Name: 斑马鱼成人端脑的一刀，受伤：一个方法调查脊椎动物脑部神经发生与再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解斑马鱼端脑机械损伤手术方法，用于研究成年神经发生与中枢神经系统再生机制。该方案结合免疫组织化学和原位杂交技术，可高效分析细胞增殖及胶质细胞反应。

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感谢 N. Borel 及其鱼类房团队、M. Rastegar 在显微成像方面的协助，以及 T. Dickmeis 对手稿的评论。本研究得到了欧盟 IP ZF-Health（FP7-HEALTH-2007-B2）、NeuroXsys、上莱茵河谷合成生物学跨区域网络（NSB-Upper Rhine）以及德国联邦教育与研究部（BMBF）资助的 EraSysBio 网络项目的支持。

斑马鱼饲养于卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）毒理学与遗传学研究所（ITG）的鱼类养殖设施中。动物实验遵循德国动物保护标准，并经德国巴登-符腾堡州卡尔斯鲁厄政府行政区（Regierungspräsidium Karlsruhe）批准（文件编号 35-9185.81/G-272/12 “成年神经发生”）。
1. 在端脑中制造刺伤损伤
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>配制三卡因（tricaine，即3-氨基苯甲酸乙酯，又称氨基甲酸乙酯）储备液：取400 mg三卡因粉末，溶于97.9 ml水中，并加入2.1 ml 1 M Tris/HCl缓冲液（pH 9），调节pH至7。分装为每份5 ml，-20 °C保存备用。</li>
		<li>将适量年龄为0.5–1岁的斑马鱼从养殖缸中转移至塑料小鼠笼中。注意：成年斑马鱼约在12月龄时颅骨仍相对较软，可用针头轻易穿刺（见步骤1.2.3及图1A）。</li>
		<li>为麻醉成年斑马鱼，将5 ml三卡因储备液加入塑料交配笼中，并加入约100 ml洁净的养鱼用水（终浓度为0.02% (w/v) 三卡因）。</li>
		<li>将鱼置于麻醉液中孵育，直至其不再活动（45–60秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>端脑损伤
	<ol>
		<li>将单条已麻醉的斑马鱼放入浸有三卡因的泡沫块上的切口中固定。</li>
		<li>在体视显微镜下，从上方打光，用手轻轻握住鱼体，调整其方向，以便从顶部接触头部。</li>
		<li>另一只手将30 G注射器（带集成针头的胰岛素注射器）垂直穿过颅骨，插入一侧端脑半球的中线区域（图&#160;1A-1B）。端脑的两个半球可通过颅骨观察到。确保造成的损伤深度不超过2 mm（图1C）。注意：建议始终在同一侧半球制造损伤，以便在后续取出脑组织时更容易识别损伤部位。</li>
		<li>完成端脑损伤后，将鱼转移至新鲜养鱼用水中。每2 L小鼠笼中可饲养最多10条鱼，加注养鱼用水用于恢复，并将小鼠笼连接至循环水系统。注意：若斑马鱼健康且此前未进行其他实验，其存活率通常约为97%。无需在水中添加抗生素。恢复后，鱼的行为正常：能够游动、摄食和交配。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分析端脑损伤的影响
<ol>
	<li>脑组织解剖与固定
	<ol>
		<li>在损伤后不同时间点（通常为1、3、5和14天）使用0.02%（w/v）三卡因重新麻醉已恢复的鱼类，并将其置于冰水中5分钟以实施安乐死。</li>
		<li>将鱼放置在浸有磷酸盐缓冲液（PBS）的纸巾上，用锋利的剪刀在鳃后方剪断，分离头部与身体。</li>
		<li>将头部置于1×PBS中5分钟以促进排血。注意：此步骤可清除组织中的血液，避免干扰后续实验操作。</li>
		<li>在4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液中于4 °C过夜固定头部，或在室温下固定4小时。</li>
		<li>在培养皿中用1×PBS清洗固定后的头部两次。</li>
		<li>在解剖显微镜下于1×PBS中仔细解剖脑组织23。损伤部位通常在解剖显微镜下可见。无明显损伤的脑组织应予以弃用。</li>
		<li>将脑组织转移至装有1.5 ml 100%甲醇（MeOH）的2 ml反应管中，颠倒混匀5次&#160;，随后于-20 °C孵育至少16小时。注意：脑组织可在-20 °C的甲醇中保存数月，直至用于免疫组织化学或原位杂交实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学的组织准备
	<ol>
		<li>在2 ml塑料管中通过梯度降低的甲醇系列对脑组织进行复水处理（依次为75% MeOH（1×PBS，0.1% Tween-20 = PTW）；50% MeOH；25% MeOH。每种溶液中孵育脑组织（15个脑组织/2 ml反应管）5分钟。</li>
		<li>在PTW中清洗脑组织5分钟，重复4次&#160;，每次使用新鲜PTW。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织包埋以进行切片
	<ol>
		<li>使用移液管（直径5 mm）将脑组织从含PTW的2 ml反应管转移至聚乙烯模具板的孔洞中进行包埋。</li>
		<li>在锥形瓶中配制2%琼脂糖（DNA级）的1×PBS溶液。在微波炉中以600 W加热至琼脂糖完全溶解。每10个脑组织准备50 ml。使用前于室温冷却3分钟。包埋过程中将琼脂糖置于预热的加热块（60 °C）上，防止其凝固。</li>
		<li>使用巴斯德移液管（直径1 mm）移除含有一个脑组织的模具中的1×PBS。注意避免损伤脑组织。</li>
		<li>向模具中倒入琼脂糖并完全填满，然后使用解剖针在琼脂糖中搅动脑组织，以去除PTW，便于包埋。</li>
		<li>将脑组织在模具中调整为腹面朝下、背面朝上，并保持平直。</li>
		<li>让琼脂糖冷却。为加快冷却，可将模具置于冰上。重复此步骤。</li>
		<li>对所有脑组织重复步骤2.3.3–2.3.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖块修整
	<ol>
		<li>使用解剖针将琼脂糖块顶出。</li>
		<li>用锋利的剃须刀片在脑组织后端切开琼脂糖，确保切面与端脑平行。</li>
		<li>在脑组织前端切开琼脂糖，然后翻转琼脂糖块，使其以后端切面为底站立。</li>
		<li>沿脑组织背侧和腹侧平行切除多余琼脂糖，然后将脑组织翻回，使其腹面朝下平放。</li>
		<li>将琼脂糖块修整为截顶三角形，使端脑位于较小的切面上（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>振动切片机切片前准备
	<ol>
		<li>根据制造商说明准备振动切片机。使用新刀片，并在切割10个脑组织后更换。</li>
		<li>向缓冲槽中加入1×PBS，液面高度以刚好接触刀片底部为宜。</li>
		<li>在振动切片机样品盘顶部涂一小滴瞬干胶。</li>
		<li>小心将位于脑组织后方的切面贴附于瞬干胶上。一旦胶水接触振动切片机缓冲槽中的1×PBS，便会迅速固化。</li>
		<li>使用切片机操纵器将带样品的样品盘插入缓冲槽中。</li>
		<li>使用操纵器旋转样品盘至所需位置。调整琼脂糖块在缓冲槽中的方向，使端脑刚好位于液面下方，脑组织背侧朝向刀片。然后使用3 mm内六角扳手拧紧固定螺丝，并移除操纵器。注意：夹紧螺丝或夹紧装置不得位于样品盘的缺口上方，否则无法固定样品盘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑组织切片
	<ol>
		<li>准备24孔板用于收集切片。每待切片的一个脑组织，在孔中加入1 ml封闭缓冲液（0.1%（v/v）Tween-20，0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），1%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）溶于PBS）。</li>
		<li>使用振动切片机以50 μm厚度、1 mm/sec速度和70 Hz频率开始切片。</li>
		<li>使用合成毛刷（1 mm）拾取从刀片上脱落的薄层琼脂糖切片，并将其收集至24孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>振动切片上的免疫组织化学染色
	<ol>
		<li>在封闭缓冲液（0.1%（v/v）Tween-20，0.2%（w/v）BSA，1%（v/v）DMSO溶于PBS）中于室温封闭非特异性结合位点1小时。</li>
		<li>移除上清液，加入250 μl用封闭缓冲液稀释的一抗，于4 °C孵育过夜。或在室温下孵育2小时。随后在PTW中清洗3次，每次10分钟。注意：PCNA染色使用1:400稀释度（小鼠抗PCNA抗体。详情见材料表）。可同时孵育多种一抗。</li>
		<li>在二抗中于室温孵育2小时，随后在PTW中清洗3次，每次10分钟。注意：在PTW中按1:1,000稀释，详情见材料表。可同时孵育多种二抗。</li>
		<li>可选：为获得最佳结果，建议将切片在PTW中于4 °C孵育过夜，以充分洗去非特异性结合的二抗。此情况下，封片前需再次更换PTW。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年脑组织RNA 原位&#160;杂交（可替代免疫组织化学）
	<ol>
		<li>脑组织解剖与固定（与免疫组织化学相同）：
		<ol>
			<li>探针杂交。</li>
			<li>在2 ml反应管中按免疫组织化学所述方法对脑组织进行复水。</li>
			<li>在蛋白酶K（ProtK；终浓度10 μg/ml）的PTW溶液中孵育脑组织30分钟。孵育结束后移除ProtK/PTW，并在BT-Fix溶液（4% PFA，4%蔗糖，0.12 mM CaCl2，77 mM Na2HPO4，23 mM NaH2PO4）中再次固定20分钟。</li>
			<li>在PTW（PBS中含0.1%（v/v）Tween-20）中清洗脑组织5次，每次5分钟。</li>
			<li>移除PTW，用500 μl HYB缓冲液（50%（v/v）去离子甲酰胺，5×SSC，500 μg/ml酵母tRNA，50 μg/ml肝素，0.1% Tween-20，9 mM柠檬酸）冲洗脑组织。待脑组织沉至管底后，弃去上清液，加入500 μl新鲜HYB缓冲液，于65–70 °C孵育3–4小时。</li>
			<li>将RNA探针按1:200或1:400（依探针而定）稀释至终体积400 μl的HYB缓冲液中。将稀释后的RNA探针于70 °C加热5分钟。</li>
			<li>移除脑组织上清液，加入RNA探针，于65–70 °C孵育过夜。所有洗涤缓冲液应预热并保持在70 °C。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>标记
		<ol>
			<li>在65–70 °C条件下（所有4个洗涤步骤均在此温度下进行），用500 μl洗涤缓冲液1（50%甲酰胺，1×SSC，0.05% Tween-20）清洗脑组织两次，每次30分钟。将缓冲液1更换为缓冲液2（2×SSC，0.1% Tween-20），孵育15分钟。移除缓冲液2，用缓冲液3（0.2×SSC，0.1% Tween-20）清洗脑组织30分钟，重复此步骤两次。将缓冲液3更换为缓冲液4（0.1×SSC，0.05% Tween-20溶于PTW），孵育5分钟。</li>
			<li>移除上清液，在室温下用500 μl PTW清洗5分钟。</li>
			<li>将脑组织包埋于2%琼脂糖（溶于1×PBS）中，并按免疫组织化学所述方法切取振动切片（50–100 μm）。</li>
			<li>在500 μl封闭缓冲液（1×PBS，0.1% Tween-20，0.2%（w/v）BSA，1%（v/v）DMSO）中清洗1次，每次5分钟。</li>
			<li>移除上清液，加入500 μl封闭缓冲液，于室温孵育2小时。</li>
			<li>移除上清液，加入300 μl用封闭缓冲液按1:4,000稀释的抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体。</li>
			<li>于4 °C孵育过夜。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>NBT/BCIP染色
		<ol>
			<li>在室温下用PTW缓冲液清洗5次，每次15分钟。</li>
			<li>用染色缓冲液冲洗1次。在染色缓冲液（100 mM Tris/HCl pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween-20）中清洗两次，每次5分钟。</li>
			<li>移除上清液，加入500 μl染色液（每1 ml染色缓冲液中含3.5 μl 4-硝基蓝四唑氯化物（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP））进行染色。</li>
			<li>通过用PTW冲洗3至5次终止染色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片封片
	<ol>
		<li>使用水溶性、非荧光封片剂将切片封于载玻片上（参见&#160;材料表）。</li>
		<li>将载玻片置于4 °C冰箱中保存。注意：染色结果可稳定数周甚至数月。</li>
		<li>在复合显微镜或共聚焦显微镜下观察载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li>
<li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+potential+of+glia%3A+lessons+from+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3(2013).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li>
<li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li>
<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li>
<li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+origin%2C+proliferation+dynamics%2C+migration+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li>
<li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+migration%2C+neuronal+differentiation%2C+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li>
<li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li>
<li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain%3A+a+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li>
<li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li>
<li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li>
<li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li>
<li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li>
<li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li>
<li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li>
<li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们在此描述一种通过将针头穿过成年斑马鱼颅骨以诱导端脑损伤的方法，并通过免疫组织化学和原位杂交分析细胞和分子对该损伤的反应 原位 杂交。该技术相较于其他现有方法的主要优势在于其操作简便、速度快且成本效益高。因此，该技术可在短时间内制备大量损伤脑组织，易于与大规模 原位 杂交筛选以鉴定在再生和神经发生中起作用的基因
进行损伤操作的成年斑马鱼的年龄至关重要。如果斑马鱼年龄超过1.5年，其颅骨会过于坚硬，可能导致颅骨被压陷或发生骨折，而非被干净地穿孔。相反，在较年轻的斑马鱼（年龄小于4个月）中，仍存在大量的神经发生，这可能在反应性神经发生方面导致假阳性结果。
该方法的另一个关键步骤是验证刺伤的效率，并排除双侧半球均受损的情况。可通过使用抗PCNA抗体对切片进行染色来监测。在正确建立的损伤模型中，PCNA应仅在其中一个半球显著上调。
需要注意的是，诱导的机械损伤会带来多种副作用，例如非特异性的细胞消融、因继发性退变导致的细胞死亡增加、炎症反应以及血脑屏障的破坏，同时可能损伤脑室区，并可能导致脑脊液流入脑实质。然而，受伤的鱼类表现出的痛苦极小。在2分钟内&#160;，它们即可恢复自由游动，约4小时内恢复正常摄食行为。3周后，损伤在形态学上已不可见。据我们经验，在数百例手术中，尽管组织学评估显示损伤率为100%（损伤后5天），但无一例鱼类死亡。
近年来，斑马鱼中已开发出其他技术，例如转基因方法，可用于实现组织或细胞类型特异性的消融2。尽管这些技术非常精巧且侵入性极小，但其依赖于复杂DNA构建体的构建以及多个稳定斑马鱼转基因品系的建立，这一过程可能极为繁琐且耗时。因此，诸如本实验方案中所述的简单机械方法仍然是研究成年斑马鱼脑部神经发生与再生的重要工具。

哺乳动物在成年期生成新神经元的能力非常有限，成年大脑中的神经发生主要局限于侧脑室脑室下区（SVZ）和海马齿状回颗粒下区（SGZ）这两个端脑区域1。哺乳动物也无法有效修复由神经退行性疾病、中风或损伤引起的脑部损害。丢失的神经元无法被替代，取而代之的是包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞在内的多种胶质细胞发生增殖。作为这种被称为反应性胶质增生的增殖过程的结果，受损脑组织会因胶质瘢痕的形成而被封闭，从而抑制神经元和轴突的再生2-4。
与哺乳动物不同，斑马鱼等硬骨鱼类在成体阶段会大量生成新的神经元，并具有强大的再生和增殖能力，可修复中枢神经系统的损伤2,5-7。成体斑马鱼大脑中含有16个明确的神经干细胞微环境，在整个生命周期中持续产生大量新生神经元8-11。这些成体斑马鱼脑内特定增殖区域产生的神经元会迁移到其靶区域，在那里成熟并整合到已有的神经网络中8,10,12-15。
在成年斑马鱼中已鉴定出多个前体细胞区域，其中端脑室下区是研究最为深入的神经干细胞微环境之一。该前体细胞微环境中的细胞可根据其形态、分裂速率以及对不同胶质或神经标记物的表达情况，分为三种不同类型。I型和II型细胞为类似放射状胶质细胞的细胞，具有较长的突起，表达包括GFAP、nestin和S100β在内的干细胞标记物。I型细胞不发生增殖，而II型细胞增殖缓慢，这一点可通过其表达增殖细胞核抗原（PCNA）以及掺入脱氧胸苷类似物得到证实。III型细胞为快速分裂的细胞，具有向神经前体细胞分化的命运，并表达PSA-NCAM5,16等神经标记基因。
尽管硬骨鱼类的再生能力已有充分记载，但仅有少数研究详细描述并探讨了成年鱼类端脑在损伤后神经元再生所涉及的细胞与分子机制15,17-22为解析斑马鱼成年中枢神经系统再生与修复的潜在机制，并理解生理性神经发生与再生性神经发生之间的相似性与差异，我们建立了一种斑马鱼成年端脑损伤模型。本文将直观展示如何借助注射器针头对一侧端脑半球造成损伤，同时保留对侧未损伤半球作为内部对照。我们还将展示如何通过免疫组织化学方法检测损伤后细胞增殖和基因表达的变化 原位 杂交实验

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>生命技术公司</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G 注射器（Omnican 40）</td><td>B. Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯成型杯托盘&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>卡尔·罗斯</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>卡尔·罗思</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>卡尔·罗斯</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&amp;ouml;弗勒与W&amp;ouml;rner</td><td>&lt;a href=&quot;http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020&quot;&gt;06 1362 0020&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管，15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>抗S100（1:500）</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>抗PCNA（1:400）</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP（1:1,000）</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体&amp;nbsp;</td><td>罗氏诊断</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）&amp;nbsp;</td><td>罗氏诊断</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>氯化硝基四氮唑蓝（NBT）&amp;nbsp;</td><td>罗氏诊断</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>罗氏诊断</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯成型杯托盘&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜 Nikon SMZ 645</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔平底组织培养板&amp;nbsp;</td><td>Falcon 目录&amp;nbsp;</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>学生型杜蒙特#5镊子</td><td>精细科学工具</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>精细科学工具</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio Tg(olig2:EGFP)&lt;/em&gt;</td><td>Shin &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;斑马鱼&lt;/em&gt; 野生型菌株（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，AB2O2）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼成体端脑刺伤损伤：一种研究脊椎动物脑神经发生与再生的方法

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

成年斑马鱼在受伤后具有惊人的中枢神经系统再生能力。为了研究成年斑马鱼中枢神经系统（CNS）再生与修复过程中的细胞反应及分子机制，我们建立了一种成年斑马鱼端脑损伤模型。
在此方法中，我们通过将胰岛素注射器针头插入成年斑马鱼端脑以人工制造损伤。在损伤后的不同时间点处死斑马鱼，取出其脑组织并进行免疫组织化学染色和/或 原位 通过使用适当的标记物进行原位杂交（ISH），观察细胞增殖、胶质发生和神经发生。未损伤的对侧半脑作为内部对照。该方法若与RNA深度测序等技术联合使用，有助于筛选在斑马鱼成体端脑神经发生、再生和修复过程中发挥功能的新基因。

通过本文所述的工作流程，可在成年斑马鱼端脑的右半球引入一处损伤（图 1A-1B）。正确的损伤操作会产生一条贯穿端脑背侧至腹侧全层原皮质的损伤通道（图 3C）。该损伤应局限于其中一个半球，且不应跨越内侧脑室。损伤通道可在明场显微镜下观察到（图 3C），并在约35天后愈合15。
先前的研究表明，损伤后3至7天可通过免疫组织化学检测到增殖细胞核抗原（PCNA；图3A）和S100β（图3B）的表达上调15。PCNA与S100β的染色信号存在重叠，提示放射状胶质细胞发生增殖。
此外，为了可视化少突胶质细胞前体细胞（OPCs），在Tg(olig2:EGFP)鱼上进行了刺伤损伤实验24。通过抗GFP抗体染色后，可在损伤管附近检测到OPCs的聚集（图3D）。这种聚集是暂时性的，在35 dpl时已不再观察到OPC簇15。
如果损伤操作不当，将无法观察到损伤道，且PCNA和S100β的上调或少突胶质前体细胞（OPC）的聚集均无法检测到。PCNA是检测脑损伤最敏感的标志物。为了验证刺伤操作的有效性，并排除双侧半球均受损的可能性，强烈建议始终使用抗PCNA抗体对切片进行染色。在正确实施的损伤模型中，PCNA仅在其中一个半球显著上调（最高可达4倍15）。尽管在大多数情况下，仅以对侧未损伤半球作为内部对照来监测基因表达变化已足够，但仍强烈建议将对照半球的基因表达水平与野生型大脑端脑半球的表达水平进行比较。通过这种方式，可检测到损伤对基因表达产生的可能影响双侧半球的系统性效应。
结合转录调控因子（TRs）的系统性表达筛选（25 及 Schmidt et al.，未发表），刺创伤口检测法也可用于鉴定在神经发生和再生中可能发挥作用的TR基因（图4A-4C）。
该方法已鉴定出若干在端脑中表达且在损伤后其表达特异性上调的因子（图4A-C）。
<img alt="斑马鱼脑部注射示意图，显示端脑靶向；标注解剖结构，附带比例尺。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 成年斑马鱼端脑刺伤的示意图。A) 将胰岛素注射器针头插入成年斑马鱼颅骨以造成端脑损伤。白色虚线表示两个端脑半球之间的边界，绿色十字表示刺伤位置。B) 成年斑马鱼脑的背侧视图。图中标识了主要脑区。绿色十字表示诱导损伤的位置。C) 用于诱导端脑损伤的针头尖端长度为2 mm。嗅球（ob）、端脑（tel）和视顶盖（ot）。
<img alt="带有标注区域的昆虫脑结构示意图：ob、tel、ot、cb、m，用于神经解剖学研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 成年斑马鱼脑在即将进行振动切片前的琼脂糖包埋块中的示意图。 前端朝上。嗅球（ob）、端脑（tel）、视顶盖（ot）、小脑（cb）和延髓（m）。比例尺：500 μm。
<img alt="脑组织荧光显微镜图像：PCNA、S100β、olig2:EGFP 表达；端脑、次级脑。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 穿刺损伤后的再生反应。A-D) 成年斑马鱼脑在损伤后第5天（dpl）。A-B) 增殖标志物 PCNA（A）和放射状胶质细胞标志物 S100β（B）在室管膜区（箭头所示）因穿刺损伤而上调表达。（C）在明场照明下可见损伤通道（箭头所示），室管膜区由绿色线条标示。（D）少突胶质前体细胞（olig2:EGFP+）在损伤部位聚集（箭头所示）。比例尺：200 μm。所有图中，右侧为损伤半脑，背侧朝上。A 至 D 中的虚线表示端脑与次级脑之间的边界。
<img alt="In situ hybridization diagrams, eomesa and sox4a expression, pallium, subpallium brain regions." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 在刺伤刺激下上调基因的一个示例。 注意强上调（箭头） eomesa (A, B）和 sox4a (C右侧端脑半球（被刺入半球）中mRNA表达水平的监测，通过 原位 杂交在5 dpl时进行。左侧半球未受损伤，作为对照。(B) 显示A图中端脑背侧区域的更高倍放大图像。背侧朝上。比例尺： 200 μm 对于 A 和 C 以及 55 µm 图A和图C中的虚线表示大脑皮层与皮层下区域的分界。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">缩写</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP</td>
			<td>碱性磷酸酶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸盐</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>牛血清白蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNS</td>
			<td>中枢神经系统</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig</td>
			<td>地高辛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>二甲基亚砜</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpl</td>
			<td>损伤后天数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eomesa</td>
			<td>Eomesodermin 同源基因 a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>胶质纤维酸性蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hr</td>
			<td>小时</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYB buffer</td>
			<td>杂交缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISH</td>
			<td>原位 杂交</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>甲醇</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT</td>
			<td>硝基蓝四氮唑</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPCs</td>
			<td>少突胶质细胞前体细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>磷酸盐缓冲盐水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA</td>
			<td>增殖细胞核抗原</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>多聚甲醛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtK</td>
			<td>蛋白酶 K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSA-NCAM</td>
			<td>多聚唾液酸化神经细胞黏附分子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTW</td>
			<td>PBS，0.1% Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA</td>
			<td>核糖核酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT</td>
			<td>室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGZ</td>
			<td>颗粒下区</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox4a</td>
			<td>SRY-box 含有基因 4a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC</td>
			<td>柠檬酸钠-氯化钠溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVZ</td>
			<td>脑室下区</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRs</td>
			<td>转录调控因子</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

为了阐明斑马鱼成体神经发生与再生的细胞和分子机制，我们建立了一种侵入性手术方案，可在斑马鱼成体端脑中诱导机械性损伤，并通过免疫组织化学方法对刺伤半球后续发生的变化进行监测 原位 杂交。

成年斑马鱼在中枢神经系统受损后具有惊人的再生能力。为了研究细胞反应和分子……

以下实验的总体目标是研究成体神经发生及中枢神经系统再生与修复过程中涉及的细胞反应和分子机制。在斑马鱼中，首先通过手动穿刺成年斑马鱼的右侧大脑半球来人为制造损伤。随后，在损伤后第五天处死斑马鱼，取出其脑组织，包埋于琼脂糖中，以便在切片机上进行切片。然后通过免疫组织化学或原位杂交技术，使用适当的标记物对脑切片进行染色。为了观察细胞增殖、胶质发生和神经发生的结果，可获得显示增殖标志物PCNA、放射状胶质细胞标志物S100β以及在损伤后于脑室区标记的EGFP阳性少突胶质前体细胞均出现上调的实验结果。该技术相较于现有的通过转基因方法实现组织或细胞类型特异性消融的技术，其主要优势在于操作简便、速度快且诱导效率高，可在短时间内制备大量脑损伤样本。根据文本方案，将成年斑马鱼麻醉后，将其单个放置于解剖显微镜下、浸有三氯乙酸的滤纸块的切口中，光源来自上方。用一只手轻轻固定斑马鱼，并调整其方向，以便使用装有30号针头的注射器从上方接触鱼头。另一只手将针头垂直刺入颅骨，深度不超过两毫米，进入一侧大脑半球的中线区域。在造成头部损伤后，将鱼放入新鲜的鱼用培养水中。操作完成后，将鱼转移回水流系统中。根据文本所述安乐死程序，在让鱼恢复所需时间后，将其置于冰上处死，并使用锋利的剪刀在鳃后方剪断，以分离头部与身体。将头部置于一份 XPBS 中孵育五分钟，以促进出血。随后将头部转移至含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中，在 4 摄氏度下过夜或在室温下孵育四小时进行固定。固定后，使用一份 XPBS 在培养皿中清洗头部两次。然后在解剖显微镜下，用 PBS 仔细解剖脑组织。弃去任何无可见病灶的脑组织。将脑组织转移至含有 1.5 毫升 100% 甲醇的 2 毫升反应管中，在 –20 °C 下孵育至少 16 小时，孵育前将管子颠倒 5 次。为了在免疫组织化学染色前对组织进行再水化，将脑组织在梯度甲醇溶液中依次孵育，每级5分钟，随后使用含吐温20的磷酸盐缓冲液（PBS tween 20）或PTW溶液洗涤脑组织五次，每次5分钟。接下来进行脑组织包埋时，使用移液器将脑组织转移至聚乙烯模具板的孔洞中，并通过微波炉以600瓦功率加热，将2%琼脂糖（agros）溶解于1倍XPBS中。使用前让琼脂糖冷却三分钟。然后小心地从一个脑组织上取下PTW，再用琼脂糖完全填充模具。用解剖针在琼脂糖中轻轻搅动脑组织，以洗去PTW，并将脑组织腹面朝下、背面朝上放正位置，保持平直，然后让琼脂糖冷却。使用解剖针将琼脂块从模具中取出。然后用锋利的剃刀刀片在脑后端与尾足头节平行的位置切割琼脂块。现在，在将琼脂块翻转使其立于后切面之前，于脑前端处切割琼脂块。通过沿脑部背侧和腹侧平行切割，去除多余的琼脂糖。然后将脑部翻转回腹侧朝下的位置。最后，将组织块切成一个截断的三角形，使头部位于较小的平面上。按照说明书制备脑组织切片后，使用一份 XPBS 填充缓冲液槽，使液体刚好到达刀片底部。接着，在振动器的样本盘顶部放置一小滴瞬干胶。然后，小心地将脑组织后方的组织块平面置于瞬干胶上。使用切片机操作器将样品圆盘插入缓冲槽中，并旋转样品圆盘至所需位置。然后使用3毫米的内六角扳手拧紧螺丝，并取下操作器。将组织块置于缓冲液槽中，使头部刚好位于液面下方，脑的背侧朝向刀片，以便切片脑组织。使用振荡切片机，在24孔板的每个孔中为每份脑组织加入一毫升封闭缓冲液，以准备收集切片。以50微米厚度、每秒一毫米速度及70赫兹频率开始切片。使用合成毛刷将从刀片上切下的薄片拾取，并转移至24孔板中。在室温下用封闭液封闭非特异性位点一小时以进行免疫组织化学。孵育后，移除封闭液，加入250微升用封闭液稀释的一抗，4°C过夜孵育或室温孵育两小时，随后使用PTW缓冲液洗涤样本三次，每次一分钟。一抗孵育完成后，于室温下加入二抗并孵育两小时。将切片洗涤三次。使用水溶性非荧光封片剂封片。然后在复式显微镜或共聚焦显微镜下分析样品。若操作得当，伤口将形成一条贯穿尾部头部掌面背侧至腹侧的损伤通道，该通道将在35天后愈合。此前通过免疫组织化学已证实，损伤会触发PCNA和S100β的上调，并在损伤后第3至7天出现重叠表达模式，提示放射状胶质细胞发生增殖。该图显示了在转基因寡突胶质细胞双 EEG FP 鱼中，刺伤后少突胶质前体细胞（OPC）在损伤部位附近短暂聚集的现象，但在损伤后第35天时这种聚集已不再可见。如果损伤操作不当，则无法观察到损伤通道。此时，PCNA 和 S100β 的上调或 OPC 的聚集均无法检测到。如本文所述，通过系统性表达筛选，比较具有损伤的鱼类大脑与野生型大脑中转录调控因子的表达情况，已鉴定出多个在端脑中表达且在损伤后表达上调的因子。结合例如RNA深度测序和/或原位杂交的阶梯式伤口方法，有助于鉴定参与成年斑马鱼神经发生、再生和修复的新基因。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

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