Name: 允许有针对性的大鼠模型血 - 脑屏障破坏神经血管治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习在大鼠模型中通过颈动脉插管注射甘露醇来破坏血脑屏障的方法。该技术利用伊文思蓝染料验证屏障开放效果，为神经肿瘤学和药物递送研究提供新途径。

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本工作由 J.B. Marshall 基金会资助。

1. 准备实验动物和实验设备
<ol>
	<li>手术开始前，准备手术区域和动物。通过将23号钝头针插入一段12英寸PE50导管的一端来制备颈动脉导管。在导管的另一端切出约45°的斜面。在手术前对器械进行灭菌。佩戴手术帽、外科口罩和无菌手套。</li>
	<li>在手术操作台表面放置加热垫，启动并预热。用吸水性实验台垫覆盖该区域。</li>
	<li>确认25%甘露醇溶液中无结晶。若存在结晶，将药瓶置于80 °C热水浴中并定期振荡，直至结晶溶解。</li>
	<li>记录动物的质量。</li>
	<li>配制丙泊酚稀释液，以0.1 ml/min的速度输注，使给药剂量为0.8 mg/kg/min。</li>
	<li>将大鼠放入诱导箱中3分钟。设置参数：异氟烷浓度5%，呼吸机气体流速2 L/min。</li>
	<li>在一次性毛巾上剃除颈部及两侧内侧大腿的毛发。</li>
</ol>
2. 对大鼠进行插管
<ol>
	<li>将动物放回诱导箱中，持续 3 分钟。</li>
	<li>使用静脉留置针准备气管插管。针对此体型和品系的大鼠，我们使用 18 号留置针。插管必须足够大以保证充足的气流，但又需足够小，以便无损伤地插入气管。将针头从塑料套管中抽出，并小心地在距其尖端约 1 cm 处折断针头。钝化的针头将作为引导丝使用。随后将该针头重新插入套管中。</li>
	<li>将大鼠的牙齿挂在倾斜的表面上，使其悬垂。</li>
	<li>将光源直接照射在动物颈部，并对准两耳之间的位置。</li>
	<li>将小型刮匙插入口腔咽部约 3 cm 深处，同时轻柔地向外牵拉舌头，并向上抬起。</li>
	<li>观察气管开口。可见一个小孔随每次呼吸开合。</li>
	<li>轻柔地将套管插入该开口中。有时可感觉到塑料套管进入气管软骨。气管较为敏感，切勿强行推进套管。</li>
	<li>将呼吸机设置为 1 L/min 的气流速度和 60 次/分钟的呼吸频率，并将异氟烷浓度设为 2%。</li>
	<li>将套管连接至呼吸机，并用胶带将导管固定在操作台面上。</li>
	<li>通过夹捏足趾测试确认动物是否已充分麻醉。</li>
</ol>
3. 建立丙泊酚静脉麻醉
<ol>
	<li>用胶带将大鼠的四肢和尾巴固定在手术台面上。</li>
	<li>用洗必泰皂液对已剃毛的颈部和腹股沟部位进行三次擦洗，随后再用洗必泰冲洗液擦洗三次。</li>
	<li>将装有丙泊酚的注射器连接至静脉延长管，再将注射器安装到输液泵上。</li>
	<li>使用手术刀切开已剃毛的大腿皮肤，注意避免损伤肌肉组织。</li>
	<li>用镊子撑开切口，以暴露股静脉。</li>
	<li>分离覆盖在动脉上的组织，充分暴露血管。</li>
	<li>将26号Monoject兽用静脉导管插入静脉。当针头刺穿静脉壁时，会感到推进阻力减小；此时回撤针芯，将导管继续推入血管内。</li>
	<li>以0.1 ml/min的速率开始丙泊酚输注。</li>
	<li>开始丙泊酚输注后3-5分钟，将麻醉气体切换为50% O2 和50% N2O的混合气体，并关闭异氟烷。</li>
</ol>
4. 暴露颈总动脉分叉
<ol>
	<li>使用手术刀片在颈部正中做一纵向切口。</li>
	<li>用剪刀或手术刀在两侧较大的唾液腺之间进行切割。</li>
	<li>解剖分离正中线外侧的组织，以暴露颈总动脉。使用镊子逐层分离组织。可用剪刀去除经镊子暴露后确认血管分布较少的组织。必要时用纱布、棉签或电凝止血。</li>
	<li>若出现中度至大量出血，可经腹腔注射3 ml生理盐水。</li>
	<li>使用牵开器将组织从颈总动脉处牵开，找到分叉部位。</li>
	<li>在分叉远端暴露枕动脉。用镊子夹住枕动脉，电凝夹闭后使用电刀将其分离。</li>
	<li>用镊子充分暴露颈总动脉分叉处，并尽可能多地暴露颈外动脉（ECA）。</li>
	<li>在枕动脉远端暴露自颈外动脉发出的甲状腺上动脉。用镊子夹住该动脉，电凝夹闭后使用电刀将其分离。</li>
</ol>
5. 插管颈外动脉
<ol>
	<li>在颈外动脉（ECA）下方放置两段4/0丝线。</li>
	<li>用止血钳夹住其中一段缝线，将ECA向尾侧（朝向大鼠足部方向）牵拉。</li>
	<li>取另一段缝线，在尽可能靠近头侧（朝向大鼠口部方向）的位置打外科结，形成永久性结扎，以阻断ECA血流。</li>
	<li>移除第一个止血钳（原先施加尾侧张力的止血钳），改用止血钳夹住另一段缝线（已围绕ECA打结的缝线），并向头侧施加轻柔张力。</li>
	<li>在分叉远端、永久结扎线近端处，用另一段缝线 loosely 打一个外科结（不要完全收紧——保持轻微结扎状态）。</li>
	<li>用1%利多卡因冲洗，以松弛动脉。</li>
	<li>用肝素化生理盐水填充导管。</li>
	<li>在尽可能靠近分叉处的位置放置一个临时血管夹，将血管夹倾斜放置以最大化导管插入空间。将松开的结向血管夹方向滑动。</li>
	<li>使用显微剪刀在结扎线近端稍前方的ECA上做一个小的动脉切口（切开）。若血管夹和结扎牢固，则不应有出血。</li>
	<li>用镊子控制ECA管壁，将导管斜面端插入血管内。</li>
	<li>用松开的缝线结固定导管，将动脉在导管周围结扎紧。</li>
	<li>移除血管夹，并用棉签清洁操作区域。</li>
	<li>将导管向前推进至距分叉处约1 mm的远端位置。用镊子夹住结扎点近端的动脉，确保血管固定不动。</li>
</ol>
6. 给予甘露醇
<ol>
	<li>用甘露醇填充一条8英寸的静脉延长管和一支6 ml注射器，避免产生任何气泡。将此装置置于37 °C培养箱中保存。注意：操作甘露醇时应迅速，因其在室温下易从溶液中析出。</li>
	<li>为观察血脑屏障破坏（BBBD），可给予动物伊文思蓝染料，并观察其进入血脑屏障受损的脑区。为此，通过与丙泊酚输注侧相对的后肢另一侧新建立的静脉通路，给予动物2 ml/kg的2%伊文思蓝。</li>
	<li>将延长管连接至一个5 μm滤器，并用甘露醇填充以排除气泡。随后，在不产生气泡的情况下将该装置连接至三通阀。</li>
	<li>以0.09 ml/sec的速度输注甘露醇，持续25秒。观察甘露醇是否在颈总动脉靠近颈内动脉（ICA）起始处近端的位置与血流达到平衡。此时甘露醇应随大鼠心率呈现脉动样流动。若甘露醇持续向心脏方向流动，则提示已超过大鼠血压，可能导致危及生命的并发症及血脑屏障破坏效果不佳。</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Smith, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> 89, 193-208 (2003).</li>
<li>Kroll, R. A., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outwitting+the+blood-brain+barrier+for+therapeutic+purposes%3A+osmotic+opening+and+other+means%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: osmotic opening and other means.</a> Neurosurgery. 42, 1083(1998).</li>
<li>Kroll, R. A., Pagel, M. A., Muldoon, L. L., Roman-Goldstein, S., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+volume+of+distribution+to+the+brain+with+interstitial+infusion%3A+dose%2C+rather+than+convection%2C+might+be+the+most+important+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Increasing volume of distribution to the brain with interstitial infusion: dose, rather than convection, might be the most important factor.</a> Neurosurgery. 38, 746-754 (1996).</li>
<li>Butt, A. M., Jones, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histamine+and+antagonists+on+electrical+resistance+across+the+blood-brain+barrier+in+rat+brain-surface+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Effect of histamine and antagonists on electrical resistance across the blood-brain barrier in rat brain-surface microvessels.</a> Brain research. 569, 100-105 (1992).</li>
<li>Inamura, T., Black, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradykinin+selectively+opens+blood-tumor+barrier+in+experimental+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Bradykinin selectively opens blood-tumor barrier in experimental brain tumors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 14, 862-870 (1994).</li>
<li>Matsukado, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+uptake+of+carboplatin+and+survival+in+glioma-bearing+rats+by+intracarotid+infusion+of+bradykinin+analog%2C+RMP-7%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor uptake of carboplatin and survival in glioma-bearing rats by intracarotid infusion of bradykinin analog, RMP-7.</a> Neurosurgery. 39, 125(1996).</li>
<li>Kroll, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+delivery+to+intracerebral+tumor+and+surrounding+brain+in+a+rodent+model%3A+a+comparison+of+osmotic+versus+bradykinin+modification+of+the+blood-brain+and%2For+blood-tumor+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Improving drug delivery to intracerebral tumor and surrounding brain in a rodent model: a comparison of osmotic versus bradykinin modification of the blood-brain and/or blood-tumor barriers.</a> Neurosurgery. 43, 879(1998).</li>
<li>Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+localized+delivery+of+Herceptin+to+the+mouse+brain+by+MRI-guided+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, 11719-11723 (2006).</li>
<li>Neuwelt, E. A., Dahlborg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+administered+in+conjunction+with+osmotic+blood-brain+barrier+modification+in+patients+with+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy administered in conjunction with osmotic blood-brain barrier modification in patients with brain metastases.</a> Journal of neuro-oncology. 4, 195-207 (1987).</li>
<li>Doolittle, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+a+multicenter+study+using+intraarterial+chemotherapy+in+conjunction+with+osmotic+opening+of+the+blood-brain+barrier+for+the+treatment+of+patients+with+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of a multicenter study using intraarterial chemotherapy in conjunction with osmotic opening of the blood-brain barrier for the treatment of patients with malignant brain tumors.</a> Cancer. 88, 637-647 (2000).</li>
<li>Guillaume, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+chemotherapy+with+osmotic+blood-brain+barrier+disruption+for+aggressive+oligodendroglial+tumors%3A+results+of+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial chemotherapy with osmotic blood-brain barrier disruption for aggressive oligodendroglial tumors: results of a phase I study.</a> Neurosurgery. 66, 48(2010).</li>
<li>Remsen, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+anesthetic+choice%2C+PaCO2%2C+and+other+factors+on+osmotic+blood-brain+barrier+disruption+in+rats+with+brain+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">The influence of anesthetic choice, PaCO2, and other factors on osmotic blood-brain barrier disruption in rats with brain tumor xenografts.</a> Anesthesia & Analgesia. 88, 559-559 (1999).</li>
<li>Nilaver, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+herpesvirus+and+adenovirus+to+nude+rat+intracerebral+tumors+after+osmotic+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delivery of herpesvirus and adenovirus to nude rat intracerebral tumors after osmotic blood-brain barrier disruption.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 9829(1995).</li>
<li>Fortin, D., McCormick, C. I., Remsen, L. G., Nixon, R., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+neurotoxicity+of+etoposide+phosphate+administered+in+combination+with+other+chemotherapeutic+agents+after+blood-brain+barrier+modification+to+enhance+delivery%2C+using+propofol+for+general+anesthesia%2C+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Unexpected neurotoxicity of etoposide phosphate administered in combination with other chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification to enhance delivery, using propofol for general anesthesia, in a rat model.</a> Neurosurgery. 47, 199(2000).</li>
<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+CNS+lymphoma+treated+with+osmotic+blood-brain+barrier+disruption%3A+prolonged+survival+and+preservation+of+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function.</a> Journal of clinical oncology. 9, 1580(1991).</li>
<li>Remsen, L. G., Trail, P. A., Hellström, I., Hellström, K. E., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+delivery+improves+the+efficacy+of+a+tumor-specific+doxorubicin+immunoconjugate+in+a+human+brain+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Enhanced delivery improves the efficacy of a tumor-specific doxorubicin immunoconjugate in a human brain tumor xenograft model.</a> Neurosurgery. 46, 704(2000).</li>
<li>Neuwelt, E. A., Pagel, M. A., Kraemer, D. F., Peterson, D. R., Muldoon, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+chemoprotection+without+compromise+of+chemotherapy+efficacy+in+a+rat+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bone marrow chemoprotection without compromise of chemotherapy efficacy in a rat brain tumor model.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 309, 594-599 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

提高BBBD效果的方法有多种。在手术切开阶段，应尽量减少出血。大量出血会影响血压和心率，而这些因素已知会影响BBBD的程度13。可通过结扎必须切断的主要血管（如甲状腺上动脉和枕动脉）来减少出血。此外，可使用电凝术切断血管，并分离血供丰富的区域。保持进入动物体内的所有管路（尤其是颈动脉导管）中无空气和固体物质也非常重要。快速操作甘露醇有助于防止其在注射器或管路内形成结晶。
使用甘露醇的流速时，必须根据本实验所用大鼠的体型和品系选择有效的流速。甘露醇输注的流速需与大鼠颈总动脉内的压力相匹配，以确保高浓度甘露醇进入颈内动脉，而不会沿颈总动脉向下流入心脏和肺部，否则可能造成损伤。若研究人员选用与本研究中不同体型或品系的大鼠，应通过实验确定合适的甘露醇流速。
该操作方法的一个局限性在于，它需要牺牲外颈动脉（ECA）。一旦对ECA进行插管，再次插管将变得困难且不可靠。因此，同一脑半球不能重复进行该操作。此外，在血脑屏障开放（BBBD）后给予的化合物必须仔细检测其神经毒性。一些通常情况下安全的药物，一旦穿过血脑屏障...

<table><tbody><tr><td>Long Evans 大鼠</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td>210–250 g，雄性</td></tr><tr><td>PE 50 管</td><td>Beckton-Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 号 × 2.5&quot; 静脉导管</td><td>Terumo</td><td></td><td>用于气管插管</td></tr><tr><td>30&quot; 静脉延长管</td><td>Abbott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 号兽用静脉导管</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊文思蓝染料</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>双极电极</td><td>Codman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤器，5 &amp;mu;m</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

内皮细胞通过紧密连接，与基底膜及星形胶质细胞终足共同包绕脑血管，形成血脑屏障1。该屏障根据分子的大小和电荷选择性地阻止物质在血液与脑组织之间自由通过。这一功能可能阻碍治疗神经系统疾病药物的递送。例如，多种化疗药物无法有效穿过血脑屏障以到达肿瘤细胞2。因此，提高药物穿越血脑屏障的递送效率成为研究关注的领域。
提高药物向脑部递送的最常见方法是直接脑内灌注和血脑屏障破坏3直接脑内灌注可确保治疗药物到达脑部，但该方法在药物扩散方面能力有限4血脑屏障破坏（BBBD）可使药物直接从循环系统进入脑组织 进入大脑，从而更有效地作用于分散的肿瘤细胞。屏障开放的三种方法包括渗透性屏障开放、药理性屏障开放以及聚焦超声联合微泡技术。渗透性开放由Neuwelt首创，采用25%高渗甘露醇溶液，使血脑屏障细胞脱水收缩，从而破坏其紧密连接。药理性屏障开放则可通过血管活性化合物（如组胺）实现5 和缓激肽6然而，该方法主要对脑肿瘤屏障具有选择性7此外，与使用25%甘露醇进行渗透性血脑屏障开放（BBBD）相比，缓激肽类似物RMP-7在直接对比中表现较差。8另一种方法是聚焦超声（FUS）联合微泡超声造影剂，该方法也已证明可逆性地开放血脑屏障9与FUS相比，25%甘露醇在人类患者中具有更长的安全使用历史，使其成为转化研究中一种经过验证的工具。10-12.
为了实现血脑屏障破坏（BBBD），必须以高流速将甘露醇直接输送到脑部动脉循环中。在人体中，可通过导管介入技术将导管引导至脑部，从而实现快速、直接的灌注。本方案尽可能模拟了人类的 BBBD 过程。在暴露颈总动脉分叉处后，将导管逆行插入颈外动脉（ECA），并用于将甘露醇直接注入颈内动脉（ICA）的血流中。使用异丙酚和一氧化二氮（N2O）麻醉，因其能够最大程度地增强血脑屏障的破坏效果13。若操作得当，该方法能够安全、有效且可逆地开放血脑屏障，从而改善那些通常无法进入脑组织的药物的递送效率8,13,14。

<img alt="大脑半球 A 和 B 的视觉比较，染料摄取实验，解剖学研究。" src="/files/ftp_upload/50019/50019fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 通过伊文思蓝染料外渗可视化血脑屏障的破坏。 伊文思蓝染料是一种可与白蛋白结合的色素，在生理条件下不会渗入脑组织。当大脑一侧的血脑屏障受到破坏时，伊文思蓝即可进入并使受损半球染成蓝色，而未受损半球则保持不变，因此该染料可作为血脑屏障破坏的有效标志物。图 1A 为未发生血脑屏障破坏的大脑示例。图 1B 为使用 25% 甘露醇进行渗透性血脑屏障开放（BBBD）后脑组织被染成蓝色的示例。注意其中一个半球被染成蓝色，而另一个半球未被染色。部分蓝色染料因威利斯环处血流混合而进入左侧半球靠近正中纵裂的区域。

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。

具有紧密连接的内皮细胞、基底膜以及星形胶质细胞终足共同包绕脑血管，形成血脑屏障……

该操作的总体目标是破坏血脑屏障。首先，通过气管插管对动物实施静脉麻醉，随后暴露颈总动脉的分叉处。然后将导管插入颈外动脉。最后给予甘露醇。最终可获得结果，通过伊文思蓝染料的外渗显示血脑屏障的破坏。与现有的动脉内治疗技术相比，该方法的主要优势在于，它能使通常在生理条件下无法穿过血脑屏障的药物进入大脑。这一特性在神经科学领域具有重要意义，因为它使我们能够测试那些穿越血脑屏障能力较差的新型疗法。该技术的影响还延伸至神经肿瘤学领域，因为许多化疗药物无法穿过血脑屏障。尽管该方法为我们深入了解肿瘤学提供了新的视角，但它也可为其他由血脑屏障通透性差的药物所治疗的神经学疾病提供信息。我们希望，通过本方法的可视化演示，能让熟悉动物手术的研究人员在其实验室中应用该技术。首先，配制25%的甘露醇溶液，并确认其中无结晶存在。如果存在晶体，将小瓶置于80摄氏度水浴中并振荡以溶解。定期记录动物体重，并准备两支12毫升注射器，内含丙泊酚，以每分钟0.1毫升的速度给药。在诱导室中对动物实施麻醉后，将其置于一次性毛巾上，剃除颈部和内侧大腿的毛发。将动物放回诱导室中持续三分钟。为准备对大鼠进行气管插管，首先使用静脉导管准备一根气管内插管。该插管必须足够粗以保证充足的气流，但又需足够细，以便插入气管而不造成损伤。制作触针时，先将针头从塑料导管中取出，小心地折断针头。从其尖端约一厘米处，将针头重新插入导管中。接着，将大鼠的牙齿挂在倾斜的表面上，将光线直接照射到动物颈部，光线位置应与两耳之间的连线对齐。接下来，将一把小刮勺插入咽峡部，深度约为三厘米。同时轻轻将舌头拉出嘴外，并向上抬起。观察气管的开口，其表现为一个开合的小孔。每次呼吸时，轻柔地将导管插入该小孔，注意不要用力将其推入敏感气管的软骨中。将呼吸机设置为每分钟1升、60次呼吸频率，并将异氟烷调节至2%，然后将导管连接至呼吸机，并用胶带将导管固定在操作台面上。通过脚趾夹捏法确认动物已麻醉。将四肢及尾巴用胶带固定于手术台表面以确保体位稳定。用氯己定皂液对剃毛后的颈部和腹股沟部位进行三次擦洗。然后用氯己定进行擦洗。冲洗三次。将装有丙泊酚的注射器连接到静脉延长管上，并将注射器安装在输液泵上。接下来，使用手术刀在剃毛后的大腿皮肤上划开，注意不要切到肌肉。然后用镊子打开切口，找到股静脉，并将覆盖在动脉上的组织拨开以暴露血管。将26 G单头弹出式兽用静脉留置针插入静脉中。一旦针头刺破静脉壁，推进就会变得更加容易。回撤针头，将导管向前送入血管内3至5分钟。开始输注丙泊酚后，将麻醉气体切换为50%氧气和50%一氧化二氮的混合气体，并关闭异氟烷。为了暴露颈总动脉的分叉，首先使用手术刀片在颈部正中做一切口。沿正中线切开浅筋膜，直至气管上方的胸骨舌骨肌。将组织向两侧牵开，以显露三块肌肉组成的结构：胸骨舌骨肌、二腹肌和胸锁乳突肌，这三块肌肉在大鼠颈部形成颈动脉三角，可用镊子或剪刀进行分离。分离颈动脉三角区域肌肉间的筋膜，以暴露颈动脉。使用双极电凝结合纱布和棉签切断小血管，并用止血钳和拉钩将肌肉牵开以控制出血。将组织从颈动脉上移开，找到其分叉处。在分叉远端暴露枕动脉。用镊子夹住后电凝，再使用电凝设备配合镊子将其分离。充分暴露颈动脉分叉处，以及尽可能多的颈外动脉或ECA部分。暴露甲状腺上动脉，该动脉自ECA发出，位于枕动脉远端。用镊子夹住后电凝，并分离以用于ECA插管。在其下方放置两段4-0丝线。使用止血钳夹住一段缝线，并用另一段缝线将颈外动脉（ECA）向后牵拉。在尽可能靠近头侧的位置打外科结，结扎位置应位于分叉远端及永久性结扎线近端。再松松地打另一个外科结以放松动脉。用1%利多卡因进行灌注，并用肝素化生理盐水填充导管。接着，将临时血管夹以尽可能靠近分叉处的角度放置。然后使用显微剪刀将松结向血管夹方向滑动。在结扎线近端的颈外动脉（ECA）上做一个小切口。如果夹子和结扎线固定牢固，使用镊子时应无出血。为控制颈外动脉管壁，将导管的斜面端连同松动的外科结一起送入血管内。固定导管。在导管周围结扎动脉，然后移除夹子，使用棉签清洁该区域。将导管向前推进约一毫米，至分叉远端。使用镊子夹住结扎部位近端的动脉，以确保血管固定不动。给予甘露醇时，用一个8英寸的静脉延长管和一支6毫升注射器抽取甘露醇，避免产生任何气泡。将其置于 37 摄氏度下，以观察血脑屏障破坏（BBBD）；或通过与丙泊酚输注侧肢体对侧的新的静脉注射部位，给予每公斤体重 2 毫克的 2% 伊文思蓝。将输液延长管连接至 5 微米滤器，并用米诺尔（minol）充满以去除气泡，然后将其连接至停止阀，避免产生气泡。以每秒0.09毫升的速度给予甘露醇，持续25秒。观察甘露醇是否与颈总动脉内的血流达到平衡，平衡点应位于颈内动脉起始部近端附近，此时甘露醇应随大鼠心率出现搏动性流动。确保甘露醇不向心脏方向流动，否则表明灌注压力已超过大鼠血压，可能导致严重并发症。脑一侧血脑屏障被破坏后，伊文思蓝可进入并使受损半脑染成蓝色，而未受破坏的半脑则保持不变。此处展示的是一个未发生血脑屏障破坏（BBBD）的大脑示例，而这里展示的是经渗透性 BBBD 处理后被染成蓝色的大脑。请注意，右侧大脑半球被染色，同时在靠近大脑纵裂中线处，部分蓝色染料通过威利斯环的血流混合进入了左侧大脑半球。该技术为研究人员在大鼠模型中探索无法穿透血脑屏障的治疗方法奠定了基础。观看本视频后，您应能够通过颈动脉插管并将甘露醇溶液直接灌注至大脑，实现血脑屏障的可逆性开放。

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科研

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Medicine

医学

允许有针对性的大鼠模型血 - 脑屏障破坏神经血管治疗

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建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

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一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

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一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

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