Name: 使用反时相蛋白的阵列（RPPA）探索在个人的肾细胞癌蛋白表达的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 探索反相蛋白阵列技术用于分析肾细胞癌中蛋白质表达的异质性变化。该方法通过肿瘤区域映射、蛋白提取与抗体检测，揭示治疗前后的差异表达模式，为靶向治疗耐药机制研究提供重要依据。

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上述作者 FCO、DF、JN、DJH 和 GDS 的工作由首席科学家办公室资助，资助编号：ETM37，并得到英国癌症研究会实验癌症医学中心的支持。AL 的工作由爱丁堡皇家外科医学院罗伯逊信托基金、癌症护理与治愈梅尔维尔信托基金以及英国医学研究理事会资助。IO 获得由玛丽·居里行动计划和英国医学研究理事会共同资助的爱丁堡皇家学会苏格兰政府研究员项目的支持。作者谨此感谢 SCOTRRCC 项目的共同申请人及合作者就本文讨论的部分主题所提供的有益讨论。

1. 形态学和分子肿瘤异质性的鉴定
<ol>
 <li>从 -80 °C 冰箱中取出肿瘤组织，并置于干冰上保存。</li>
 <li>将肿瘤组织分割成约 1 cm3 的小块。记录每块肿瘤组织之间的原始相对位置，并用唯一名称进行标记。将样本分别储存于 -80 °C 冻存管中，直至使用。</li>
 <li>用 OCT 包埋样本，并在 -22 °C 下用冷冻切片机进行切片。</li>
 <li>采用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin）复染法对样本进行染色。</li>
 <li>对冷冻切片进行显微镜分析，以确认其为 ccRCC 组织性质、具有活性的肿瘤组织，并进行分级（低级别、高级别或混合型低/高级别；在冷冻切片上区分 Fuhrman 1 至 4 级较为困难）。图 1 a&amp;b （高级别、低级别及混合级别 H&amp;E 染色结果）。</li>
 <li>从每个肿瘤内形态学不同的区域中最多选取 4 个样本用于蛋白质提取。</li>
</ol>
2. 从肿瘤样本中提取蛋白质
<ol>
 <li>从OCT中切取肿瘤样本。</li>
 <li>将50–75 mg组织放入含有990 μl裂解缓冲液［50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM EGTA（pH 8.5）、150 mM NaCl］的2 ml离心管中，并加入抑蛋白酶肽（Sigma A6279）（10 mg/ml）、磷酸酶抑制剂混合液2（Sigma, P5716）、磷酸酶抑制剂混合液3（Sigma, P0044）以及蛋白酶抑制剂混合液（Roche, 11836153001）。</li>
 <li>向每根离心管中加入一个5 mm钢珠，使用TissueLyser在50 Hz条件下匀浆5分钟，重复两次，每次间隔检查匀浆程度。</li>
 <li>用移液器将匀浆后的样品转移至新的2 ml离心管中，留下钢珠。</li>
 <li>在每份样品中加入10 μl Triton X-100，然后在4 °C下以13,000 × g离心30分钟。</li>
 <li>将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
 <li>使用BCA法测定蛋白浓度（图2）。</li>
 <li>将蛋白浓度调整至1 mg/ml。</li>
</ol>
3. 抗体验证
<ol>
 <li>准备蛋白样品（从合适的细胞系或组织中提取），进行 Western 印迹分析，并在 10% SDS-PAGE 凝胶上电泳。</li>
 <li>在 4 °C 条件下，将样品过夜转至硝酸纤维素膜上。</li>
 <li>使用 Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）在室温下封闭膜 1 小时。</li>
 <li>按照生产商推荐的稀释比例（通常为 1:1,000），用 Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）稀释一抗。</li>
 <li>在 4 °C 条件下，将膜与一抗孵育过夜。</li>
 <li>配制 0.1% PBS-Tween20（PBS-T；1 ml Tween20 / 1 L PBS）。</li>
 <li>在室温下用 PBS-T 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次）。</li>
 <li>用 Odyssey 封闭缓冲液（以 PBS 按 50:50 比例稀释）含 0.01% SDS，按 1:10,000 稀释比例（1.5 μl/15 ml）稀释荧光标记的二抗。</li>
 <li>在室温下，将膜与二抗孵育 45 分钟，并轻轻振荡；在最终扫描前，必须始终避免光照膜。</li>
 <li>在室温下用 PBS-T 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次），并保持膜处于避光环境中。</li>
 <li>在室温下用 PBS 洗涤膜 5 分钟（重复 3 次），以去除残留的 Tween20，过程中仍需保持避光。</li>
 <li>将膜平放在一张滤纸上，避光自然晾干；干燥膜可能增强信号并降低背景，但会使膜无法用于 stripping 和重新探查。</li>
 <li>使用 LiCor Odyssey 扫描仪扫描膜。在扫描完成前，始终保持膜处于避光状态。</li>
 <li>仅选择在正确分子量处产生单一主条带的抗体。图 3 展示了适用于 RPPA 的合格与不合格抗体示例。</li>
</ol>
4. RPPA 点样
<ol>
 <li>使用 MicroGrid II 机器人点样仪将蛋白质裂解液点样到硝酸纤维素包被的玻片（Fastslides-Whatman）上。所用玻片包含两个点样区域，每个区域点样相同的样本，本实验中为100个样本。其他可选规格包括1、8和16个点样区域的玻片。点样区域数量越多，每个区域可点样的样本数量就越少。</li>
 <li>对每个样本进行连续五次两倍稀释，每个稀释样本再以三复孔形式点样（每个样本共产生15个点样点）。</li>
</ol>
5. RPPA 蛋白质检测
<ol>
 <li>用过量的LiCor封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）润湿载玻片，在室温下于摇床上孵育1小时。</li>
 <li>按所需浓度，将800 μl一抗加入LiCor封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）中配制，并置于冰上保存。</li>
 <li>将载玻片安装至（i）单孔芯片夹或（ii）四孔“FastFrame”载玻片支架中，确保载玻片与孵育室之间形成紧密密封。</li>
 <li>吸除各孔中残留缓冲液，向相应孔中加入600 μl一抗溶液。</li>
 <li>将载玻片与孵育室放入密封湿盒中，于4 °C在摇床上过夜孵育。</li>
 <li>配制0.1% PBS-Tween20（PBS-T；100 μl Tween 20 加入100 ml PBS中）。</li>
 <li>从冷藏室取出载玻片，小心吸除各孔中的一抗溶液。</li>
 <li>加入600 μl PBS-T，在室温下于摇床上洗涤5分钟，重复3次（×3）。</li>
 <li>将荧光标记的二抗用Odyssey封闭缓冲液（按50:50比例用PBS稀释）含0.01% SDS的溶液稀释至1:2,000（首次使用建议为1 μl/2 ml）进行配制。</li>
 <li>吸除孔中缓冲液，向各孔加入600 μl荧光标记的二抗溶液。室温下避光轻柔振荡孵育45分钟；在最终扫描前，必须始终保护膜免受光照。</li>
 <li>吸除孔中二抗溶液，于室温下用600 μl PBS-T短暂洗涤3次（×3）。将载玻片从支架上取下，转移至合适的容器中，用过量PBS-T避光洗涤15分钟。</li>
 <li>吸除PBS-T，再用PBS在室温下洗涤膜15分钟，以去除残留的Tween-20，过程中仍需保持膜避光。</li>
 <li>将Fastslide置于50 °C烘箱中干燥10分钟，然后在Li-Cor Odyssey扫描仪上进行扫描。在扫描完成前，始终保持载玻片避光。</li>
 <li>根据所使用的二抗，选择在680 nm和/或800 nm波长下扫描载玻片。进行双色检测时，应始终使用高度交叉吸附的二抗以最小化交叉反应。双色检测需谨慎选择一抗和二抗，其中最关键的是两种一抗应来自不同宿主物种（e.g. 兔和小鼠），以便通过抗兔和抗小鼠的二抗进行区分，这些二抗应标记具有明显不同发射光谱的荧光染料。</li>
 <li>图像文件以.tiff格式保存。图4（扫描文件图像）。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
 <li>启动 MicroVigene 软件（VigeneTech，Carlisle，MA，USA）。</li>
 <li>打开包含 RPPA 芯片扫描图像的 .tiff 图像文件。</li>
 <li>选择一个预定义的模板文件，该文件将包含一个可叠加在 RPPA 芯片图像上的网格。</li>
 <li>点击 定义感兴趣区域（ROI）按钮，以调出网格。</li>
 <li>将网格定位在 RPPA 点样区域上。图6a（网格覆盖图像示例）。</li>
 <li>点击 全选 按钮以高亮所有 ROI。</li>
 <li>点击 查找全部。MicroVigene 将自动识别 ROI，定位点样斑点，扣除背景，去除灰尘颗粒，并对斑点进行定量分析。</li>
 <li>点击 查看稀释曲线 按钮，以显示 RPPA 芯片上所有样本的分析结果。</li>
 <li>点击 保存稀释数据。</li>
 <li>由于每个样本以三份重复形式在 5 个不同稀释梯度上打印，共产生 15 个数据点用于分析，从而降低了误差风险并提高了曲线拟合质量。MicroVigene 采用四参数 logistic-log 模型“超级曲线”算法（图6b），整合所有斑点数据生成反映抗原-抗体结合动力学的 S 形曲线。该方法假设每个样本点上均发生相同的抗体-抗原结合动力学，即使在不同样本之间亦如此；因此，利用芯片上所有斑点拟合一条共用响应曲线，可提高曲线拟合的可信度10,11 
 Y = a + ((b - a) / (1 + e^(c * d - ln(x)))) 
 其中 x 为稀释倍数，Y 为信号强度。 
 可通过 y0 值对样本进行比较分析，在本研究中，y0 表示将 x 值映射到超级曲线上后，其中间点对应的 y 值。</li>
 <li>将数据导出至 Microsoft Excel，并以 y0 值作图，如 图7 所示。</li>
 <li>在方差分析（ANOVA）框架下，分别计算未治疗患者与治疗后患者的瘤内蛋白变异度。通过 Mann-Whitney 检验（MWT）比较整合所有分析蛋白数据后的变异分布。对于单个蛋白的瘤内变异度，在满足正态性和方差齐性假设的前提下（分别通过 Lilliefors 检验和 Fligner 检验评估），采用 F 检验进行比较；同时应用错误发现率（FDR）校正12。针对每个蛋白，检验未治疗组与治疗组样本间的差异表达时，若满足正态性和方差齐性假设，则使用学生 t 检验，否则执行 MWT；FDR 校正应用于合并的 t 检验与 MWT 结果12。蛋白表达水平及其变异度的 Pearson 相关性显著性采用标准方法估算 [R reference]，并进行 FDR 校正12。</li>
</ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
<li>Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarker+discovery+through+the+parallel+integration+of+clinical+trial+and+functional+genomics+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets.</a> Genome Med. 2, 52(2010).</li>
<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter+and+intratumour+heterogeneity%3A+a+barrier+to+individualized+medical+therapy+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma.</a> Front. Oncol. 2, 49(2012).</li>
<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的反相蛋白微阵列（RPPA）方法是一种高通量的蛋白质分析技术，可作为广泛使用但通量相对较低的蛋白质印迹（Western blot）技术的替代方案。该方法能够对数百个样本进行半定量分析，并实现同时比较，从而直接评估多种细胞系和组织样本中关键蛋白质的表达差异。通过使用不同物种来源的抗体进行多重检测，可进一步提升该技术的检测能力，实现多种抗体的同时应用。本文展示的实例突出了RPPA在肿瘤异质性研究以及靶向治疗对异质性影响分析中的应用价值。
作为一种技术，反相蛋白微阵列（RPPA）包含多个关键步骤，其中抗体的选择至关重要。由于该技术具有点印迹（dot blot）的特性，在分析过程中无法确认抗体的特异性，因此必须在使用前完成验证。在本研究中，共对83种抗体进行了Western印迹验证，其中仅有58种通过验证（失败率约为30%）。在这58种抗体中，有55种在RPPA分析中获得了可接受的结果（成功率为95%）。其他关键步骤还包括选择用于在RPPA芯片上点样样本的蛋白浓度以及点样均匀性。较高的蛋白浓度可提高检测灵敏度，但可能因蛋白量不足而减少可点样的样本数量。能够提供足够蛋白用于RPPA点...

<table><tbody><tr><td>抑蛋白酶肽</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Triton-X</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor Odyssey 封闭缓冲液</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>MicroGrid II 机器人点样仪</td><td>Biorobotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastFrame' 四槽载玻片架</td><td>Whatman</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST 载玻片 - 双垫</td><td>Whatman</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Licor</td><td>926-68020</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr></tbody></table>

利用反相蛋白微阵列（rppa）技术探究个体肾细胞癌内蛋白质表达差异

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

目前，转移性透明细胞肾细胞癌尚无治愈性治疗方法，该类型是此疾病的最常见亚型。治疗耐药的一个关键因素被认为是疾病的分子复杂性1。靶向治疗药物如酪氨酸激酶抑制剂（TKI）舒尼替尼已被应用，但仅有40%的患者产生应答，且其中绝大多数患者在1年内复发2。因此，肾细胞癌患者中内在性与获得性耐药的问题具有重要意义3。
为了研究对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的耐药性，并最终开发出有效且个性化的治疗方案，需要在靶向治疗经过特定时间段后获取连续的组织样本，这一策略在慢性髓性白血病中已被证明是成功的4。然而，该策略在肾细胞癌中的应用受到肿瘤间和瘤内高度异质性的限制，这种异质性是肾细胞癌5,6以及其他实体瘤7的特征。即使在临床表现、肿瘤分期和分级相似的患者中，由于转录组和遗传差异所导致的肿瘤间异质性也已得到充分证实。此外，肾细胞癌（RCC）中存在显著的形态学（瘤内）异质性，这很可能反映了更为复杂的分子异质性。通过对肾细胞癌肿瘤进行形态学分析与Fuhrman分级相结合的详细绘图与分类，可筛选出具有代表性的区域用于蛋白质组学分析。
基于蛋白质的肾细胞癌（RCC）分析因其在病理学实验室中广泛可用而具有吸引力；然而，由于特异性抗体的供应有限，其应用可能面临问题8。由于反相蛋白质阵列（RPPA）具有点印迹的特点，抗体的特异性必须预先验证，因此所用抗体的严格质量控制至关重要9。尽管存在这一限制，点印迹格式仍可实现检测的小型化，从而能够在单张硝酸纤维素载玻片上打印数百个样本。打印后的载玻片可类似于Western印迹分析进行检测，使用靶标特异性的初级抗体和荧光标记的次级抗体，实现多重检测。通过比较荧光信号的相对强度，可同时分析载玻片上所有样本中蛋白质表达的差异，具有更高的成本效益和高通量优势。

在图4(i)中可以看到一张扫描后的RPPA芯片示例，其中同时显示了680 nm和800 nm两个通道。按波长分离图像后，图4(ii)可实现对RPPA芯片上每个点样区域的分析，并确定各个蛋白质的表达水平（图4(iii)）。如图4(iii)所示，不同样本中各蛋白质的表达模式具有特异性：Gelsolin在整个芯片上的表达水平较高，而cMYC的蛋白表达水平则明显较低，但仍可在所有检测样本中普遍检测到。相比之下，CD10表现出可变的表达模式，某些样本中表达水平较高，而其他样本中则几乎无法检测到表达信号。最后，pJAK2未能产生任何高于背景水平的可检测蛋白表达信号。从质量控制的角度来看，pJAK2的结果不可接受，而CD10的结果则可接受，因其在芯片上多个样本中检测到了明确的蛋白表达信号。图5展示了不同物种的一抗与二抗之间无交叉反应性的结果。用于计算单张RPPA芯片上各样本信号强度的Supercurve拟合曲线示例如图6所示。这些曲线用于生成基于相对...

反向蛋白相位阵列（RPPA）能够利用荧光标记的抗体，同时检测印迹在硝酸纤维素载玻片上的数百个样品的蛋白质表达水平。该技术已被应用于研究透明细胞肾癌中药物治疗反应的异质性。

利用反相蛋白微阵列（RPPA）技术探究个体肾细胞癌内蛋白质表达差异

目前尚无针对转移性透明细胞肾细胞癌的治愈性疗法，该类型是肾细胞癌中最常见的亚型。这一治疗难题的关键因素在于……

本实验的目的是利用反向蛋白芯片（RPPA）研究肾细胞癌中的蛋白质组表达差异。首先对单个肿瘤中的异质性区域进行定位和选择，第二步是从样本中提取蛋白质。接下来，将蛋白质进行标准化处理，并点样到反向蛋白芯片（RPPA）载玻片上。最后一步是使用针对目标蛋白质的抗体对载玻片进行分析。最终，RPPA用于展示肾细胞癌两种处理组之间蛋白质组表达的差异性变化。该方法有助于解答肾细胞癌领域中的一些关键问题。由于蛋白质具有高度异质性，该技术的意义在于可能对接受靶向治疗的肾细胞癌患者治疗产生积极影响。这是因为我们可以研究组织样本在治疗前后的异质性，从而有望为对这些治疗产生获得性耐药的患者鉴定出新的可靶向治疗靶点。展示冷冻切片机和H膝关节操作流程的是研究实验室经理Helen Caldwell，展示蛋白质提取技术的是我们团队的研究技术员Jo Nanda。展示手术室PPA打印的是来自圣安德鲁斯大学的同事Peter Mullen。开始此操作时，从负80摄氏度冰箱中取出肿瘤组织，并置于干冰上保存。将肿瘤组织分割成约一立方厘米大小的组织块。标记每块肿瘤组织的原始相对位置，并用唯一的名称进行标注。将样本包埋于OCT中，在样本染色后于-22摄氏度的恒冷切片机中进行切片。采用苏木精、伊红和DSN染色法，通过显微镜分析冷冻切片。确保切片为透明细胞肾细胞癌的可评估肿瘤，并将其分级为高级别、低级别或混合型高低级别。从每个肿瘤内形态学不同的区域中选择最多四个样本用于蛋白质提取，接下来将演示如何从肿瘤样本中提取蛋白质。取50至75毫克组织，从CT中切下后放入2毫升离心管中。加入990 µL裂解缓冲液，缓冲液中需添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂。每个离心管中加入一颗5 mm钢珠，以50赫兹频率匀浆5分钟。使用组织激光进行处理。检查匀浆程度，然后继续匀浆五分钟。用移液器将匀浆后的样品转移至新的2毫升离心管中，留下钢珠，每份样品加入10 µL Triton X-100，然后在4 °C条件下以13,000 ×g离心30分钟。将上清液（S）转移至新的微量离心管中，使用BCA法测定蛋白浓度。在进行PPA打印之前，将蛋白质浓度归一化至每毫升一毫克。每个样本进行连续五次两倍稀释。该实验步骤中最耗时的环节之一是完成数百次稀释，为确保成功，应在打印玻片前仔细核对。随后使用微阵列双通道机器人点样仪将蛋白质裂解液点样到硝酸纤维素包被的玻片上。每个样本设置三个重复，每个样本共产生15个点样点。本实验所用玻片包含两个点样区域，用于承载样本点样。每个样本垫上均点样相同的样品，本例中为100个样品。其他可选规格包括一个八垫和16垫的载玻片。垫片数量越多，每个垫片上可点样的样品数量就越少。开始进行蛋白质检测湿片实验时，加入过量封闭缓冲液，在摇床上室温孵育一小时。同时，将800微升一抗用封闭缓冲液稀释至所需浓度，并置于冰上保存。完成一小时封闭后，将玻片安装至单孔框架夹具或快速框架四孔玻片架中，确保玻片与孵育腔室之间形成严密密封。从孔中移除残留缓冲液，并向各孔中加入600微升一抗。将玻片和染色盒放入密封的湿盒中，于4摄氏度摇床孵育过夜，次日早晨从冷藏室中取出玻片。小心地从每个样本上去除一抗。每个孔加入600 µL的0.1% PBS（即PBST），在室温下于摇床上孵育5分钟以洗涤载玻片。随后，用新鲜的PBST替换原有的PBST，重复此洗涤步骤。总共洗涤载玻片三次。移除各孔中的缓冲液，并向相应的孔中加入600微升适当稀释的荧光标记二抗。在室温下轻轻振荡孵育45分钟，孵育过程中需注意避光，直至扫描前均应保护膜免受光照。孵育45分钟后，移除孔中的二抗，于室温下用600微升PBST短暂洗涤三次。将玻片从载片架上取出，转移至合适的容器中，在过量PBST中洗涤15分钟。整个过程需避光操作。去除 PBST，并用 PBS 在室温下洗涤膜 15 分钟，再次去除残留的吐温 20，期间保持膜避光。将载玻片置于 50 摄氏度的烘箱中烘干 10 分钟。最后，根据所使用的二抗，以 680 纳米和/或 800 纳米波长扫描载玻片。在扫描前务必避光保存切片。将图像保存为 T 文件。本图展示了扫描后的 RPPA 切片示例，同时呈现了 680 和 800 纳米两个通道。按波长分离图像可实现对反相蛋白微阵列（RPPA）芯片上每个点样区域的分析，并确定各个蛋白质的表达水平，如图所示。不同样本中各蛋白质的表达模式具有特异性：gel soin 在整张芯片上表现出较高的表达水平，而 cmic 的蛋白质表达水平则明显较低，但在所有检测样本中仍呈普遍表达。相比之下，CD 10 的表达具有变异性，某些样本表现出高水平表达，而其他样本则几乎检测不到或无表达。最后，p JK two 未能产生任何高于背景水平的可检测蛋白表达。下一张图突出显示了二抗与另一物种的一抗之间不存在交叉反应性。左下角的图像显示了使用在680纳米正确波长下扫描的二抗检测蛋白表达的结果。在右侧图像中，于800纳米的错误波长下扫描时未检测到蛋白质表达。此处显示了用于RPPA芯片上所有样本比较分析的超曲线示例。在分析软件中，绿色斑点代表可接受的斑点，红色斑点则代表基于预设阈值的异常值。超级曲线用于生成基于蛋白质的相对表达数据。该图展示了代表性蛋白质mlh1在三张反相蛋白微阵列（RPPA）芯片上的表达水平，突出显示了RPPA能够检测处理组与未处理组样本之间的差异。此处每个样本对应一个肿瘤亚区域。下图显示了根据治疗情况对样本分组后，mlh1 的差异性蛋白表达。当计算治疗前后样本中 mlh1 表达的瘤内变异时，发现治疗前组的 MLH1 表达水平更高。在根据治疗情况对样本进行分组后，治疗后样本中观察到更高的变异度。观看本视频后，您应能充分理解如何利用PPA研究蛋白质异质性。

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