斑马鱼成人端脑的一刀，受伤：一个方法调查脊椎动物脑部神经发​​生与再生

以下实验的总体目标是研究成体神经发生和中枢神经系统再生和修复所涉及的细胞反应和分子机制。在斑马鱼中，这首先是通过刺穿成年斑马鱼的右头半球来手动产生损伤来实现的。接下来，在受伤后 5 天，将鱼处死，将其大脑解剖并嵌入 aros 中，以便在 ome 中切片。

然后通过免疫组织化学或在 C 中与适当的标记物杂交对脑切片进行染色。为了观察细胞增殖，获得了神经胶质细胞、发育不全和神经发生结果，这些结果显示刺伤时在心室区标记的增殖标志物 PCNA、放射神经胶质标志物 S 100 β 和 oli 两个 EGFP 标记的少突胶质细胞前体细胞上调。与现有方法相比，该技术的主要优点是其简单性、速度和原因效率，可以在短时间内产生许多受伤的大脑。

麻醉成年斑马鱼后，根据文本方案，在解剖显微镜下用上方的光线将单条鱼放入一块浸泡过的薄纸的狭缝中。用一只手轻轻握住鱼，并使其方向允许使用配备 30 号针头的注射器从顶部进入头部。另一方面，将针头垂直推入颅骨，深度不超过 2 毫米，进入一个头半球的内侧区域。

引入头部损伤后，将鱼放入新鲜的鱼水中。完成后，将鱼转移回水流系统。让鱼恢复所需的时间并根据文本协议对它们实施安乐死后，将它们牺牲在冰上，并用锋利的剪刀在鳃后面剪开，将头部与身体分开。

将头部在一个 XPBS 中孵育 5 分钟，以允许出血。然后将头部转移到 PBS 中的 4% 对甲醛中，并在 4 摄氏度下孵育过夜或在室温下孵育 4 小时固定后。在培养皿中使用一个 XPBS 洗头两次。

然后在解剖显微镜下，在 PBS 中仔细解剖大脑。丢弃任何没有明显病变的大脑。将大脑转移到两个装有 1.5 毫升 100% 甲醇的反应管中，倒置试管 5 次，然后在零下 20 摄氏度下孵育至少 16 小时。

为了对组织进行免疫组织化学再水化，在使用 PBS tween 20 或 PTW 清洗大脑 5 次之前，将大脑以降序甲醇系列孵育 5 分钟。每人 5 分钟。接下来，将大脑嵌入其中，使用移液管将它们放入聚乙烯成型杯托盘的空腔中，通过在微波炉中以 600 瓦加热，将 2% 的 agros 溶解在一个 XPBS 中。

使用前让 agros 冷却三分钟。然后小心地从一个大脑中取出 PTW，然后再使用 aros 完全填充模具。使用解剖针在 aros 中旋转大脑以洗掉 PTW，并在让 agros 冷却之前将大脑腹侧朝下、背侧朝上并笔直定位。

使用解剖针，从模具中取出 agros 块。然后用锋利的剃须刀片，在大脑后端切割平行于爪头骨的 agros。现在在翻转块之前切开大脑前端的 agros，使其位于后平面上。

通过平行于大脑的背侧和腹侧进行切割来去除多余的 agros。然后将大脑向后翻转，使其位于腹侧。最后，将块切割成一个截断的三角形，其中头骨位于较小的平面上。

根据制造商的说明准备 viome 后，使用一个 XPBS 填充缓冲槽，使其刚好到达刀片底部。接下来，在振动器的样品盘顶部放置一小点强力胶。然后小心地将位于大脑后方的块平面放在强力胶上。

使用切片机机械手将标本盘插入缓冲盘，然后将标本盘旋转到所需位置。然后使用 3 毫米的内六角扳手拧紧螺丝并取下机械手。将块放置在缓冲浴中，使头骨位于表面下方，大脑的背侧面向刀片以切开大脑。

准备一个 24 孔板用于收集切片，方法是将每个大脑的 1 毫升封闭缓冲液添加到带有振动切片机的板孔中。以 50 微米的厚度、每秒 1 毫米的速度和 70 赫兹的频率开始切片。使用合成刷，捡起从刀片上脱落的薄片 aros，并将它们收集到 24 孔板中。

进行免疫组化：在室温下封闭非特异性位点一小时。孵育后，取出缓冲液并加入 250 μL 在封闭缓冲液中稀释的抗体，在 4 摄氏度下孵育过夜或在室温下孵育 2 小时，然后使用 PTW 洗涤样品 3 次，每次 1 分钟。在室温下孵育和二抗 2 小时后。

将切片清洗 3 次。使用水溶性非荧光封固剂封固切片。然后在复合或共聚焦显微镜下分析样品。

如果作得当，伤口会导致病变管从背侧延伸到腹侧，穿过头颅的 palam，该管将在 35 天后愈合。它以前使用免疫组织化学显示。这种伤害触发了 PCNA 的上调、S 100 β 和病变后 3 到 7 天的重叠模式，表明放射状神经胶质细胞增殖。

该图显示了在转基因 olig 两个 EEG FP 鱼中诱导的刺伤附近少突胶质细胞前体细胞或 OPC 的瞬时积累，在病变后第 35 天不再观察到。如果病灶没有正确引入，病灶管将不可见。无法检测到 PCNA 和 S 100 β 的上调或 OPC 的积累。

如此处所述，比较病变鱼与野生型大脑大脑中转录调节因子的全身表达筛选确定了许多在远头骨中表达并因损伤而上调的因子。例如，阶梯伤口方法与 RNA 深度测序和/或原位杂交相结合，可以帮助鉴定参与斑马鱼成体神经发生、再生和修复的新基因。