Name: 使用黑色素瘤和鳞状癌干细胞生成新型支气干细胞疫苗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解如何利用ALDH高表达肿瘤干细胞制备树突状细胞疫苗，并在免疫健全宿主中评估其抗肿瘤免疫效果。该方法为癌症免疫治疗提供了新策略。

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本工作由密歇根大学综合癌症中心设立的 Will 和 Jeanne Caldwell 研究基金资助，部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 CA82529 及 Gillson Longenbaugh 基金会资助。

1. ALDEFLUOR 染色
<ol>
	<li>细胞样品制备：制备肿瘤细胞的单细胞悬液，可来源于培养的肿瘤细胞或新鲜收获的肿瘤组织样品。计数细胞，并用 ALDEFLUOR 检测缓冲液将细胞悬液调整至浓度为 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>标记四个 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯试管作为对照管，编号如下：#1：未染色，#2：ALDEFLUOR，#3：ALDEFLUOR 加 DEAB，以及&#160; #4：7AAD。</li>
	<li>向对照管中加入 1 ml 细胞悬液至 #1 和 #4 管，向 #2 管加入 2 ml。向 #3 管中加入 5 µl DEAB（ALDH 抑制剂），并置于冰上。然后向 #2 管中加入 10 µl 活化的 ALDEFLUOR 底物，混匀后立即转移 1 ml 混合液至 #3 管。</li>
	<li>同时，向其余细胞（样品管）中每百万细胞加入 2 µl 活化的 ALDEFLUOR 底物，细胞浓度同样为 1 × 106&#160;个细胞/ml，使用 ALDEFLUOR 检测缓冲液配制。</li>
	<li>将 4 个对照管和样品管在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向对照管 #4 中加入 5 µl 7AAD，向样品管中每 1 × 106 个细胞加入 1 µl 7AAD，4 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>将所有试管在 250 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 ALDEFLUOR 检测缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>进行基于流式细胞术的分选。</li>
	<li>使用经 DEAB 处理的 ALDEFLUOR 染色细胞作为阴性对照，以碘化丙啶（PI）7AAD 染色细胞作为活性对照来设定分选门。根据这些对照设定门控，以区分 ALDEFLUOR+/ALDHhigh、D5 和 SCC7 细胞。随后将此门控用于分选上述制备的所有样品细胞中的 ALDEFLUOR+/ALDHhigh D5 和 SCC7 细胞。</li>
</ol>
2. 肿瘤干细胞裂解物致敏树突状细胞（CSC-TPDC）疫苗的制备
<ol>
	<li>使用CO₂处死小鼠（分别为同源B6和C3H小鼠）2 分离股骨和胫骨。</li>
	<li>将骨骼置于75%乙醇中，室温下处理1分钟。随后使用HBSS洗涤骨骼。</li>
	<li>用21号针头和10 ml注射器将细胞从骨头上冲洗至培养皿中。</li>
	<li>使用注射器吹打细胞以制备单细胞悬液。</li>
	<li>离心1,500 rpm 5分钟后，弃上清。随后加入5 ml红细胞裂解缓冲液，在37℃裂解红细胞1分钟 &#176;C 水浴</li>
	<li>计数细胞数量，并用完全培养基将细胞悬液调整至浓度为100万个细胞/毫升&#160;含有10 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4的培养基（CM）</li>
	<li>培养细胞，3天后在CM中补充IL-4和GM-CSF。</li>
	<li>在第5th 第几天收获未成熟树突状细胞（DCs），并配制DC分离液，其中含4.2 ml溶液C和1 ml OptiPrep密度梯度介质。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于5 ml CM中，缓慢将细胞悬液加至分离介质上。离心处理，条件为&#160;2,000 rpm，室温条件下。</li>
	<li>收集CM与分离介质之间的DCs，计数细胞数量，并用含有10 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4的培养基将细胞悬液调整至浓度为1×10⁶ 个细胞/ml。</li>
	<li>通过悬浮ALDH制备肿瘤裂解液高 或培养基中的未分选D5或SCC7细胞，经过四次快速冻融处理，随后离心 &#8764;100 x&#160;离心5分钟以收集裂解物的膜组分。</li>
	<li>制备CSC-TPDC，需用自体ALDH裂解物脉冲致敏DC高&#160;细胞。制备H-TPDC时，用未分选的异质性肿瘤细胞裂解物刺激树突状细胞（DC）。树突状细胞与肿瘤细胞裂解物的比例相同。</li>
</ol>
3. 疫苗接种与效力评估
<ol>
	<li>分别在正常 B6 小鼠皮下（s.c.）接种 2,500&#160;D5 CSC-TPDC 或 D5 H-TPDC 肿瘤细胞。分别在正常 C3H 动物皮下（s.c.）接种 &#160;5,000 SCC7 CSC-TPDC 或 SCC7 H-TPDC 肿瘤细胞。&#160;</li>
	<li>接种疫苗后，通过静脉（i.v.）攻击 B6 小鼠以异源性 D5 肿瘤细胞。&#160;于接种后 20 天使用 CO2&#160;处死小鼠，取出肺组织并计数肺转移灶。</li>
	<li>在 SCC7 模型中，于 DC 疫苗注射对侧皮下（s.c）接种未分选的 SCC7 肿瘤细胞以攻击 C3H 小鼠，并监测肿瘤大小。</li>
	<li>实验结束时，使用 CO2 处死 B6 和 C3H 小鼠。&#160;在首次接种疫苗后的第 34 天，&#160;使用 CO2 处死&#160;小鼠，同时采用无菌操作采集各组小鼠的&#160;脾脏。&#160;</li>
	<li>使用包被型抗 CD3 抗体联合抗 CD28 单克隆抗体，在含重组人 IL-2（hrIL-2）的完全培养基中激活脾脏 T 细胞和/或 B 细胞；或在含 LPS 及抗 CD40（FGK45）单克隆抗体腹水的培养基中进行激活。</li>
	<li>激活后，收集上清液用于 ELISA 检测。</li>
	<li>进行 ELISA 检测时，于 4 °C 过夜用针对 IFNγ、GM-CSF 和 IgG 的抗体包被酶标板。</li>
	<li>加入封闭缓冲液后，添加样本和标准品，并在室温下孵育。</li>
	<li>洗涤酶标板后，加入 HRP 标记的检测抗体及 TMB 底物进行孵育。</li>
	<li>反应终止后 30 分钟内，在酶标仪上于 450 nm 波长处测定吸光度。</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies 已支持开放获取出版费用。

免疫缺陷宿主（如SCID小鼠）由于缺乏适应性免疫系统，无法用于肿瘤干细胞（CSCs）的免疫学评估。本研究在免疫功能健全的宿主中评估了CSCs的免疫原性，该模型更接近患者实际情况。富集的CSCs具有免疫原性，将其裂解物负载于树突状细胞（DCs）作为疫苗时，相较于未筛选肿瘤细胞裂解物致敏的DCs，可诱导更强效的肿瘤保护性免疫反应。&#160; 从机制上讲，这种保护作用是通过选择性诱导产生针对CSC的抗体和T细胞而实现的8 以及I型细胞因子的产生， 例如 IFNγ 和 GM-CSF
目前大多数免疫疗法，包括基于树突状细胞的疫苗和过继性T细胞转移，均旨在靶向肿瘤分化抗原。而肿瘤干细胞（CSCs）可能不表达这些分化抗原，因此可能逃避免疫系统的靶向攻击。相比之下，专门针对肿瘤干细胞设计的疫苗有可能清除这类特殊的癌细胞群体，从而通过防止肿瘤复发和转移，提高疫苗的治疗效果。
在培养的肿瘤细胞和新鲜获取的肿瘤组织中，我们通过流式细胞术根据高醛脱氢酶活性鉴定出富含肿瘤干细胞的细胞群体。此类ALDH高 可通过流式分选分离细胞，用作抗原来源以刺激树突状细胞（DC），从而生成CSC-TPDCs。使用ALDH进行比较高 从培养的肿瘤细胞中分离的细胞 与&#160; 来自新鲜收获的肿瘤的实验结果显示，在诱导抗肿瘤干细胞免疫方面无显著差异8这些结果表明，无论是从培养的肿瘤细胞中分离的肿瘤干细胞，还是从新鲜获取的肿瘤组织中分离的肿瘤干细胞，均具有用于临床应用的潜力。
为了具有临床相关性，疫苗需要在治疗环境中进行评估。目前，这些实验正在我们实验室中进行。

肿瘤干细胞对传统的化疗和放疗具有相对较强的耐受性1,2。另一方面，这类细胞可能是导致传统癌症治疗后肿瘤复发和进展的关键细胞群体1-4。由于肿瘤干细胞不表达分化的肿瘤抗原，因此它们可能逃避免疫治疗中的现有干预手段——这些手段大多旨在靶向作用于已分化的肿瘤细胞表面的抗原。因此，开发专门针对并清除肿瘤干细胞的新型治疗策略，有望提高当前癌症治疗的疗效。为此，我们从两种动物肿瘤（黑色素瘤D5和鳞状细胞癌SCC7）中分离出富含肿瘤干细胞（CSC）的细胞群体，并将其作为抗原来源，用于刺激抗原呈递细胞（树突状细胞，DC），从而制备CSC-TPDC疫苗。随后，我们在同基因型免疫健全的宿主小鼠（分别为B6小鼠和C3H小鼠）中评估了该CSC-TPDC疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应。我们将CSC-TPDC疫苗诱导的抗肿瘤效果与传统的DC疫苗进行了比较，后者使用未经分选的异质性肿瘤细胞裂解物（H-TPDC）进行致敏，此前我们研究组5,6以及其他研究者7已在临床前研究和临床试验中应用过该方法。

<table><tbody><tr><td>ALDH荧光检测试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>小鼠GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>小鼠GM-CSF ELISA检测试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep密度梯度介质</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB底物试剂套装</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

利用黑色素瘤和鳞状细胞癌干细胞生成一种新型树突状细胞疫苗

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

我们利用ALDEFLUOR/ALDH作为标志物，从与C57BL/6小鼠同源的鼠黑色素瘤D5细胞以及与C3H小鼠同源的鳞状细胞癌SCC7细胞中鉴定出富含肿瘤干细胞（CSC）的细胞群，并使用细胞裂解物作为抗原来源致敏树突状细胞（DCs），以检测其免疫原性。在两种模型中，无论是肺转移模型还是皮下（s.c.&#160;）肿瘤生长模型，经ALDHhigh CSC裂解物致敏的DCs所诱导的保护性抗肿瘤免疫反应均显著高于经未分选全肿瘤细胞裂解物致敏的DCs。该现象归因于CSC疫苗所诱导的体液和细胞抗CSC免疫应答。特别是，来自接受CSC-DC疫苗免疫的宿主的脾细胞产生IFNγ和GM-CSF的水平显著高于来自接受未分选肿瘤细胞裂解物致敏DC疫苗的宿主的脾细胞。这些结果支持开发基于自体CSC的治疗性疫苗，用于辅助治疗环境下的临床应用。

ALDEFLUOR/ALDH 已被用作单一标记物，在多种恶性肿瘤中分离干细胞8-11我们利用ALDEFLUOR作为标记物，在两种肿瘤模型D5和SCC7中鉴定出富含癌症干细胞的细胞群体。我们在小鼠黑色素瘤B16-D5和鳞状细胞癌SCC7中均检测到ALDEFLUOR+细胞。研究发现，ALDEFLUOR+细胞在培养的D5和SCC7肿瘤细胞系中所占比例分别约为0.5%和5.2%。图1）。已对来自已形成肿瘤的新鲜收获肿瘤细胞进行分析，以确认ALDEFLUOR+细胞的存在。同样如图所示 图1，ALDEFLUOR+ 细胞中分别有 2.5% 和 4.2% 的细胞来自 体内 已建立的D5和SCC7肿瘤。这些分选后的D5和SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH+细胞的成瘤性及自我更新能力高 分别在同源免疫活性宿主C57BL/6小鼠和C3H小鼠中评估了种群特性8.
我们在动物实验和临床试验中均使用了异质性未分选的肿瘤细胞裂解物来刺激树突状细胞（H-TPDC）5,6。为了评估肿瘤干细胞（CSCs）的免疫原性，我们分离了ALDHhigh的肿瘤干细胞，并用其裂解物刺激树突状细胞，从而制备CSC-TPDC（图2），并以H-TPDC作为传统的癌症疫苗对照，检测CSC-TPDC是否在抑制肿瘤生长方面具有任何优势作用。
我们通过检测CSC-TPDC诱导的保护性抗肿瘤免疫反应来评估CSC的免疫原性。在D5模型中，将未致敏的免疫健全小鼠在皮下（s.c）接种CSC-TPDC或H-TPDC（裂解物与DC的比例相同），对照组小鼠注射生理盐水（PBS）。末次免疫一周后，通过静脉（i.v.）接种未分选的D5肿瘤细胞进行攻击，3周后处死小鼠并收获肺组织，以计数肺转移灶数量。如表1所示，与PBS组相比，接受H-TPDC处理的小鼠肺转移灶较少。更重要的是，在两次独立实验中，接受CSC-TPDC处理的小鼠肺转移灶数量均显著少于H-TPDC疫苗组。在SCC7模型中，正常的C3H小鼠分别在右侧胁部皮下（s.c）接种SCC7 CSC-TPDC或H-TPDC，随后在左侧胁部皮下（s.c）接种未分选的SCC7肿瘤细胞进行攻击。与PBS组相比，H-TPDC对肿瘤生长仅诱导了轻微的抗肿瘤免疫反应。然而，与对照组和H-TPDC组相比，接受CSC-TPDC处理的小鼠肿瘤生长受到显著抑制（p&lt;0.05，图3）。这些结果表明，在诱导针对肿瘤细胞攻击的保护性免疫反应方面，CSC可作为比传统未分选肿瘤细胞更有效的抗原来源用于DC的抗原负载。
为了进一步理解所观察到的CSC诱导的保护性抗肿瘤免疫的机制，我们在实验结束时采集了接受DC疫苗免疫动物的脾脏。随后，脾细胞通过抗CD3/CD28/IL-2或抗CD3/CD28/IL-2联合LPS/抗CD40进行激活。然后收集培养上清液，检测细胞因子和抗体的表达。由接种D5 CSC-TPDC或SCC7 CSC-TPDC的动物获得的脾细胞产生更高水平的IFNγ和GM-CSF（图4）。此外，与接种D5 H-TPDC或SCC7 H-TPDC的动物相比，接种D5 CSC-TPDC或SCC7 CSC-TPDC的动物其经LPS/抗CD40激活的脾细胞产生的IgG显著更高（p&lt;0.05）。这些抗体可分别结合D5和SCC7 CSC，并且在补体存在的情况下，此类结合可导致CSC裂解8。
<img alt="细胞分选流式细胞术图，培养/新鲜D5 SCC7，有/无DEAB，显示细胞群。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 在培养的以及新收获的中国台湾小鼠D5黑色素瘤和SCC7鳞状细胞肿瘤中均检测到ALDHFLUOR+/ALDHhigh细胞群。 使用50 mmol/L DEAB（一种特异性ALDH抑制剂）处理的肿瘤细胞作为阴性对照。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图。</a>
<img alt="用于ALDHhigh癌症研究的小鼠肿瘤细胞分选及树突状细胞致敏示意图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 基于树突状细胞的肿瘤干细胞疫苗的制备。 为制备CSC-TPDC和H-TPDC，分别使用ALDHhigh或未分选的肿瘤细胞裂解物对骨髓来源的树突状细胞进行致敏。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>
<img alt="Tumor size comparison graph; PBS, H-TPDC, CSC-TPDC treatment effects; statistical significance." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. CSC裂解物脉冲DC（CSC-TPDC）疫苗可在体内诱导更有效的保护性抗肿瘤免疫反应 皮下 SCC7 肿瘤模型
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">单击此处查看大图。</a>
<img alt="TPDC群体中细胞因子产生分析；不同激活方法下IFN-γ和GM-CSF水平的柱状图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 接受CSC-TPDC疫苗免疫的免疫健全宿主中产生更强的全身性细胞免疫应答。从小鼠体内分离脾细胞，这些小鼠分别接受了H-TPDC或CSC-TPDC疫苗免疫，并按所示方法进行激活。随后收集培养上清液，采用ELISA法检测细胞因子水平。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>

在同源免疫活性宿主中评估，基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗相较于使用异质性整体肿瘤细胞致敏的传统DC疫苗，显示出显著更强的抗肿瘤免疫反应。

我们从小鼠黑色素瘤 D5（与 C57BL/6 小鼠同源）和鳞状细胞癌 SCC7（与 C3H 小鼠同源）中分离出富含癌症干细胞（CSC）的细胞群体……

本实验的总体目标是在免疫功能健全的宿主体内评估基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗的抗肿瘤免疫反应。该目标通过以下步骤实现：首先从异质性肿瘤细胞中分离出醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）高表达的阳性CSC；第二步，分离获得CSC来源的DC，并用肿瘤裂解物对其进行致敏，以制备疫苗。接下来，将CSC裂解物脉冲的DC或TP-DC疫苗给予正常的同源免疫活性宿主。然后在最后一步中，评估C-S-C-T-P-D-C疫苗的保护性抗肿瘤效果。最终，可通过ELISA检测宿主T细胞和抗体介导的由C-S-C-T-P-D-C疫苗诱导的抗CSC免疫反应。该项目汇集了癌症研究领域中两个最具前景的方向：癌症干细胞和肿瘤免疫治疗。我们的实验室是最早在实体瘤中发现癌症干细胞的研究团队之一。这些细胞是驱动肿瘤生长及转移的癌症“种子”。今天您将看到一种利用免疫疗法特异性靶向这些肿瘤干细胞的新方法。我们使用一种称为醛脱氢酶的特定标志物，该标志物可通过Alde fluoro检测法进行检测。您将看到林刘医生和胡安·陶医生与周李博士共同开展工作。我们希望通过靶向这些肿瘤干细胞，能够改善多种癌症患者的治疗效果。首先，将目标肿瘤细胞悬浮于ALOR检测缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞。随后，将肿瘤细胞悬液除保留3毫升外，其余分别转移至各样品管中，并将四个12×75毫米的聚苯乙烯对照试管标记如下：未染色对照、ALOR、ALOR加DEAB以及7AAD。向未染色对照管和7AAD管中各加入1毫升细胞悬液，向ALDEFLUOR管中加入2毫升细胞悬液。然后向 ALOR 加 DEAB 管中加入 5 µL 的 DEAB。将各管置于冰上，随后向 alor 管中加入 10 µL 激活的 alor 底物。立即取 1 mL 底物溶液转移至 ALOR 加 DEAB 管中，然后每 100 万细胞向各样品管中加入 2 µL 激活的 alor 底物。将所有试管置于37摄氏度水浴中孵育30分钟，然后向7 A a D管中加入5微升7 a a d，向每个样本管中每100万个细胞加入1微升7 A a d。将这些试管在4摄氏度下静置10分钟。所有试管在室温下以250 × g离心5分钟，并将沉淀重悬于Alde Fluor检测缓冲液中，用于荧光激活细胞分选。为设置分选门，使用含DEAB的ALDEFLUOR处理的细胞作为阴性对照，以及七AAD染色的细胞作为活力对照。根据这些对照，建立分选门以区分ALDH阳性、CD5高表达及SCC7阳性细胞。然后利用此分选门将待测细胞分选为ALDH阳性、CD5高表达及SCC7阳性细胞群。首先从C57BL/6小鼠和C3H小鼠中分离出股骨和胫骨。将骨骼在75%乙醇中室温下消毒一分钟，然后用HBSS洗涤。接着剪去骨骼两端，使用装有21号针头的10毫升注射器将骨髓冲洗至培养皿中，反复吹打细胞数次以制成单细胞悬液，然后离心收集细胞。将沉淀物置于5毫升红细胞裂解缓冲液中，在37摄氏度水浴中孵育1分钟。计数细胞后，用补充有G-M-C-S-F和IL-4的培养基调整细胞浓度至1×10⁶个细胞/毫升。然后在37摄氏度和5% CO₂条件下培养细胞，并在3天后更换培养基和细胞因子。第五天，收获未成熟的树突状细胞。离心细胞后，将细胞沉淀重悬于 5 mL 培养基中，然后缓慢将细胞悬液铺加到新配制的分离液上。再次离心后，收集位于培养基与分离液界面之间的树突状细胞。然后，在计数细胞后，用培养基将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞，并添加G-M-C-S-F和IL-4。通过将分选后的细胞进行四次快速冻融处理，随后离心，以收集裂解物的膜组分，从而制备肿瘤裂解物。接着，用分选得到的自体ALDH高表达细胞裂解物对DC进行脉冲致敏，以制备CSC TPCs。为制备H-T-P-D-C疫苗，将未分选的异质性肿瘤细胞裂解物与树突状细胞（DCs）共孵育，然后将1×10⁶个负载抗原的细胞重悬于100 µL PBS中，皮下注射至实验受体动物左侧 flank 区域。疫苗接种后，通过静脉注射给予异质性1×10⁵个D5肿瘤细胞（溶于100 µL PBS中），以攻击C57BL/6受体小鼠。对于SCC7模型，则在DC疫苗接种对侧，皮下注射1×10⁶个未分选的SCC7肿瘤细胞（溶于100 µL PBS中）来攻击C3H受体小鼠。从受体C3H小鼠的脾脏制备单细胞悬液。随后在培养基中加入适当的刺激物，并使用包被的抗CD3和抗CD28单克隆抗体激活脾脏T细胞和B细胞。培养四天后，收集上清液，然后在4°C条件下，将上清液与针对干扰素γ、G-M-CSF或IgG的抗体共同包被ELISA板过夜。次日，用封闭液封闭非特异性结合位点，加入标准品和新收集的上清液，洗涤后于室温孵育。随后加入HRP标记的检测抗体，孵育一小时，最后加入TMB底物。最后，在终止反应后的30分钟内，使用ELISA酶标仪在450纳米波长下测定吸光度。Alor已被用作多种恶性肿瘤中分离干细胞的标志物，包括在以下点图中特异性展示的两种富含癌干细胞的群体D5和SCC7。Alor阳性细胞分别约占培养的D5和SCC7肿瘤细胞系的0.5%和5.2%。此外， freshly harvested肿瘤细胞经测定也含有来自体内建立的D5和SCC7肿瘤的2.5%和4.2%的Alor阳性细胞。使用D-E-A-B-A特异性A型LDH抑制剂处理的肿瘤细胞作为阴性对照。通过采用上述已展示的疫苗接种模型，检测CSC TPCs诱导的保护性抗肿瘤免疫反应，以评估肿瘤干细胞的免疫原性。如本表所示，与仅接受PBS处理的小鼠相比，接受HTPCs处理的小鼠肺转移灶更少。重要的是，接受 CSCT PC 治疗的小鼠肺转移灶数量仍少于仅接受 H-T-P-D-C 或 PBS 治疗的动物。在 SCC 七号模型中，与对照组相比，正常 C3 H 动物接受了如上所述的疫苗接种。H TPCs 诱导了适度的抗肿瘤免疫反应，而 CSC TPCs 则诱导了显著的肿瘤生长抑制。这些结果表明，与传统的未分选肿瘤细胞相比，CSC 可能更适合作为抗原来源用于负载树突状细胞（DCs），以诱导针对肿瘤细胞攻击的保护性免疫反应。为了进一步理解所观察到的CSC诱导的保护性抗肿瘤免疫反应的潜在机制，我们对经DC疫苗免疫动物的细胞进行了激活，并通过EISA检测其细胞因子的产生。正如刚才所展示的，来自接种了D5 CSC TPC或S CCC7 CSC PC动物的细胞所产生的细胞因子显著更高，相比之下，接种D5 H TPC或SCC7 HTC动物的细胞则较低。今天您已了解如何利用Alor检测法来分离癌症干细胞。这些肿瘤干细胞可用于开发基于树突状细胞的免疫疗法。我们希望，这些免疫疗法无论是单独使用还是与现有疗法联合使用，均能改善多种癌症患者的预后。

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免疫学与感染

使用黑色素瘤和鳞状癌干细胞生成新型支气干细胞疫苗

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小鼠模型中的肿瘤移植与肿瘤疫苗注射

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用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

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由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

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