“枸橼酸rodentium鼠标产品型号：研究感染性结肠炎的病原体和宿主的贡献

该程序的总体目标是通过用革兰氏阴性镜像病原体柠檬酸杆菌啮齿动物感染小鼠来诱导结肠炎，从而研究胃肠道中的病原体和宿主相互作用。这是通过首先接种来实现的，这是一种一夜之间零救赎的文化。在第二步中，用过夜接种物口服强饲法感染小鼠。

接下来在感染后第 7 天，在最后一步收集盲肠结肠和管腔内容物。对组织进行铺板，对细菌菌落进行计数，并对组织进行目标宿主蛋白的免疫染色。最终，可以通过免疫组织化学评估病原体负荷、屏障功能、组织学损伤和宿主反应的变化。

尽管这种方法提供了一个强大的感染性结肠炎模型，允许研究宿主病原体相互作用和免疫反应，但它也可以用于检查细菌感染对结肠癌风险的影响。通常，在刚接触这种方法的个体中，自然会与小鼠的细菌感染作斗争，使用或与量具作斗争。首先使用无菌接种环将冷冻甘油原液中的活 C 兑换划线到 LB 电镀上。

在 37 摄氏度下孵育过夜后，使用接种环将菌落从 LB 板转移到 3 mL 无菌 LB 肉汤中。接下来，在台式培养摇床中以 200 RPM 的转速在 37 摄氏度下用氧孵育 ERO Dunum 培养物过夜。第二天早上，接种的 lb 肉汤应该看起来浑浊。

轻轻搅拌培养物以均匀分布细菌细胞培养物，然后在 1 毫升注射器中加入肉汤并将其连接到胃管饲针上。用 fem 和手指牢牢抓住小鼠颈部和背部松弛的皮肤，选择一只老鼠进行管饲。然后用食指将动物的头部向后拉，以固定动物的头部并伸直食道以进行插入。

保持鼠标处于直立位置，将胃管饲针的球尖沿着动物嘴巴的侧面和舌头对准。轻轻地将针头沿着动物的口腔顶部穿过，然后将针头沿着食道向下推进。最后，使用注射器缓慢注射 100 微升细菌接种物，然后轻轻取出管饲针。

在放回小鼠后监测小鼠的呼吸频率和行为，在检测当天监测其笼子，如刚才所示给小鼠刮擦，然后用 150 微升新鲜制备的 fitzy 糊精管饲动物。此时从笼子中取出食物，灌胃后 4 小时，然后对动物进行镇静。使用心脏穿刺从麻醉动物身上收集尽可能多的血液。

在微量离心管中加入血液至终浓度为 3% 的柠檬酸葡萄糖以阻止凝血。接下来，将血样在 1000 奶酪和 4 摄氏度下旋转 12 分钟。然后收集血清，并在 PBS 中以 100 微升每个样品的速度将其稀释至 1 比 10 和 1 比 100。

在这两个位置稀释到 96 孔板中，一式两份。为了制备标准曲线，将原始 80 毫克/毫升的 100 微升样品稀释。Fitz Dextrin 用于在深色微量离心管中的 PBS 中灌胃小鼠。

然后将标准样品一式三份添加到 96 孔板中。然后使用荧光计定量每个样品的荧光并使用无菌技术测定 FXI 糊精浓度，通过加入 1 毫升无菌 PBS 和高压灭菌金属珠将底部圆化至两毫升离心管开始此步骤。然后称量每根试管。

接下来，从小鼠身上取出 seum 和 colon 后，将 seum 与结肠分开并纵向切开。用镊子收集管腔内容物，并将内容物加入 PBS 管中。用无菌 PBS 洗涤续集和结肠组织，然后将它们放入单独的试管中。

现在称量组织管，并使用微珠打浆器将样品匀浆 6 分钟。在 30 赫兹下，每孔向 96 孔板中加入 180 微升无菌 PBS。然后将 20 微升每种均质样品添加到每行的第一个孔中并充分混合。

通过从前每个孔中加入 20 微升来连续稀释样品，以获得从第一个孔中的 10 到负 1 到 10 到负 6 的稀释度。然后在 37 摄氏度下孵育过夜后，将每个样品中的每种稀释液一式三份接种在带有网格的方底 LB 板上。计算一个板上的菌落形成单位。

对每个样品的一式三份进行平均，然后记录每个样品计数时的稀释度。将平均 CFU 乘以 50 并计算样品的稀释因子，得到每毫升的 CFU。最后，除以组织重量以确定过夜后每克的 CFU，正式和固定先前保存的 0.5 厘米结肠和下肠切片。

第二天早上，用 70% 乙醇洗涤组织并放入盒中，送至组织学机构包埋在石蜡中，并用血红素和伊红染色以分离组织。将玻片放入 coplan 染色罐中，在 65 摄氏度的水浴中放置 10 分钟。现在，将玻片放入二甲苯中洗涤四次，每次 2 分钟。

每个玻片用两次 5 分钟的洗涤和 100% 乙醇再水化玻片，然后在以下每种容器中洗涤一次 5 分钟。95% 乙醇、75% 乙醇和蒸馏水。将洗涤后的玻片放入装有预热柠檬酸钠缓冲液的 coplan 罐中，然后将罐子放入蒸笼中 30 分钟，让罐子在室温下再放置 30 分钟后，用 PBS Zied 清洗玻片 3 次，每次 5 分钟。

当载玻片干燥后，用巴氏笔标记组织周围的区域。然后在室温下在免疫染色湿气室中用封闭缓冲液封闭组织。1 小时后，倒出封闭缓冲液，将组织在 4 摄氏度下放入 50 至 100 μL 一抗中孵育过夜。

孵育期后，用 PBS Azi 洗涤组织 3 次，每次 5 分钟。然后在室温下将玻片在 50 至 100 μL 二抗中避光孵育一小时后，用蒸馏水洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。最后，使组织脱水，用 dpi、延长的金封固剂覆盖载玻片，然后应用在荧光显微镜下观察载玻片的盖玻片。

第一个图显示了在 C 57 black 6 小鼠的血清中测量的 Fitz 糊精，以及从 toll 样受体到敲除小鼠的血清中测量的 Fitz 糊精，这些小鼠先前已被发现在存在完整肠上皮屏障的情况下，在感染期间表现出上皮屏障完整性受损。ZI 糊精通过这一层的渗透性很差。因此，血清中 Fitz 糊精水平的增加表明感染期间肠上皮屏障完整性受损，使该分子作为未感染小鼠的对照血清水平泄漏。

还介绍了含有 Fitz 糊精的 Gavage。Assent 是一种腔内病原体，可以紧密粘附在肠上皮细胞上。管腔内容物、后遗症和结肠组织中的细菌负荷可能在第 7 天。感染后。

已发现结肠中的细菌载量在每克 10 至第 9 个 CFU 左右达到峰值。在 C 57 PL 6 小鼠的 C DUM 感染期间观察到的大多数病理在感染后第 7 天肉眼可见地发生在结肠远端 2 厘米处。在感染期间通常会观察到结肠粘膜增厚，以及结肠的缩短和长度。

C 57 PL 6 只小鼠仅患有中度炎症和病理，其组织学特征是免疫细胞浸润、结肠隐窝伸长和细胞耗竭。为了进一步表征感染期间以零救赎安装的宿主反应，免疫荧光染色可用于检查目标蛋白质的变化，例如增殖标志物，或检查细菌反应的各个方面，例如其在感染组织中的定位。这种染色技术的一个例子是检查宿主蛋白 KI 67，一种以红色显示的细胞增殖标志物，以检查感染后第 12 天的细菌定位，以检查宿主蛋白 KI 67（以绿色显示）和零 de 蛋白撕裂（以绿色显示），以检查感染后第 12 天的细菌定位。

一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在几分钟内完成。在尝试此程序时，重要的是要正确执行测量技术，以确保小鼠被感染并在整个感染过程中监测动物的健康状况。在过去的 10 到 15 年里，柠檬酸杆菌啮齿动物模型已成为研究将面对的细菌病原体（如 epec）附着在地狱中的金标准。

此外，它已成为研究粘膜对细菌的免疫反应的公认模型，例如肠道内 TH 17 反应的发展。