后产生的强效转录激活作用。在缺乏tTA时，TRE-LacZ中的LacZ基因转录处于沉默状态；当存在tTA时，它会结合到TRE上并激活LacZ基因的转录。图1展示了该酶法细胞融合检测的流程图。将tTA转染至表达v-SNARE蛋白的v细胞表面，将TRE-LacZ转染至表达t-SNARE蛋白的t细胞表面。v细胞与t细胞发生融合后，tTA即可结合TRE，从而启动LacZ的转录激活，并表达β-半乳糖苷酶。
图2A 展示了翻转SNARE构建体的结构域。催乳素前体信号序列与SNARE的N端融合。这些经改造的SNARE被称为“翻转SNARE”，因为其SNARE基序相对于细胞膜的方向发生了翻转。当用翻转SNARE质粒转染COS-7细胞时，翻转SNARE蛋白在细胞表面表达图2B）。流式细胞术用于检测SNARE蛋白在细胞表面的表达水平（图2...

我们开发了一种细胞融合检测方法，通过β-半乳糖苷酶的激活表达来定量SNARE介导的膜融合事件。

使用酶促细胞融合检测法分析SNARE介导的膜融合

SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白在囊泡（v-SNAREs）与靶膜上的相互作用……

本实验的总体目标是通过β-半乳糖苷酶的激活表达来定量检测由SNARE介导的细胞融合事件。首先在COS-7细胞表面异位表达v-和t-SNARE蛋白，以实现这一目标。实验的下一步是将表达v-SNARE蛋白的细胞与表达t-SNARE蛋白的细胞混合。这会导致SNARE介导的细胞融合以及β-半乳糖苷酶的激活表达。最终，通过分光光度计检测细胞融合所诱导的β-半乳糖苷酶活性。该技术相较于现有方法（如显微镜下SAL区域检测法）的主要优势在于，能够分析多种SNARE组合。从定量角度来看，尽管该方法可用于理解由SNARE介导的膜融合机制及其调控过程，也可用于高通量研究。演示该实验流程的将是来自我实验室的博士后Doc Na Hassan以及技术员David Humphrey。该操作在转染前一天进行加样。在24孔板中，每个孔放置直径为12毫米的玻璃盖玻片，为实验中每种表达不同质粒的细胞组合准备两个孔。每孔接种30,000个COS-7细胞，细胞培养于添加了4.5克/升葡萄糖和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中用于转染。向每孔加入0.25微克TTA质粒和一组表达质粒。本实验中，将目的翻转蛋白（flipped proteins of interest）转染至T细胞，具体操作为：加入0.25微克编码TRE缺失Z的质粒，以及一组编码目的翻转蛋白的互补质粒。本例中包括snap 25、syntaxin 1和syntaxin 4。随后，按照制造商说明书，使用lipectomy试剂对cost 7细胞进行转染，并将细胞培养24小时。转染24小时后，用添加了补剂的多聚甲醛固定细胞10分钟。固定完成后，用PBS++缓冲液洗涤细胞三次，每次一次，共三次，然后用添加了补剂的FBS封闭细胞30分钟。封闭后，用抗 mic 单克隆抗体在室温下孵育细胞，9E10 抗体孵育 30 分钟，随后用 PBS++ 洗涤四次。再加入稀释比例为 1:500 的 FITC 标记的二抗，孵育 1 小时。再次用 PBS++ 洗涤四次后，将标记的细胞置于市售的抗荧光淬灭封片剂中封片。细胞现已准备好进行共聚焦显微镜观察。转染前一天，将120万个COS-7细胞接种至每个100毫米组织培养皿中，或将20万个COS-7细胞接种至6孔板的每个孔中，每种质粒组合均需设置。接种后，将细胞培养24小时。次日，向细胞中加入质粒进行转染。对于V细胞，向每个100毫米培养皿中的细胞转染表达目标翻转蛋白的质粒以及5微克的pTet-Off质粒。在100毫米培养皿中，用空载体与P te以与V细胞相同的相对浓度共转染对照细胞。在将所有质粒加入V细胞和对照细胞后，向这些孔中加入衣霉素（tcom mycin），以抑制vamps的N-糖基化。在6孔板的每孔中，将1微克PBIG质粒与表达目的蛋白的互补质粒共同转染至T细胞中。按照制造商的说明，用脂质体转染试剂对共培养的

analysis-snare-mediated-membrane-fusion-using-an-enzymatic-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

本文介绍了近期开发的一种蛋白酶检测平台的详细操作流程，该平台利用固定在镍-氮川三乙酸磁性琼脂糖珠表面的N端六组氨酸/麦芽糖结合蛋白与荧光蛋白融合的重组底物进行检测。同时，还介绍了对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的检测样品进行凝胶内分析的方法。...

利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

生物膜融合由特化的融合蛋白催化。通过脂质混合实验可测定蛋白质的促融合特性。本文介绍了一种方法，用于纯化重组果蝇atlastin蛋白（一种介导内质网同型融合的蛋白），将其重组到预先形成的脂质体中，并检测其融合能力。...

去垢剂辅助的重组膜蛋白重构 果蝇 用于脂质混合实验的Atlastin蛋白脂质体重组

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。...

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

学习使用β-半乳糖苷酶报告基因定量分析SNARE蛋白介导的细胞膜融合事件。该方法可在COS-7细胞中分析多种SNARE组合，为研究膜融合机制提供可靠的定量工具。

使用酶促细胞融合检测法分析SNARE介导的膜融合

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