Name: 在活体成像系统（IVIS）的神经侵入性脑炎病毒的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用活体成像系统检测中枢神经系统病毒感染的方法。该技术利用生物发光实时追踪病毒入侵过程，为疫苗和抗病毒药物研发提供更准确的疾病模型。

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德克萨斯大学医学分部转化科学研究所获得美国国立卫生研究院资助（项目编号：1UL1RR029876-01），以及Alisha Prather在本稿件视频编辑方面提供的协助。

1. 动物准备
<ol>
 <li>动物接收：动物到达动物生物安全二级（ABSL2）设施后，应至少给予2天时间以适应新环境。此休息期结束后，检查动物的健康状况及整体外观。
 <ol>
 <li>当使用荧光报告基因时，重要的是将所有实验动物置于无苜蓿饮食中，以减少胃肠道自发荧光和背景信号。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>剃除动物毛发：为了在成像过程中提高颅部区域检测到的生物发光信号，需剃除所有动物头部的毛发。使用氧气与气化异氟烷混合气体对动物进行麻醉。待动物完全麻醉后，使用电动剪毛器剃除其头部毛发。剃毛完成后，将动物放回笼中，并观察其完全从麻醉效应中恢复。</li>
 <li>生物医学数据系统（BMDS）应答器植入（在小鼠剃毛后、处于完全麻醉状态下进行）：为实现微创体温监测，将预先编程的BMDS无线应答器皮下植入每只小鼠的背部区域。这些应答器可实现无线识别和体温记录。植入应答器后，对伤口使用兽用级组织粘合剂。</li>
 <li>基线数据采集：感染前，记录所有动物的基础体温和体重。在小鼠处于麻醉状态时，通过眶后（RO）采血获取血液样本，用于蚀斑减少中和试验（PRNT）分析。采血后，涂抹兽用抗生素眼膏以降低潜在的继发性细菌感染风险。基线数据采集应考虑因对小鼠造成应激而限制麻醉次数。后续的眶后采血应在成像过程中、小鼠仍处于麻醉状态时完成。单次眶后采血量最大应约为200 μl。</li>
 <li>感染操作：按照前述方法对小鼠实施麻醉。通过鼻内途径接种，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）将TC83-Luciferase病毒稀释至总体积40 μl，接种剂量为5×106 至 5×107 pfu。感染完成后，将小鼠放回饲养笼中，并观察其恢复情况。</li>
</ol>
2. 动物成像
免责声明：始终将小鼠置于其饲养单元、生物安全柜（BSC）或XIC密闭箱内。本方案批准使用的生物安全柜为II级B1型或B2型。 
<ol>
 <li>按每克体重10 μl的剂量，腹腔注射（IP）浓度为15 mg/ml的荧光素酶底物（luciferin）至所有动物。
 <ol>
 <li>根据分组情况，对接受Ampligen处理的小鼠在感染后-4小时或+48小时，以12.5 mg/kg体重的剂量进行腹腔注射。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在注射荧光素酶底物前，将小鼠每三只一组分开，以确保其能合适地放入XIC-3隔离箱中。
 <ol>
 <li>在所有成像过程中，使用眼部软膏/润滑剂，防止角膜在操作期间干燥。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>打开LivingImage软件并点击Initialize以准备成像箱；设置自动保存，曝光时间设为自动（曝光时间自动是LivingImage软件3.2及更高版本的新功能），视野设为C，滤光片设为开放状态；视野的选择应基于成像小鼠的数量；滤光片可根据其他成像项目的需要进行优化调整。</li>
 <li>确认活性炭空气过滤器未过期，氧气瓶已充满，异氟烷储液罐已加满。在XIC-3隔离箱内贴上小条电工胶带，有助于减少成像期间动物的移动。</li>
 <li>按照第2.1节所述方法对小鼠进行腹腔注射荧光素酶底物，并将其放入异氟烷诱导室（打开盖子）中3-5分钟。</li>
 <li>5分钟后，关闭诱导室盖子并启动异氟烷气流。麻醉气体浓度维持在约3-5%，氧气流速设定为约2.0 L/min。待小鼠完全失去意识后，再等待30秒，然后将其转移至XIC-3隔离箱。确保所使用的生物安全柜能够安全回收异氟烷，因为此过程会导致异氟烷从诱导室逸出（IVIS设备自带被动式过滤罐，XIC-3隔离箱可直接连接进出气接口，以确保麻醉气体的密闭循环）。
 <ol>
 <li>根据芯片/组编号将小鼠转移至已连接并打开异氟烷接口的XIC-3隔离箱中。将小鼠以胸卧位平放，头部轻轻置于胶带条上。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>用乙醇擦拭XIC隔离箱表面，双手和XIC-3底部喷洒Cavicide消毒剂，然后将隔离箱转移至IVIS成像室。进入成像装置后，重新连接麻醉系统至隔离箱。</li>
 <li>在注射荧光素酶底物后10分钟，通过LivingImage软件对小鼠进行成像。</li>
 <li>在完成开放滤光片的初步成像后，使用序列分析和Image Wizard设置，启动针对萤火虫荧光素酶的DLIT三维成像。该成像过程需时4-5分钟，应根据所需成像的小鼠数量选择合适的视野。
 <ol>
 <li>在解剖并取出脑组织后，可进行ex-vivo分析。将脑组织置于无菌培养皿中，在其表面滴加50-100 μl的荧光素酶底物原液，然后放入成像箱中进行成像。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在DLIT成像完成后，于感染后15-17分钟获取第二次开放滤光片的成像图像。确保关闭序列分析功能，并将视野和滤光片设置恢复至先前状态。</li>
</ol>
3. 小鼠归巢与数据分析
<ol>
 <li>关闭异氟烷蒸发器，并将 XIC 隔离箱转移回生物安全柜中。</li>
 <li>将小鼠放回其饲养盒内，盖上盖子，用适当的消毒剂喷洒外部，然后放回饲养架上。
 <ol>
 <li>确保小鼠已从麻醉状态完全恢复。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>根据实验需要重复上述操作，直至成像完成。</li>
 <li>对生物安全柜进行消毒，关闭设备，并将所有数据转移至外部实验室位置以进行进一步分析。</li>
 <li>分析数据，并利用 LivingImage 软件根据 IVIS 结果生成三维图像。
 <ol>
 <li>确保图像方向正确，并设置光照/色彩平衡。在工具面板中，选项包括图像调整、校正、图像信息和 ROI 工具。</li>
 <li>使用 ROI 形状根据位置识别特定信号强度。</li>
 <li>重建表面拓扑结构以突出小鼠身体，初始化 3D DLIT 重建，并使用线性拟合将器官图谱与拓扑重建对齐。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>可通过采集血液和器官完成进一步的病毒滴度分析。本研究中的滴定是通过在改良伊格尔培养基（MEM）中匀浆脑组织完成的。匀浆液进行系列稀释后，感染 6 孔板中的 Vero 细胞 1 小时。细胞覆盖 1.5% 琼脂糖/2×MEM 覆盖层，在 37 摄氏度下孵育 2 天。细胞用 10% 甲醛固定 30 分钟，并用结晶紫染色。</li>
</ol>

<ol><li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H%2FHeN+and+BALB%2Fc+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology+Online%22%5BJournal%5D)">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li>
<li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li>
<li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li>
<li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection%3A+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li>
<li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592(2009).</li>
<li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds%3A+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li>
<li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管本方案涵盖了体内分析的成像方面，但必须认识到生物发光载体是未来研究中的一个关键因素。我们使用TC83（一种减毒的VEEV疫苗株）作为荧光素酶表达的载体，可确保在中枢神经系统（CNS）中因病毒的高复制率而大量产生该酶，如先前研究所述1-4。尽管引入第二个亚基因组启动子和荧光素酶基因导致重组病毒相较于野生型TC83进一步减毒，但这种减毒似乎并未改变感染后前6天内的疾病临床进程5。我们预期随着病毒的持续复制，荧光素酶基因会逐渐丢失，但这种现象同样仅在疾病发展的后期才被观察到。其他致病性载体（包括病毒性和细菌性）的开发进一步证实了IVIS系统与荧光素酶在多种病原体研究领域中的潜力与高效性6-9。
成像过程本身包含若干关键步骤，必须在开展完整研究之前完成。应首先在包含少量动物的预实验中完成对载体生物发光强度的初步分析。预期位置 在体 由于所使用的载体不同，荧光素酶的积累情况应事先了解，但在开展大规模研究之前仍需确定预期的信号强度。由于新软件已内置自动曝光检测功能，因此不再需要进行曝光时间...

<table><tbody><tr><td>D-荧光素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 系统（Spectrum）</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 气体麻醉系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XIC-3 隔离箱</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 软件</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遥测/识别芯片</td><td>生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems）</td><td>IPTT-300</td><td>用于动物编号与体温监测</td></tr><tr><td>BD Integra 1 ml 结核菌素注射器，配 26 g × 3/8&amp;#8221; 针头</td><td>费舍科学公司（Fisher Scientific）</td><td>305279</td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond 组织粘合剂</td><td>费舍科学公司（Fisher Scientific）</td><td>NC9259532</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin 眼科软膏</td><td>韦伯斯特兽医产品公司（Webster Veterinary Products）</td><td>78444656</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（1X）</td><td>英潍捷基公司（Invitrogen）</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>BMDS 芯片读取器</td><td>生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems）</td><td>DAS-7007S</td><td></td></tr><tr><td>DAS-HOST 软件</td><td>生物医学数据系统公司（Bio Medic Data Systems）</td><td></td><td>用于下载探针信息</td></tr></tbody></table>

体内成像系统（ivis）检测神经侵袭性脑炎病毒

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

成像技术的现代进步推动了病毒学研究方法的进一步发展与优化。Russell 和 Burch 在 Hume 提出的“3R 原则”（替代、减量、优化）基础上，倡导在科学研究中不断探索减少动物使用的新方法，同时提升研究的科学准确性与效率。然而，遵循 Hume 原则面临的主要挑战之一是如何在减少动物发病率及使用数量的同时，确保研究结果具有统计学效力。目前，疫苗有效性研究通常需要大量实验动物才能达到统计学显著性，且往往以高发病率和高死亡率为终点指标来判断免疫保护效果。我们采用了 体内 利用成像系统（IVIS）结合萤火虫荧光素酶，可在小鼠模型中逐步追踪脑炎病毒对中枢神经系统（CNS）的侵袭过程。该疾病通常进展较慢，但病毒复制迅速，尤其是在中枢神经系统内，常导致致命性后果。通过鼻腔感染表达荧光素酶基因的减毒委内瑞拉马脑炎病毒株TC83-Luc后，我们能够在临床疾病症状出现前至少三天观察到病毒在脑内的复制。以中枢神经系统侵袭作为脑炎性疾病发展的关键终点指标，可在临床症状出现前快速评估药物治疗和疫苗对TC83-Luc感染的保护效果。借助IVIS技术，我们能够实现对药物疗法和疫苗的快速、准确测试，同时减少实验动物使用数量和动物病痛。

使用基因改造病毒TC83-Luciferase，我们观察到随着病毒复制从鼻腔区域扩散至中枢神经系统，生物发光信号强度逐渐增强（图1）。由于该病毒具有较高的复制速率，我们预期会观察到较强的生物发光信号（图2A），其强度取决于载体本身以及动物对载体的免疫反应。我们预计该信号将持续增强，并在感染后第5至7天达到峰值，这与病毒在中枢神经系统内的复制高峰相一致（图2B）。在信号和病毒复制达到峰值之后，随着病毒复制水平下降以及荧光素酶基因的丢失，生物发光信号将随之减弱。通过这些信号值，我们期望能够根据信号强度定量病毒载量，从而建立一种in vivo的方法，用于准确计算单个动物体内TC83-Luciferase特异性的病毒载量动态增长过程。
利用该模型作为分析疫苗和抗病毒治疗手段的方法，我们预期能够通过生物发光信号的减弱来区分有效的治疗措施。在本研究中，针对TC83-Luciferase，我们可采用腹腔注射Ampligen（一种Toll样受体3激动剂）或在感染前3周进行疫苗接种...

利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。

体内成像系统（IVIS）检测神经侵袭性脑炎病毒

成像技术的现代进步推动了病毒学研究方法的进一步发展与完善。该方法最初由……提出

今天，我们介绍一种利用生物发光技术检测Aurine物种体内甲型病毒中枢神经系统感染的方法。该方法采用TC-83，即插入了萤光素酶基因的委内瑞拉马脑炎减毒活疫苗株，可用于追踪病毒在宿主体内的复制与扩散过程。在近期发表的一篇关于疫苗的研究论文中，我们展示了可视化中枢神经系统（CNS）侵入的能力，并将其作为评估疫苗和抗病毒治疗效果的研究终点指标，该终点早于对照组出现临床疾病表现。大家好，我是Allison Ard，我在德克萨斯大学医学分部的高防护等级实验室担任动物技术员。本视频中展示的工作由我、德克萨斯大学医学分部的研究生Michael Patterson以及我们实验室的高年级研究生Katie Taylor共同完成。本视频中展示的所有工作均在加尔维斯顿国家实验室完成，并已获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的全面批准，严格遵循环境健康与安全法规，采用活体成像系统进行。IVUS技术使我们能够减少研究中所需的动物数量，因为我们具备对每只动物每天生成图像的能力。今天的概述将展示动物的准备工作，包括前额剃毛、BMDS处理、鼻内接种TC 80 D病毒、腹腔注射Lucifer以进行成像，以及将动物从生物安全柜转移至成像盒中的操作过程。随后，我们将把动物从成像盒转移至Caliper成像仪，进行实际的成像操作，获取二维和三维图像，最后将动物成像完成后重新转移回生物安全柜中。我们的动物实验室配备有一台二级生物安全柜，所有体外和体内操作均在此柜内进行。生物安全柜旁边是配有异氟烷蒸发器和计算机接口的 Cali ivu spectrum 设备。异氟烷蒸发器可精确输送吸入性麻醉剂，与注射用麻醉剂相比，这种方法麻醉小鼠更快且更安全。XI C3 成像箱是一个带有高效微粒空气（HEPA）过滤装置的密封单元，可使我们在实验室内部安全地转运动物。在之前的研究中，我们发现毛色较深的海洋物种由于其毛发的影响，其生物发光信号会受到抑制。我们建议剃除动物前额和吻部的毛发，以在整个研究过程中提高信号检测的灵敏度。在我们的研究过程中，我们使用 BMDS 应答器芯片，该芯片可实现无线采集温度和动物识别信息。这种采集方法减少了对动物的抓取和应激。用乙醇擦拭使毛发贴服后，将芯片皮下植入。在小鼠处于麻醉状态时，我们对动物进行鼻内感染的麻醉处理。待其失去意识后，用手轻轻抓住动物颈背部皮肤，使其鼻部朝上。每侧鼻孔加入20 µL，每只小鼠共40 µL。滴加之间让动物自由呼吸，以防止接种物积聚在咽喉后部。进行腹腔注射荧光素时，用手轻轻抓住小鼠颈背部皮肤，并将尾巴置于小指和无名指下以固定。随后将荧光素注入每只动物的腹腔，以确保荧光素在血液中充分扩散。注射后等待5至10分钟，再对小鼠进行麻醉，以便成像。麻醉后，可将动物转移至XI C3成像隔离箱中。将它们的头部轻轻放置在黑色电工胶带条上，以减少颅骨位移。由于呼吸运动会影响所有成像过程（包括三维成像、全肢前伸以及在XI C3装置内的俯卧位），因此在XI C3装置内采取俯卧位可确保最佳的地形图映射。当所有动物均正确放置后，密封XI C3箱体，并用乙醇擦拭装置外表面，在将箱体移出生物安全柜前对双手进行消毒。将 XI C3 盒放入 ivus 成像仪时，确保麻醉气体进出口正确连接至附着在 XI C3 盒上的 HEPA 过滤器。同时，在关闭成像仪并开启麻醉气体流动之前，确保成像网格完全覆盖小鼠。打开 Living Image 软件后，您需要使用您的用户名登录。然后启动 IVUS 设备。当 IVUS 设备准备就绪时，温度指示器将变为绿色，此时温度约为负 90 摄氏度。我们采用自动检测曝光时间，并将所有其他设置保持默认状态。图像获取后，将显示在主屏幕上。您可以选择感兴趣区域，从而自动检测信号强度较高的特定区域。此外，您还可以手动输入希望可视化但系统在三维成像中未能自动识别的强信号区域。选择一个序列设置选项，选择成像向导，然后选择生物发光。选择生物发光后，点击DLIT，然后点击下一步。在DLIT设置下，确保为US Firefly选择了正确的报告基因，然后点击下一步。请确保您输入的所有信息准确无误。我们的成像对象为小鼠，视野大小为C尺寸。随后点击“下一步”，系统将生成一组包含五个不同波长的图像，波长范围从560纳米至640纳米。在第一幅图像中，我们还获取了地形图像，以实现三维成像。然后点击“采集序列”。当五幅图像全部采集完成后，即可关闭成像序列设置，并开始对图像进行处理。为了生成三维重建图像，我们首先需要确保拥有清晰的地形图。我们将样本设为一只毛茸茸的小鼠，并采用背侧朝上的方位进行重建。在操作中，我们仅勾画小鼠本体，避免选中盒子背景区域的任何部分。我们点击下一步，此步骤所需时间可能取决于您的图像和所使用的计算机系统。完成后，您将获得小鼠身体的拓扑图。然后进入DLIT三维重建。确保您的阈值设置和组织属性已正确设定。我们的脑组织选择“开始”，然后选择“重建”。这是另一个可能根据您的计算系统而耗时较长的时间点。完成后，您将在地形图上看到一个信号。然后需要点击 3D 工具，点击配准、器官图谱，对于我们女性背侧朝向。接着可以调整器官的透明度以更好地观察，之后点击线性拟合，将地形图与数字器官集进行匹配。我们可以移除所有器官，仅保留希望利用超声脑成像信号识别的器官。利用该技术，我们还能够生成三维视频，从而实现旋转、调整透明度、切换视角、放大、移除器官，最后缩小视图。成像完成后，关闭异氟烷蒸发器，并拆下XI C3密闭箱。将密封箱放回生物安全柜中，轻轻移除小鼠身上的电工胶带。对于较长时间的成像，可在 ABS L2 级生物安全柜内通过佩戴手套的适当操作对小鼠进行保温。我们密切观察动物，以确保其从麻醉中完全恢复。我们感谢Pessler博士以及实验室中所有为本项目做出贡献的人员。我们还要感谢加尔维斯顿国家实验室，该实验室提供了设施和设备，同时感谢转化科学研究所为本研究提供的经费支持。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在活体成像系统（IVIS）的神经侵入性脑炎病毒的检测

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内...

使用 体内 利用成像技术监测新生小鼠巨细胞病毒感染进展

本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

新生小鼠脑室内病毒注射以实现持续且广泛的神经元转导

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。...

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

本文介绍了一种建立免疫健全的ICR（Institute of Cancer...

一种模拟登革病毒感染所致急性病毒性脑炎的小鼠模型

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

新型的组织透明化技术（如溶剂清除器官的终极三维成像）可与免疫染色兼容，能够实现狂犬病病毒脑部感染及其复杂细胞环境的三维可视化。通过对厚的抗体标记脑组织切片进行光学透明化处理，可增加成像深度，并实现共聚焦激光扫描显微镜下的三维分析。...

溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。...

通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

微型显微镜体内钙成像是一种研究自由活动小鼠神经元动态和微环路的有力技术。本方案描述了进行脑部手术以利用微型显微镜实现良好体内钙成像的步骤。...

立体定向病毒注射与梯度折射率透镜植入用于深部脑区 体内 钙成像

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

学习使用活体成像系统检测中枢神经系统病毒感染的方法。该技术利用生物发光实时追踪病毒入侵过程，为疫苗和抗病毒药物研发提供更准确的疾病模型。

体内成像系统（IVIS）检测神经侵袭性脑炎病毒

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