利用黑色素瘤和鳞状细胞癌干细胞生成一种新型树突状细胞疫苗

本实验的总体目标是在免疫功能健全的宿主体内评估基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗的抗肿瘤免疫反应。该目标通过以下步骤实现：首先从异质性肿瘤细胞中分离出醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）高表达的阳性CSC；第二步，分离获得CSC来源的DC，并用肿瘤裂解物对其进行致敏，以制备疫苗。

接下来，将CSC裂解物脉冲的DC或TP-DC疫苗给予正常的同源免疫活性宿主。然后在最后一步中，评估C-S-C-T-P-D-C疫苗的保护性抗肿瘤效果。最终，可通过ELISA检测宿主T细胞和抗体介导的由C-S-C-T-P-D-C疫苗诱导的抗CSC免疫反应。

该项目汇集了癌症研究领域中两个最具前景的方向：癌症干细胞和肿瘤免疫治疗。我们的实验室是最早在实体瘤中发现癌症干细胞的研究团队之一。这些细胞是驱动肿瘤生长及转移的癌症“种子”。

今天您将看到一种利用免疫疗法特异性靶向这些肿瘤干细胞的新方法。我们使用一种称为醛脱氢酶的特定标志物，该标志物可通过Alde fluoro检测法进行检测。您将看到林刘医生和胡安·陶医生与周李博士共同开展工作。

我们希望通过靶向这些肿瘤干细胞，能够改善多种癌症患者的治疗效果。首先，将目标肿瘤细胞悬浮于ALOR检测缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后，将肿瘤细胞悬液除保留3毫升外，其余分别转移至各样品管中，并将四个12×75毫米的聚苯乙烯对照试管标记如下：未染色对照、ALOR、ALOR加DEAB以及7AAD。向未染色对照管和7AAD管中各加入1毫升细胞悬液，向ALDEFLUOR管中加入2毫升细胞悬液。

然后向 ALOR 加 DEAB 管中加入 5 µL 的 DEAB。将各管置于冰上，随后向 alor 管中加入 10 µL 激活的 alor 底物。立即取 1 mL 底物溶液转移至 ALOR 加 DEAB 管中，然后每 100 万细胞向各样品管中加入 2 µL 激活的 alor 底物。

将所有试管置于37摄氏度水浴中孵育30分钟，然后向7 A a D管中加入5微升7 a a d，向每个样本管中每100万个细胞加入1微升7 A a d。将这些试管在4摄氏度下静置10分钟。所有试管在室温下以250 × g离心5分钟，并将沉淀重悬于Alde Fluor检测缓冲液中，用于荧光激活细胞分选。

为设置分选门，使用含DEAB的ALDEFLUOR处理的细胞作为阴性对照，以及七AAD染色的细胞作为活力对照。根据这些对照，建立分选门以区分ALDH阳性、CD5高表达及SCC7阳性细胞。然后利用此分选门将待测细胞分选为ALDH阳性、CD5高表达及SCC7阳性细胞群。

首先从C57BL/6小鼠和C3H小鼠中分离出股骨和胫骨。将骨骼在75%乙醇中室温下消毒一分钟，然后用HBSS洗涤。接着剪去骨骼两端，使用装有21号针头的10毫升注射器将骨髓冲洗至培养皿中，反复吹打细胞数次以制成单细胞悬液，然后离心收集细胞。

将沉淀物置于5毫升红细胞裂解缓冲液中，在37摄氏度水浴中孵育1分钟。计数细胞后，用补充有G-M-C-S-F和IL-4的培养基调整细胞浓度至1×10⁶个细胞/毫升。然后在37摄氏度和5% CO₂条件下培养细胞，并在3天后更换培养基和细胞因子。

第五天，收获未成熟的树突状细胞。离心细胞后，将细胞沉淀重悬于 5 mL 培养基中，然后缓慢将细胞悬液铺加到新配制的分离液上。再次离心后，收集位于培养基与分离液界面之间的树突状细胞。

然后，在计数细胞后，用培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞，并添加G-M-C-S-F和IL-4。通过将分选后的细胞进行四次快速冻融处理，随后离心，以收集裂解物的膜组分，从而制备肿瘤裂解物。接着，用分选得到的自体ALDH高表达细胞裂解物对DC进行脉冲致敏，以制备CSC TPCs。

为制备H-T-P-D-C疫苗，将未分选的异质性肿瘤细胞裂解物与树突状细胞（DCs）共孵育，然后将1×10⁶个负载抗原的细胞重悬于100 µL PBS中，皮下注射至实验受体动物左侧 flank 区域。疫苗接种后，通过静脉注射给予异质性1×10⁵个D5肿瘤细胞（溶于100 µL PBS中），以攻击C57BL/6受体小鼠。对于SCC7模型，则在DC疫苗接种对侧，皮下注射1×10⁶个未分选的SCC7肿瘤细胞（溶于100 µL PBS中）来攻击C3H受体小鼠。

从受体C3H小鼠的脾脏制备单细胞悬液。随后在培养基中加入适当的刺激物，并使用包被的抗CD3和抗CD28单克隆抗体激活脾脏T细胞和B细胞。培养四天后，收集上清液，然后在4°C条件下，将上清液与针对干扰素γ、G-M-CSF或IgG的抗体共同包被ELISA板过夜。次日，用封闭液封闭非特异性结合位点，加入标准品和新收集的上清液，洗涤后于室温孵育。随后加入HRP标记的检测抗体，孵育一小时，最后加入TMB底物。

最后，在终止反应后的30分钟内，使用ELISA酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。Alor已被用作多种恶性肿瘤中分离干细胞的标志物，包括在以下点图中特异性展示的两种富含癌干细胞的群体D5和SCC7。Alor阳性细胞分别约占培养的D5和SCC7肿瘤细胞系的0.5%和5.2%。此外， freshly harvested肿瘤细胞经测定也含有来自体内建立的D5和SCC7肿瘤的2.5%和4.2%的Alor阳性细胞。

使用D-E-A-B-A特异性A型LDH抑制剂处理的肿瘤细胞作为阴性对照。通过采用上述已展示的疫苗接种模型，检测CSC TPCs诱导的保护性抗肿瘤免疫反应，以评估肿瘤干细胞的免疫原性。如本表所示，与仅接受PBS处理的小鼠相比，接受HTPCs处理的小鼠肺转移灶更少。

重要的是，接受 CSCT PC 治疗的小鼠肺转移灶数量仍少于仅接受 H-T-P-D-C 或 PBS 治疗的动物。在 SCC 七号模型中，与对照组相比，正常 C3 H 动物接受了如上所述的疫苗接种。H TPCs 诱导了适度的抗肿瘤免疫反应，而 CSC TPCs 则诱导了显著的肿瘤生长抑制。这些结果表明，与传统的未分选肿瘤细胞相比，CSC 可能更适合作为抗原来源用于负载树突状细胞（DCs），以诱导针对肿瘤细胞攻击的保护性免疫反应。

为了进一步理解所观察到的CSC诱导的保护性抗肿瘤免疫反应的潜在机制，我们对经DC疫苗免疫动物的细胞进行了激活，并通过EISA检测其细胞因子的产生。正如刚才所展示的，来自接种了D5 CSC TPC或S CCC7 CSC PC动物的细胞所产生的细胞因子显著更高，相比之下，接种D5 H TPC或SCC7 HTC动物的细胞则较低。今天您已了解如何利用Alor检测法来分离癌症干细胞。

这些肿瘤干细胞可用于开发基于树突状细胞的免疫疗法。我们希望，这些免疫疗法无论是单独使用还是与现有疗法联合使用，均能改善多种癌症患者的预后。