Name: “枸橼酸rodentium鼠标产品型号：研究感染性结肠炎的病原体和宿主的贡献 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解使用枸橼酸杆菌感染小鼠诱导结肠炎的实验方法，通过口服灌胃和免疫组织化学技术评估病原体负荷、屏障功能及组织病理学变化，为研究肠道感染免疫机制提供可靠模型。

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本研究得到了加拿大克罗恩病和结肠炎基金会（CCFC）及加拿大卫生研究院（CIHR）向 BAV 提供的运营资助。GB 获得了 CIHR 研究生奖学金的资助。BAV 担任儿童肠道与肝脏疾病（CHILD）基金会小儿炎症性肠病研究讲席及加拿大研究讲席小儿胃肠病学教授。

1. 准备 柠檬酸杆菌 rodentium 接种物制备与小鼠口服灌胃
<ol>
 <li>制备LB（Luria Bertani）培养基并进行高压灭菌。</li>
 <li>从冻存的甘油菌种中取出有活性的 C. rodentium，使用无菌接种环或移液器吸头将其划线接种至LB琼脂平板上。于37 °C培养过夜。用接种环或移液器吸头挑取LB平板上的菌落，接种于含3 ml无菌LB液体培养基的Falcon培养管中。接种物的制备过程应采用无菌操作技术。</li>
 <li>将 C. rodentium 培养物置于37 °C恒温摇床中，以200 rpm振荡培养过夜，进行需氧培养。经 overnight 培养后，接种的LB液体培养基应呈现浑浊状态。</li>
 <li>使用连接1 ml注射器的球状头胃饲针，对每只小鼠进行100 μl过夜培养的 C. rodentium 菌液灌胃。操作时，用拇指和手指牢固抓住小鼠颈背部松弛的皮肤，轻轻固定其颈部；用食指向后轻拉小鼠头部，使其头部固定并伸直食道，以便插入胃饲针。</li>
 <li>保持小鼠直立姿势，将胃饲针的球状头沿其口腔侧边滑入，并越过舌面。轻柔地将针头沿上颚推进，进入食道。若在操作过程中感到阻力，应立即退出胃饲针并重新插入。</li>
 <li>缓慢注入100 μl细菌接种液，然后轻柔地取出胃饲针。将小鼠放回笼盒后，密切观察其呼吸频率和行为表现。</li>
</ol>
注意事项：
<ul>
 <li>在步骤 2 和 3 中，还需使用无菌技术准备一支含有 3 ml 无菌 LB 肉汤的 Falcon 培养管，过夜培养以确保肉汤本身无细菌污染。LB 肉汤在过夜培养后应保持澄清。</li>
 <li>在步骤 4 进行灌胃前，应轻轻振荡 Falcon 管中的培养物，以确保每只小鼠接受等量的细菌剂量。</li>
 <li>若过夜培养接种时间超过 24 小时，则应弃置该培养物。</li>
 <li>所有 C. rodentium 感染操作及感染动物的饲养均应在生物安全二级（Biosafety Level 2）设施中进行。</li>
</ul>
2. 测定C. rodentium感染小鼠结肠上皮屏障通透性
<ol>
 <li>在感染后的预定时间点测定屏障完整性。</li>
 <li>在检测当天，配制足够量的4 kDa荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖，用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解至浓度为80 mg ml-1，用于每只小鼠灌胃150 μl，并用于制备标准曲线。</li>
 <li>用手固定小鼠颈部皮肤，进行150 μl FITC-葡聚糖灌胃。此时从小鼠笼中移除食物。</li>
 <li>灌胃后4小时将小鼠麻醉，并通过心脏穿刺尽可能采集血液（约450 μl）。将血液加入含终浓度为3%酸性柠檬酸葡萄糖的微量离心管中，以防止凝固。处死小鼠，并将结肠组织分别置于PBS中用于细菌计数（步骤3.1 - 3.5），以及置于10%福尔马林中用于组织固定，最终进行免疫荧光染色（步骤4.1 - 4.8）。</li>
 <li>将血液样本在4 °C下以1,000 × g离心12分钟。收集血清，并用PBS稀释至1/10和1/100。将每个样本在这两个稀释度下的100 μl等分试样以复孔形式加入96孔板中。</li>
 <li>为制备标准曲线，将用于灌胃小鼠的原始80 mg ml-1 FITC-葡聚糖用PBS稀释成以下浓度：800、400、200、100、50、25、12.5、6.25和0 μg/ml。将每种浓度的溶液各100 μl以三复孔形式加入96孔板中。</li>
 <li>使用荧光计在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定各样品的荧光强度。</li>
 <li>通过绘制标准曲线分析原始数据。将每个样品的原始数据代入由标准曲线生成的直线方程，以确定各样品中FITC-葡聚糖的浓度。</li>
</ol>
注意事项：
<ul>
 <li>从第4步开始，将血液样本置于冰上并尽量减少光照暴露。</li>
 <li>在检测上皮屏障完整性时，选择感染后7天内或7天前的时间点为最佳，因为此后将发生严重的组织损伤。在严重损伤发生前检测屏障完整性，可使您确定不同小鼠品系在 C. rodentium 感染期间通透性的最大差异。</li>
 <li>确保同时检测未感染的对照组小鼠的上皮屏障完整性。</li>
</ul>
3. 测定C. rodentium感染小鼠组织中的细菌载量
<ol>
 <li>采用无菌操作技术，向一个圆底的 2 ml 离心管中加入 1 ml 无菌 PBS 和一颗已灭菌的金属珠。从每只动物采集的独立组织样本应分别放入不同的 PBS 管中。在加入组织前，先称量各离心管的质量。</li>
 <li>从小鼠体内取出盲肠和结肠。将盲肠与结肠分离，并用镊子挤出肠腔内容物，将内容物加入 PBS 管中。从远端结肠和盲肠各截取 0.5 cm 的组织段用于 10% 甲醛固定后，将剩余的结肠和盲肠沿纵轴剪开，并用无菌 PBS 冲洗，再将组织放入离心管中。</li>
 <li>称量加入组织后的 PBS 管质量，然后使用珠磨匀浆器在 30 Hz 条件下匀浆 6 分钟。</li>
 <li>采用无菌操作技术，向 96 孔板的每个孔中加入 180 μl 无菌 PBS。将每种匀浆样本各取 20 μl 加入每行的第一个孔中。充分混匀后进行连续梯度稀释，从每个前一孔中取 20 μl 加入下一孔，获得从 10-1（第一孔）到 10-6 的系列稀释液。将每个样本各稀释度的 10 μl 分别以每稀释度三重复点样于带网格的方形底 LB 培养皿上。在 37 °C 下培养过夜。</li>
 <li>计数菌落形成单位（CFU），取三个重复孔的平均值，并记录每个样本计数时对应的稀释倍数。将平均 CFU 值乘以 50（因原始 1 ml 样本中取了 20 μl），再乘以计数时对应的稀释倍数，得到 CFU/ml。最后除以组织重量，计算出 CFU/g。</li>
</ol>
4. 感染结肠组织的组织学评估与免疫荧光染色
<ol>
 <li>按照步骤3.2收集组织。将组织在福尔马林中固定过夜，然后用70%乙醇洗涤。将组织包埋于石蜡中，并切取5 μm厚的切片用于染色。使用苏木精和伊红进行组织学评估，并按以下步骤进行免疫荧光染色。</li>
 <li>染色前进行脱蜡处理：将载玻片放入科柏林染色缸中，置于65 °C水浴中10分钟。随后将载玻片依次浸入二甲苯中，每次2分钟，共洗涤四次。接着用100%乙醇洗涤两次，每次5分钟，再依次在95%乙醇、75%乙醇和dH2O中各洗涤5分钟。上述操作应在通风橱中进行，以避免接触有害蒸气。</li>
 <li>将载玻片放入盛有预热的柠檬酸钠缓冲液的科柏林染色缸中，然后置于蒸锅中加热30分钟，之后静置冷却30分钟。该步骤可破坏福尔马林固定所形成的蛋白质交联，从而暴露潜在的抗原位点。</li>
 <li>用含叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤5分钟，重复三次。擦干载玻片，并使用PAP笔在组织周围画圈，形成疏水屏障，使染色试剂局限于组织区域。</li>
 <li>在免疫组化湿盒中，室温下用封闭缓冲液（e.g. α-山羊血清）封闭组织1小时。</li>
 <li>使用抗体稀释缓冲液将一抗稀释至所需浓度。吸去封闭液，向组织上加入50–100 μl一抗。4 °C孵育过夜，或室温孵育2小时。</li>
 <li>用含叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤5分钟，重复三次。向组织上加入50–100 μl用抗体稀释缓冲液稀释的二抗，室温避光孵育1小时。再用dH2O洗涤5分钟，重复三次。</li>
 <li>脱水载玻片，滴加DAPI Prolong Gold封片剂，盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察载玻片。</li>
</ol>
注意事项：
<ul>
 <li>从第4步开始，为防止洗涤液中细菌生长，可用新鲜配制的PBS替代含叠氮化钠的PBS。</li>
</ul>

<ol><li>Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).</li>
<li>Cario, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+in+Inflammatory+Bowel+Diseases%3A+A+Decade+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).</li>
<li>Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Inflammatory Bowel Disease.</a> Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Luperchio, S., Schauer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+Citrobacter+rodentium+and+transmissible+murine+colonic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia.</a> Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).</li>
<li>Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+host+responses+to+enteric+bacterial+pathogens%3A+a+balancing+act+between+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance.</a> Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).</li>
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<li>Dennis, A., Kudo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p50+subunit+of+NF-%CE%BAB+is+critical+for+in+vivo+clearance+of+the+non-invasive+enteric+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).</li>
<li>Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+signalling+plays+a+critical+role+in+host+defence+by+controlling+pathogen+burden+and+promoting+epithelial+cell+homeostasis+during+Citrobacter+rodentium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).</li>
<li>Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signaling+mediated+by+MyD88+is+required+for+a+protective+innate+immune+response+by+neutrophils+to+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium.</a> Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).</li>
<li>Bry, L., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+T+cell+dependent+serum+antibody%2C+but+not+the+gut-associated+lymphoid+tissue%2C+for+surviving+acute+mucosal+infection+with+Citrobacter+rodentium%2C+an+attaching+and+effacing+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).</li>
<li>Simmons, C. P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4%2B+T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li>
<li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and%2For+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+%26+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠的感染性疾病和结肠炎提供了有价值的模型。该独特模型可用于表征宿主反应以及细菌的致病特性。本方案中概述的步骤详细说明了该模型的成功应用。
在诱导结肠炎及分析反应时，本方案中有若干关键步骤需要注意。首先，必须使用LB肉汤新鲜制备过夜的C. rodentium接种物，以确保小鼠感染成功。由于大多数小鼠品系需要108-109个微生物的剂量才能建立感染，若接种物在摇床或室温下长时间放置，培养物中存活的微生物数量将不足以在感染后诱发结肠炎。此外，在将细菌接种物装入注射器前必须充分振荡混匀，以确保每只小鼠接受等量的细菌。在感染结束时采集组织样本时，必须将结肠组织完全浸没于足量的10%福尔马林溶液中，以实现充分的组织固定。建议将组织置于5 ml小瓶中固定，而非微量离心管，因推荐固定液体积与组织体积之比为10:1。充分固定对后续的组织学分析以及这些组织的免疫荧光染色至关重要。还需注意，不同的基因敲除小鼠品系在诱导C. rodentium结肠炎时可...

肠道致病菌感染会引发胃肠道（GI）炎症以及肠道病理学和生理学改变，包括腹泻和肠道上皮屏障功能障碍。尽管细菌病原体在宿主胃肠道内定植的毒力机制，以及宿主抵抗此类感染的特异性应答机制尚不完全清楚，但近年来在模拟肠道细菌感染方面的进展已开始促进我们对这些过程的理解。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）是两种病因未明的复杂疾病，其特征为慢性肠道炎症和组织损伤。目前存在多种小鼠肠道炎症模型，包括通过基因修饰品系（如 IL10 -/- 小鼠）自发产生的炎症模型，以及使用化学物质（如葡聚糖硫酸钠（DSS）和二硝基苯磺酸（DNBS））诱导的化学刺激模型1。有假说认为，IBD 患者体内存在的失调性慢性炎症反应，是在遗传易感个体中，肠道黏膜免疫系统异常接触肠道细菌后所引发的2，因此对感染性结肠炎模型的研究也为明确针对肠道细菌的潜在致病性宿主反应提供了重要机会。Citrobacter rodentium 诱导的结肠炎是少数已被充分表征的感染性结肠炎模型之一1,3，可用于分析宿主对肠道细菌的应答，并进一步理解 IBD 发病机制的潜在途径；这是开发新型预防和治疗策略的关键步骤。
C. rodentium 是一种革兰氏阴性、具有附着和抹除（A/E）效应的鼠类特异性细菌病原体，与重要的人类病原体肠致病性大肠杆菌密切相关 E. coli （肠致病性大肠杆菌，EPEC）和肠出血性大肠杆菌 E. coli （肠出血性大肠杆菌）3-8A/E类病原体家族紧密附着于盲肠和结肠上皮细胞的顶端宿主细胞膜，于宿主细胞上形成一种非侵袭性的、类似 pedestal 的结构。经口服攻击后 C. rodentium 10 中的8-109 生物体产生一种感染性结肠炎的稳健模型，其特征为结肠增生或隐窝延长、单核免疫细胞浸润以及杯状细胞减少3,4感染后数小时内，最初的定植部位为盲肠斑，随后在感染2至3天后进展至远端结肠。3在免疫功能正常的小鼠品系中，病原体的清除通常在感染后3至4周内完成。1,3,4然而，许多基因改造菌株， 即 基因缺陷型或基因敲除（-/-）小鼠被发现对感染的易感性增加，导致损伤加重和/或慢性感染与炎症9-14在这些缺乏天然免疫信号蛋白的基因敲除品系中，利用该感染性结肠炎模型对于揭示多种在肠道感染和炎症消退过程中起关键作用的宿主蛋白至关重要。

<table><tbody><tr><td>Luria肉汤</td><td>ABM</td><td>G247</td><td>将25 g LB培养基粉末加入1 L水中，使用前进行高压灭菌。</td></tr><tr><td>带网格的平底板</td><td>Fisher</td><td>08-757-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon培养管</td><td>Sarstedt</td><td>62.515.006</td><td></td></tr><tr><td>球头胃饲针</td><td>Fine Science Tools</td><td>18060-20</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Fisher</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16.1</td><td></td></tr><tr><td>酸性柠檬酸葡萄糖</td><td></td><td></td><td>20 mM 柠檬酸，110 mM 柠檬酸钠，5 mM 葡萄糖</td></tr><tr><td>黑色96孔板 </td><td>Fisher</td><td>07-200-762</td><td></td></tr><tr><td>金属珠（5 mm）</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Fisher</td><td>5F93-4</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 小瓶</td><td>DiaMed</td><td>STK3205</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Fisher</td><td>H345-23</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Fisher</td><td>E511-100</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>HC700-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>考普林染色缸</td><td>VWR</td><td>47751-792</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠缓冲液</td><td></td><td></td><td>10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0</td></tr><tr><td>防蜡笔</td><td>Cedarlane</td><td>Mu22</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G902-3</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>SZ002</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td></td><td></td><td>2% 山羊血清，1% BSA，0.1% Triton X-100，0.05% Tween 20，0.05% 叠氮化钠，0.01 M PBS，pH 7.2，混合 &amp;& 储存于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>抗体稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.1% Triton X-100，0.1% BSA，0.05% 叠氮化钠，0.04% EDTA</td></tr><tr><td>封闭缓冲液 &amp;和用于 tir 的抗体稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>与上述配方相同，但不添加去垢剂（Triton X-100 和 Tween 20）</td></tr><tr><td>含DAPI的Prolong Gold抗荧光淬灭试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12.54SE</td><td></td></tr><tr><td>台式孵育摇床</td><td>Barnstead 实验室线</td><td>Max Q4000</td><td></td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor2D</td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>蒸锅</td><td>Black & Decker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>蔡司</td><td>Axio Image.Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

citrobacter rodentium 小鼠模型：研究病原体与宿主在感染性结肠炎中的作用

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

本方案概述了建立感染性疾病和结肠炎可靠模型所需的步骤，以及用于表征小鼠感染Citrobacter rodentium的方法。C. rodentium是一种革兰氏阴性、小鼠特异性的细菌病原体，与临床上重要的致病性大肠杆菌（enteropathogenic E. coli）和肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli）密切相关。免疫功能健全的小鼠在感染C. rodentium后，会出现轻微且短暂的体重下降和腹泻。组织学上可观察到肠道隐窝延长、免疫细胞浸润以及杯状细胞减少。感染通常在3至4周后被清除。通过在感染后的不同时间点测定肠上皮屏障完整性、细菌载量和组织学损伤，可对易感小鼠品系进行表征。
细菌病原体在宿主肠道中定植的毒力机制，以及宿主防御此类感染的特异性免疫反应，目前仍不甚清楚。因此，C. rodentium 作为肠道细菌感染的模型，为我们理解这些过程提供了重要的研究工具。肠道细菌还与炎症性肠病（IBD）相关。有假说认为，在具有遗传易感性的个体中，肠道黏膜免疫系统对肠道细菌的异常暴露，可能导致IBD患者出现适应不良的慢性炎症反应。因此，对感染性结肠炎模型的研究在阐明宿主对肠道细菌潜在致病性反应方面具有重要意义。C. rodentium 诱导的结肠炎正是这样一种罕见的模型，可用于分析宿主对肠道细菌的免疫反应，进一步揭示IBD发病机制的潜在途径，这对于开发新型预防和治疗策略至关重要。

在标准感染实验中，通过灌胃方式给予小鼠约 2.5 × 108 CFU 的 100 μl 过夜培养的 C. rodentium 菌液以建立感染。C57BL/6 小鼠感染 C. rodentium 后通常表现为轻度且短暂的体重下降和腹泻。尽管在 C57BL/6 小鼠中严重病情较为罕见，但个别动物仍可能发病并需要实施安乐死。因此，应密切监测小鼠的体重下降程度以及竖毛、蜷缩姿势等痛苦症状，以评估不同菌株对感染的敏感性差异。
图 1 至 4 所示结果代表了使用从冻存甘油菌种中复苏的过夜培养物进行感染的典型实验。感染后第7天，小鼠经麻醉后通过心脏穿刺采集血液。图 1 显示了在 C57BL/6 小鼠以及 Toll 样受体 2（TLR2）基因敲除小鼠血清中检测到的 FITC-葡聚糖水平；已有研究发现，TLR2 基因敲除小鼠在感染期间表现出肠上皮屏障完整性的受损9。在肠上皮屏障完整的情况下，4 kDa 的 FITC-葡聚...

Citrobacter rodentium 感染为研究小鼠肠道细菌感染、宿主免疫反应以及结肠炎提供了一个有价值的模型。本方案概述了屏障完整性的测定、病原体载量及组织学损伤的评估，从而能够全面表征病原体和宿主在小鼠感染性结肠炎中的作用。

Citrobacter rodentium 小鼠模型：研究病原体与宿主在感染性结肠炎中的作用

本方案概述了构建感染性疾病和结肠炎稳健模型所需的步骤，以及用于表征……的方法

本实验的总体目标是通过用革兰氏阴性模拟病原体鼠型柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，诱导结肠炎，从而研究胃肠道中病原体与宿主之间的相互作用。该目标通过以下步骤实现：首先，将鼠型柠檬酸杆菌在零代培养基中过夜培养；第二步，通过口服灌胃方式将过夜培养的菌液接种至小鼠体内。接下来，在感染后第七天，进行最后一步操作，收集盲肠、结肠及管腔内容物。将组织进行平板接种，计数细菌菌落，并对组织进行免疫染色，以检测目标宿主蛋白。最终，可通过免疫组织化学方法评估病原体负荷、屏障功能、组织学损伤以及宿主反应的变化。尽管该方法为感染性结肠炎提供了可靠的模型，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用及免疫应答，但它也可被改进用于探讨细菌感染对结肠癌风险的影响。通常，初次接触该方法的研究人员在进行小鼠细菌感染操作时可能会遇到困难，无论是否使用胃管。首先，使用无菌接种环从冻存的甘油菌种中蘸取有活力的C redemption，将其划线接种至LB琼脂平板上。在37摄氏度下过夜培养后，使用接种环将LB平板上的菌落转移至3毫升无菌LB肉汤中。接着，将ERO Dunum菌种在37摄氏度下于台式恒温摇床中以200 RPM速度进行需氧培养过夜。次日早晨，接种后的LB肉汤应呈现浑浊状态。轻轻振荡培养物以均匀分散细菌培养液，然后用1 mL注射器吸取培养液，并将其连接到胃灌注针上。通过用手指牢固抓住小鼠颈部和背部的松弛皮肤来选择一只小鼠进行灌胃。接着用食指向后拉小鼠头部，以固定其头部并拉直食管，便于插入。将小鼠保持直立姿势，将灌胃针的球形针头沿动物口腔侧边送入，并越过其舌头。轻柔地将针头沿动物口腔顶部向后推进，进入食道。最后，使用注射器缓慢注入 100 微升细菌接种液，然后轻柔地取出灌胃针。将小鼠放回笼中后，在检测当天监测其呼吸频率和行为表现，按前述方法抓住小鼠颈背部皮肤固定，然后以 150 微升新鲜配制的 fitzy dextrin 进行灌胃。灌胃后 4 小时撤走笼内食物，随后对动物实施镇静。通过心脏穿刺尽可能采集麻醉动物的全部血液。将血液加入终浓度为3%的酸性柠檬酸葡萄糖溶液中，置于微量离心管内以防止凝固。接着，在4°C条件下以1000 ×g离心12分钟。然后收集血清，并用PBS将每份样品各取100微升稀释至1:10和1:100。将这两个稀释度的样品以复孔方式加入96孔板中。为制备标准曲线，取100微升原液（80毫克/毫升）样品，在避光的微量离心管中用PBS稀释葡聚糖- FITC用于小鼠灌胃。然后将标准样品以每组三个复孔的方式加入96孔板中。接着使用荧光计定量每个样品的荧光强度，并采用无菌技术测定FXI葡聚糖浓度；开始此步骤时，向2毫升离心管的圆底中加入1毫升无菌PBS和一颗经高压灭菌的金属珠。然后称量每根离心管的重量。接下来，将小鼠的回肠和结肠取出后，分离回肠与结肠，并沿纵轴剪开。用镊子收集肠腔内容物，并将内容物加入含有 PBS 的离心管中。用无菌 PBS 清洗回肠和结肠组织，然后分别放入不同的离心管中。现在称量组织管，并使用珠磨机均质样品，持续六分钟。在30赫兹下，向96孔板的每个孔中加入180微升无菌PBS。然后向每行的第一个孔中加入20微升每种均质后的样品，并充分混匀。通过从每个前一个孔中取20微升加入后续孔中，对样品进行连续稀释，使第一个孔的稀释度为10的负一次方，依次稀释至最后一个孔的10的负六次方。然后将每个样品各稀释度的10微升分别取三份，点样于带有网格的方形LB平板上，37摄氏度过夜培养后，计数其中一个平板上的菌落形成单位。取每个样本的三个重复值的平均值，然后记录每个样本的计数稀释倍数。将平均菌落形成单位（CFU）乘以50，再乘以样本计数时的稀释倍数，得到每毫升的CFU数。最后，除以组织重量，计算在过夜、正式固定之前保存的0.5厘米结肠和盲肠组织切片每克组织中的CFU数。次日早晨，用70%乙醇清洗组织，放入包埋盒中，送至组织学实验室进行石蜡包埋，并用苏木精和伊红染色以对组织进行脱蜡。将切片置于共平面染色缸中，放入65°C水浴中孵育10分钟。随后，将切片放入二甲苯中，每次2分钟，共洗涤四次。每张切片用两次五分钟的100%乙醇洗涤，随后依次在以下溶液中各洗涤一次，每次五分钟：95%乙醇、75%乙醇和蒸馏水。将洗涤后的切片放入盛有预热柠檬酸钠缓冲液的共平面染色缸中，室温静置30分钟后，再将染色缸置于蒸汽器中加热处理30分钟。最后用PBS漂洗切片三次，每次五分钟。待玻片干燥后，用记号笔在组织周围标记区域。然后在室温下，于免疫染色湿盒中用封闭缓冲液封闭组织。一小时后，倾去封闭缓冲液，加入50至100微升一抗，4°C过夜孵育。孵育结束后，用含叠氮化钠的 PBS 缓冲液洗涤组织三次，每次五分钟。随后，在室温下避光孵育一小时，加入 50 至 100 微升二抗溶液，再用蒸馏水洗涤载玻片三次，每次五分钟。最后，将组织脱水，用抗荧光淬灭封片剂（ProLong Gold 封片剂）封片，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。此第一张图展示了在 C57BL/6 小鼠以及 TLR2 基因敲除小鼠的血清中检测到的 FITC-葡聚糖水平，后者此前已被发现，在感染期间即使存在完整的肠道上皮屏障，其屏障完整性仍受损。ZI 葡聚糖在此层中通透性较差。因此，血清中 FITC-葡聚糖水平升高提示感染期间肠道上皮屏障完整性受损，导致该分子渗漏；而未感染小鼠的血清水平可作为对照。还展示了使用Fitz葡聚糖进行灌胃的方法。Assent是一种管腔内病原体，可紧密黏附于肠上皮细胞。感染后第七天，可检测管腔内容物、回肠及结肠组织中的细菌载量。结肠中的细菌载量峰值约为每克 10 的 9 次方 CFU。在感染后第 7 天，C57BL/6 小鼠的 C. DUM 感染所导致的大部分病理变化在宏观上表现为结肠远端两厘米区域。感染期间通常可观察到结肠黏膜增厚，以及结肠缩短。C57BL/6小鼠仅表现出轻度至中度的炎症和病理变化，其组织学特征表现为免疫细胞浸润、结肠隐窝延长以及杯状细胞减少。为进一步表征宿主在感染过程中产生的应答，可采用免疫荧光染色技术，检测目标蛋白的变化，例如细胞增殖标志物，或分析细菌应答的某些方面，如细菌在感染组织中的定位。本图展示了一种免疫荧光染色示例，用于检测宿主蛋白KI-67（细胞增殖标志物，呈红色）和沙门菌蛋白FliC（呈绿色），以观察感染后第12天细菌的定位情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数分钟内完成。在实施该操作时，必须正确执行接种技术，以确保小鼠成功感染，并在感染过程中持续监测动物的健康状况。近10至15年来，柠檬酸杆菌小鼠模型已成为研究附着-破坏型细菌病原体（如肠致病性大肠杆菌EPEC）的金标准模型。此外，它已成为研究黏膜对细菌免疫反应的公认模型，例如肠道内TH 17反应的形成。

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免疫学与感染

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