Citrobacter rodentium 小鼠模型：研究病原体与宿主在感染性结肠炎中的作用

本实验的总体目标是通过用革兰氏阴性镜像病原体 Citrobacter rodentium 感染小鼠以诱导结肠炎，从而研究胃肠道内病原体与宿主之间的相互作用。该过程首先将 Citrobacter rodentium 培养物在零赎复培养基中过夜接种。第二步，通过口服灌胃将过夜培养的接种物感染小鼠。

随后在感染后第七天，进行最后一步操作，收集盲肠、结肠及肠腔内容物。将组织进行平板培养，计数细菌菌落，并对组织进行免疫染色以检测宿主目标蛋白。最终可通过免疫组织化学方法评估病原体载量、屏障功能、组织学损伤以及宿主反应的变化。

尽管该方法为研究传染性结肠炎提供了可靠的模型，可用于分析宿主与病原体之间的相互作用及免疫应答，但它也可被改进以探究细菌感染对结肠癌发生风险的影响。通常情况下，初次接触该方法的研究人员在进行小鼠细菌感染操作时可能会遇到困难。首先，使用无菌接种环从冻存的甘油菌种中蘸取有活性的 C redemption，然后在 LB 琼脂平板上划线接种。

在37摄氏度下过夜培养后，使用接种环将LB平板上的菌落转移至3毫升无菌LB肉汤中。接着，将ERO Dunum菌种在37摄氏度下于台式恒温摇床中以200 RPM的速度进行需氧培养过夜。次日早晨，接种后的LB肉汤应呈现浑浊状态。

轻轻振荡培养物以均匀分散细菌培养液，然后用1 mL注射器吸取培养基，并将其连接到胃灌注针上。通过用手指牢固地抓住小鼠颈部和背部的松散皮肤来选择一只小鼠进行灌胃。接着用食指向后拉动物的头部，以固定其头部并拉直食管，便于插入。

将小鼠保持直立姿势，将灌胃针的 bulb 端沿动物口腔侧边送入，并越过其舌头。轻柔地将针头沿动物口腔顶部向后推进，进入食道。最后，用注射器缓慢注入 100 µL 细菌接种物，然后轻柔地取出灌胃针。

将小鼠放回笼中后，在检测当天监测其呼吸频率和行为表现，按前述方法抓住小鼠颈背部皮肤固定，然后以150 µL新鲜配制的fitzy dextrin进行灌胃。灌胃后4小时移除笼内食物，随后对动物实施镇静。采用心脏穿刺法尽可能采集麻醉动物的血液。

将血液加入终浓度为3%的酸性柠檬酸葡萄糖（acid citrate dextrose）的微量离心管中，以防止凝固。接着，在4°C条件下以1000 × g离心12分钟。然后收集血清，并用PBS将每份样品各取100 µL稀释至1:10和1:100。

将上述两种稀释液分别以复孔形式加入96孔板中。为制备标准曲线，取100微升原液（80毫克/毫升）样品，在避光微量离心管中用PBS稀释，用于小鼠灌胃的Fitz葡聚糖。

然后将标准样品以每组三个复孔的方式加入96孔板中。接着使用荧光计定量每个样品的荧光强度，并利用无菌技术测定FXI葡聚糖浓度；开始此步骤时，向底部为圆底的2毫升离心管中加入1毫升无菌PBS和一颗经高压灭菌的金属珠。然后称量每个离心管的重量。

接下来，在取出小鼠的回肠和结肠后，将回肠与结肠分离，并沿纵轴切开。用镊子收集肠腔内容物，并将内容物加入含有PBS的离心管中。用无菌PBS清洗回肠和结肠组织，然后分别放入不同的离心管中。

现在称量组织管，并使用珠磨机均质样品，持续六分钟。在30赫兹下，向96孔板的每个孔中加入180微升无菌PBS。然后向每行的第一个孔中加入20微升各均质样品，并充分混匀。

通过从每个前一个孔中加入20微升样品进行连续稀释，使第一孔的稀释度为10的负一次方，依次稀释至10的负六次方。然后将每个样品各稀释液10微升，分别取三份（每份三重复）接种于带网格的方形LB平板上，在37摄氏度过夜培养后，计数其中一个平板上的菌落形成单位。

取每个样本的三个重复值的平均值，然后记录每个样本计数时的稀释倍数。将平均菌落形成单位（CFU）乘以50，再乘以样本计数时的稀释倍数，得到每毫升的CFU数。最后，除以组织重量，计算经过过夜、正式固定及之前保存的0.5厘米结肠和盲肠切片的每克组织中的CFU数。

第二天早晨，用70%乙醇洗涤组织，放入包埋盒中，送至组织学实验室进行石蜡包埋，并用苏木精和伊红染色以观察组织病理变化。将切片置于65摄氏度水浴中的 Coplin 染色缸内孵育10分钟。随后，将切片放入二甲苯中，每次清洗2分钟，共清洗四次。

将载玻片依次用两次五分钟的100%乙醇洗涤，随后在以下溶液中各洗涤一次，每次五分钟：95%乙醇、75%乙醇和蒸馏水。将洗涤后的载玻片放入盛有预热的柠檬酸钠缓冲液的共聚焦染色缸中，室温静置30分钟后，再将染色缸置于蒸锅中加热30分钟，随后用PBS漂洗三次，每次五分钟。

当载玻片干燥后，用防水标记笔在组织周围画圈。然后在室温下，于免疫染色湿盒中用封闭缓冲液封闭组织。一小时后，倾去封闭缓冲液，加入50至100微升一抗，4摄氏度孵育过夜。

孵育结束后，用含叠氮化钠的 PBS 缓冲液清洗组织三次，每次五分钟。随后，在避光条件下室温孵育一小时，将切片置于 50 至 100 微升的二抗溶液中，再用蒸馏水清洗切片三次，每次五分钟。最后，对组织进行脱水处理，滴加抗荧光淬灭封片剂（如 ProLong Gold 封片液），盖上盖玻片，然后在荧光显微镜下观察切片。

该图显示了在 C57BL/6 小鼠血清中检测到的 Fitz 葡聚糖，以及在 Toll 样受体敲除小鼠中的检测结果；先前研究发现，在肠道上皮屏障完整的情况下，这些敲除小鼠在感染期间表现出上皮屏障完整性的损伤。ZI 葡聚糖难以透过此屏障层。因此，血清中 Fitz 葡聚糖水平升高提示在感染期间肠道上皮屏障完整性受损，导致该分子渗漏；而未感染小鼠的血清水平则作为对照。

还展示了使用Fitz葡聚糖进行灌胃的方法。Assent是一种管腔内病原体，可紧密黏附于肠上皮细胞。感染后第七天，可检测管腔内容物、回肠及结肠组织中的细菌载量。

结肠中的细菌载量通常在每克10的9次方CFU左右达到峰值。在感染后第7天，C57BL/6小鼠的C. DUM感染所导致的大部分病理变化在宏观上表现为结肠远端两厘米区域。感染期间通常可观察到结肠黏膜增厚，以及结肠缩短和长度变化。

57只C57BL/6小鼠仅表现出轻度至中度的炎症和病理变化，其组织学特征为免疫细胞浸润、结肠隐窝延长以及杯状细胞减少。为进一步表征宿主在感染过程中产生的应答，可采用免疫荧光染色技术，以检测目标蛋白的变化，例如细胞增殖标志物，或用于分析细菌应答的某些特征，如细菌在感染组织中的定位情况。本图展示了该染色技术的一个示例：在感染后第12天，检测宿主蛋白KI67（细胞增殖标志物，显示为红色）以及沙门菌蛋白FliC（显示为绿色），以分析细菌的定位情况。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在数分钟内完成。在实施该操作时，必须正确执行接种技术，以确保小鼠成功感染，并在感染过程中持续监测动物的健康状况。近10至15年来，柠檬酸杆菌小鼠模型已成为研究附着-破坏型细菌病原体（如肠致病性大肠杆菌EPEC）的金标准模型。

此外，它已成为研究黏膜对细菌免疫反应的公认模型，例如肠道内 TH 17 反应的形成。