Name: 诱导蛋白缺失的通过在子宫内电穿孔来定义赤字的神经细胞迁移的转基因模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 了解利用子宫内电穿孔技术分析转基因小鼠模型中神经细胞发育与迁移缺陷的方法。该技术通过靶向基因操作帮助研究者深入理解细胞自主机制与环境相互作用。

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我们感谢Pierre Mattar和Freda Miller在本研究中的协助 在子宫内 电穿孔实验以及Noel Ghanem和Bensun Fong绘制示意图。感谢Linda Jui和Jason G. MacLaurin提供的出色技术支持。设备由卒中恢复中心资助。
本工作获得了 HSFO 和 OGS 提供给 D.S.S. 的奖学金以及 CIHR 提供给 R.S.S. 的资助。

注意：所有实验均经渥太华大学动物护理伦理委员会批准，遵循加拿大动物护理委员会的指南。
1. 术前准备和材料
<ol>
	<li>质粒制备：
	<ol>
		<li>根据制造商的说明书，使用Qiagen MegaPrep试剂盒制备质粒。接种至少400 ml LB液体培养基于转化后的细菌中，以确保获得高产量的DNA，并过夜培养。</li>
		<li>将质粒重悬于100–200 µl TE缓冲液中，终浓度至少为5 µg/µl。分装DNA并储存于-20 °C。若浓度太低，不要进行沉淀和重悬操作，以免引入杂质；应重新开始新的质粒制备。</li>
		<li>手术前，将单个质粒（例如Cre-GFP）用无菌水稀释至2 µg/µl，并在每10或20 µl稀释后的质粒溶液中加入1 µl 0.1% (w/v) Fast Green染料。若GFP和目的基因需通过两个独立的质粒共电穿孔，则应以1:4的比例注射GFP质粒和携带目的基因的质粒，以最大化所有GFP标记细胞同时被两种质粒共转染的可能性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准的拉针仪，以62 °C单步拉制法拉制玻璃毛细管（外径1 mm，后文简称针头）。</li>
	<li>对包含以下物品的手术包进行高压灭菌：持针器、伤口牵开器、镊子、手术剪、针头剪、缝合器、缝合钉、纱布、伤口覆盖物和手术单（图1A、B；材料表）。</li>
	<li>准备其他所需工具：电穿孔仪、Femtojet显微注射仪、Tweezertrodes电极（5或7 mm）、生理盐水、缝合线、5 ml注射器（材料表）。</li>
</ol>
2. 准备小鼠手术
<ol>
	<li>对于镇痛管理，在手术前一小时向妊娠期小鼠注射布托啡诺（0.05 mg/kg 体重）。该方案适用于胚胎发育第12.5天（E12.5）至E17.5期间的任何时间点的小鼠。</li>
	<li>使用微载样移液器吸头将质粒溶液反向装入拉制好的针尖中。暂时不要将溶液完全充满针尖，以免导致针尖堵塞。</li>
	<li>使用2-5%异氟烷气体与1 L/min的O2对小鼠进行麻醉。待小鼠不动后，将其固定于面罩中，并在眼睛上涂抹眼膏以防止角膜干燥。皮下注射1 ml生理盐水（0.9% NaCl）。
	 
	注意：使用异氟烷气体时，应采用废气清除装置回收多余气体，防止其泄漏至实验室内。</li>
	<li>剃除腹部毛发。用氯己定清洗液擦拭腹部，再用水冲洗，最后使用含氯己定和70%乙醇的消毒液进行终末处理。用无菌洞巾或纱布覆盖小鼠身体以遮盖毛发，仅暴露腹部区域（图1C, D）。</li>
</ol>
3. 在体电穿孔
<ol>
	<li>在腹部下部乳头之间的皮肤上做一切口。撕开结缔组织，将皮肤与下方的肌肉层分离，然后沿腹白线切开腹膜进入腹腔。插入伤口牵开器，将伤口边缘撑开。</li>
	<li>将子宫从腹腔中取出，并按图示展开图1E).
	<ol>
		<li>如果需要对不同的幼鼠注射不同的质粒（例如 GFP） 与 将带有目的基因的GFP质粒分配至每侧胚胎，计数每侧的仔鼠数量，并确定每种质粒注射哪些胚胎及注射数量。将一侧子宫放回腹腔，以保持胚胎温暖和湿润。立即用生理盐水（最好预热至体温）润湿暴露的子宫。</li>
		<li>若对所有仔鼠注射相同的质粒（例如将 Cre-GFP 注射到转基因胚胎中），每次仅切除一侧子宫角。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有样品的针头插入注射棒的夹头中，用小型手术剪刀或精细镊子小心地剪去针尖。剪切时应尽量保持针头足够长，同时确保液体能够顺利通过（图1Ji-iv).
	<ol>
		<li>调节显微注射仪的注射时长（秒）和注射压力，使踩下脚踏开关时针尖出现一滴微小但清晰可见的液滴，体积为0.1–0.2 µl。确保不同注射针之间该液滴的体积尽可能一致。 
		注意：此步骤对胚胎存活至关重要（参见讨论部分）。</li>
		<li>使用 Femtojet 时采用以下注射参数：注射压力（pi）= 250–300 hPa；注射时间（ti）= 0.8–1.2 秒；补偿压力 = 10–50 hPa。如有需要，可根据不同注射针的差异对这些参数进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个胚胎，轻轻将其置于背部，头部向上倾斜（图1F). 
	注意：此操作可能需要转动或移动胚胎；操作胚胎时需小心，避免用力过大，防止羊膜囊破裂。</li>
	<li>胚胎就位后，找到呈新月形阴影状且与矢状窦平行的脑室。将针尖以轻微角度接触位于脑室上方的子宫壁，并引导针头穿过子宫壁。所需压力大小取决于针尖的锋利程度。继续推进针头，穿过大脑皮层进入脑室。 
	注意：尽管通常不会检测到明显的额外阻力，但在针头穿过皮层进入脑室时，胚胎头部常会轻微地被推开，随后回弹。</li>
	<li>踩下脚踏泵以注入质粒溶液。持续泵注直至出现绿色区域，并与心室的弧形轮廓一致（图1G在早期胚胎（E12.5 至 E14.5）中，染料通常会扩散至对侧脑室。 
	注意：泵注次数取决于针尖直径、胚胎年龄（以及由此决定的脑室大小）和所需的注射体积。应尽量保持各胚胎间的注射体积一致。</li>
	<li>注射三到四个胚胎。整个操作过程中，保持所有暴露的胚胎处于生理盐水湿润状态。</li>
	<li>回到最初注射的胚胎，放置电极板，使正极将质粒导入大脑的目标区域（图1H将负极电极倾斜，使两电极之间的最短路径直接穿过电穿孔靶向的结构（图2).</li>
	<li>桨叶就位后，施加电击。根据胚胎的年龄和大小，使用5次35–50 V的脉冲（参见 表1）。采用以下电穿孔参数：脉冲时长5毫秒，脉冲间隔950毫秒。对所有显微注射的胚胎重复此步骤。</li>
	<li>剪断新预装针头的尖端，操作同3.3步骤，因为上一根针头在3.9步骤中可能已干燥并堵塞。接着注射下一组三至四个胚胎，可使用相同或不同的质粒，然后按照3.9步骤施加电击。当子宫一侧的所有胚胎均完成注射后，将子宫的另一侧从雌鼠腹腔中取出，同时将已完成注射的一侧放回体内以保持温度。</li>
	<li>将子宫两侧放回母体，注意用生理盐水保持表面湿润，避免施加过大压力，以防损伤羊膜囊。使用连续缝合法缝合肌肉层。用缝钉闭合皮肤。若无缝钉，可使用间断缝合法缝合皮肤。图1I)</li>
	<li>缝合时，逐步降低异氟烷浓度，使妊娠雌性动物的麻醉深度逐渐减轻。 
	注意：手术完成后，这将加快母鼠的苏醒；尽量缩短雌鼠的麻醉时间有助于提高胚胎存活率。从雌鼠首次麻醉开始计算，总手术时间应约为30分钟。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将缝合后的雌性小鼠放入培养箱或置于加热垫上，以恢复麻醉状态。将其安置在清洁的垫料上，并在笼内放置标准恢复凝胶以维持水分。&#160;术后镇痛，给予雌性动物三剂布托啡诺（0.05 mg/kg 体重），每 8 小时一次&#160;手术后按时间间隔给药，随后在12小时时再给予四次额外剂量&#160;间隔。&#160;</li>
</ol>
5. 收集脑组织
注意：大脑可在出生前至成年期的任何年龄段采集。以下步骤适用于出生前大脑的收集。需要注意的是，一旦幼崽出生，子宫内的排列顺序即会丢失，因此必须对同窝幼崽全部注射相同的质粒，或设计其他方法以区分对照组和实验组动物。
<ol>
	<li>在处死雌鼠前，准备好冰冷（4 °C）且经过滤的4%多聚甲醛（PFA）。</li>
	<li>通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）处死雌鼠，并剪开腹部。将子宫两侧拉出，摆放成幼鼠最初注射时的位置。
	<ol>
		<li>如果所有幼鼠接受的是相同的质粒（例如在向转基因仔鼠中注射Cre时），则胚胎顺序无关紧要，因此可将整个子宫从雌鼠体内取出并置于PBS中。</li>
		<li>如果幼鼠注射了不同的质粒，务必在取出子宫前定位每只幼鼠，记录死亡个体，并确定哪些幼鼠注射了对照组和实验组质粒。子宫放入PBS后，需仔细记录每只幼鼠所属的实验分组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逐个取出幼鼠，使用锋利的剪刀或刀片断头，并将头部放入PBS中。对于转基因小鼠，应采集组织样本用于基因型鉴定，并将每个头部单独保存，例如置于12孔板中。</li>
	<li>在解剖显微镜下小心从颅骨中取出脑组织，注意避免损伤皮层或撕裂中线。使用荧光显微镜检查脑组织是否出现GFP+斑块，以判断电穿孔是否成功。</li>
	<li>将脑组织在4 °C条件下浸入PFA中固定过夜。 
	注意：在固定前应先检查脑组织中GFP的表达情况，因为PFA常会淬灭荧光信号。</li>
	<li>在冷冻前，将脑组织浸入20%蔗糖溶液中进行冷冻保护，至少三天。采用10%、15%和20%的蔗糖梯度（每种浓度浸泡24小时），以防止因渗透压变化造成组织损伤。将脑组织冷冻后储存在-80 °C，使用冷冻切片机切成10–14 µm厚的切片。</li>
</ol>
6. 使用抗GFP抗体进行共染色
注意：如果需要进行抗原修复以实现与抗 GFP 抗体的共染色，则必须采用温和的抗原修复方案，以免破坏 GFP 信号。某些抗原修复方案过于剧烈，不适合与 GFP 染色联用（即使使用抗 GFP 抗体也是如此）。在大多数表位检测中，于一抗孵育前进行基础的柠檬酸预处理即可取得成功24。
<ol>
	<li>配制 0.01 M 的柠檬酸溶液于 ddH₂O 中2用校准的 pH 计将 pH 调至 6。</li>
	<li>将染色缸中的柠檬酸溶液在微波炉或水浴中加热至75-80 °C。将玻片放入染色缸中孵育10-15分钟。尽量保持温度稳定。</li>
	<li>用 PBS 在室温下洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗 3 次。加入一抗，并根据标准方案进行免疫染色。</li>
	<li>通过共标记 GFP 和目的基因来验证 Cre 介导的切除，以确认基因敲低图3A).</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

进行该操作时的两个主要挑战 在子宫内 电穿孔过程中，1）防止胚胎死亡，以及2）降低电穿孔之间的变异是两个关键因素。防止胚胎死亡最重要的因素之一是针头质量，因为钝的针头会对胚胎造成更大的损伤。在切割针头时，应尽可能保留较长的针尖，同时确保踩下脚踏泵后能观察到0.1–0.2 µl液体形成可见液滴。 （图1J）如果针头过于钝化或针 shaft 过短，可能导致组织损伤而杀死胚胎。相反，若针尖过于精细，则需要较长时间才能注入足够的质粒体积；针头在脑内停留过久会因操作者手部不可避免的震动以及胚胎的轻微旋转而造成损伤。此外，可使用微切削仪制备具有锋利斜面针尖的注射针，以便对更年轻、更脆弱的胚胎进行注射，但对于 E13.5 及更晚期的胚胎通常无需如此。
怀孕雌性个体的应激水平是影响胚胎存活的另一个关键因素。母体的应激水平越高，越容易发生流产。因此，在手术前后应尽量缩短麻醉时间，并尽可能减少环境更换。遗传背景品系也会影响应激水平，必要时可将易产生焦虑行为的品系与CD1等品系进行杂交，前提是所研究的表型在不同遗传背景品系之间保持一致。
<p ...

径向迁移是早期皮层发育的核心过程。该过程依赖于多种细胞自主性因素，如正确的有丝分裂退出和神经元分化、细胞极性、细胞骨架动态的调控以及跨膜受体的表达，同时也依赖于非细胞自主性因素，例如放射状胶质支架的形成和迁移导向分子的分泌1-3。由于这些机制中任何一项的破坏都可能导致转基因小鼠模型中神经元迁移受损4-8，因此确定迁移缺陷的根本原因可能是一个复杂且困难的过程。在体电穿孔（IUE）可用于辅助并简化对基因敲除模型表型的解释，从而阐明径向迁移所必需的关键机制7,9-11。
在体电穿孔（IUE）是一种将携带目的基因和报告基因的质粒注入小鼠或大鼠胚胎脑室，再通过电流作用使质粒进入脑室壁细胞内的技术12-14。该技术使研究者能够分析目的基因表达上调或下调对电穿孔神经元发育或功能的影响。IUE处理后，脑组织可用于免疫组织化学分析7,9-11、电生理记录15或细胞培养16,17。IUE的主要优势在于可实现对基因表达的高度特异性操控。此外，通过定向电流，IUE还可靶向发育中脑的特定区域（图2）。通过使用不同启动子调控的质粒或质粒激活系统（如四环素诱导的基因表达系统），IUE还可实现对特定细胞类型的靶向操控10,18-21。
IUE 可与 Cre-Lox 介导的基因切除系统结合使用 7-9,11,22。可将含有编码 Cre 蛋白基因的质粒通过电穿孔导入对 floxed 等位基因纯合的胚胎中（该等位基因的基因或特定 DNA 区域两侧各有一个 loxP 位点，可介导 Cre 依赖的 DNA 重组）。Cre 随后将在电穿孔的神经前体细胞中特异性地诱导目的基因的重组，从而实现 floxed 等位基因的敲除。由此可研究蛋白质表达下调对单个神经元内神经元迁移和发育的影响。Cre 的电穿孔仅在少数受影响的细胞群体中诱导重组，从而保持周围支持性环境的完整性。相比之下，在细胞类型特异性启动子调控下实现组织特异性 Cre 表达时，Cre 会在整个组织中广泛表达，导致迁移中的成神经细胞及其周围环境均可能受到影响。因此，通过比较这两种方法，可判断特定的迁移缺陷是由细胞自主性机制还是非细胞自主性机制所致。若在两种实验体系中均观察到迁移缺陷，则表明所观察到的表型源于细胞自主性机制；而若在 Cre 电穿孔后迁移正常，但在组织特异性 Cre 模型中出现迁移缺陷，则表明目的基因通过非细胞自主性机制发挥作用。
IUE 还可用于通过电穿孔将潜在的相互作用基因导入基因敲除动物体内，从而进行挽救实验7,9,10。例如，研究者可以通过电穿孔将一个下游靶基因导入转基因模型中，以尝试挽救细胞迁移表型，并检测电穿孔神经元中的迁移缺陷是否得到纠正。这种方法的额外优势在于，即使周围环境仍缺乏目标基因，成功的挽救结果表明，仅通过调控特定神经元内的蛋白表达即可恢复正常的迁移功能。此外，与杂交或构建新的转基因品系相比，该方法在时间和成本上更为高效，并且能够进一步判断缺陷机制是否为细胞自主性。
IUE可用于通过将报告质粒电转至基因敲除胚胎中，示踪迁移的神经元（图 4C由于只有在手术时位于脑室壁上的神经元才会被电穿孔 17, IUE 可用于追踪特定时间出生的神经元，其优势在于能够可视化这些神经元的形态 体内.
最后，可以利用IUE技术靶向大脑的特定区域，例如内侧或背侧端脑、海马体或神经节隆起（图2）。这使得研究人员能够独立研究特定区域内基因的功能，而不受邻近结构中蛋白质敲低所导致的复杂效应的干扰。
视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）、p107 和 p130 构成口袋蛋白家族，是细胞周期退出的明确调控因子。然而，越来越多的证据表明，这些蛋白还调控神经发育中与细胞周期无关的多个方面。正如我们先前所证明的，pRb 和 p107 在切向4,23和放射状迁移6过程中均发挥关键作用。在此，我们以口袋蛋白家族成员 pRb 和 p107 在神经元迁移中的作用为例6，说明在转基因模型中利用子宫内电穿孔（Cre 的 in utero electroporation）技术的方法。总之，子宫内电穿孔（IUE）是一种分析基因敲除（或过表达）细胞自主性效应的有力手段。当与组织特异性基因敲除模型结合使用时，IUE 可进一步揭示调控神经元迁移的分子机制。

<table><tbody><tr><td>ECM 830 方波电穿孔仪</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>仅电穿孔仪 &amp;ndash; 电缆需单独购买（45-0204）</td></tr><tr><td>ECM 830 用 1250FS 脚踏开关</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td>脚踏板是实现免手操作电穿孔的必要配件</td></tr><tr><td>镊式电极（Tweezertrodes）</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>铂金镊状电极</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>显微注射仪</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>用于固定拉制好的玻璃针</td></tr><tr><td>通用毛细管夹持器</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>连接 Griphead 与管路</td></tr><tr><td>注射管</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>连接毛细管夹持器与 Femtojet</td></tr><tr><td>脚踏控制器</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>用于免手操作注射的脚踏板</td></tr><tr><td>Microloader 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>用于向拉制毛细管中加样</td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>含 5 个 QIAGEN-tip 2500、试剂和缓冲液</td></tr><tr><td>亮蓝 FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>无毒染料</td></tr><tr><td>超精细 Bonn 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>用于修剪注射针</td></tr><tr><td>Bonn 斜视剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>直型</td></tr><tr><td>Colibri 牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>缝合器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>用于 7 mm 夹子</td></tr><tr><td>Castroviejo 针持</td><td>Medical Tools</td><td>SNH-6737</td><td>直型，带锁扣</td></tr><tr><td>玻璃微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>用于拉制微毛细管</td></tr><tr><td>微毛细管</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>内径 0.4 mm 的玻璃毛细管</td></tr></tbody></table>

通过诱导实现蛋白质删除 子宫内 电穿孔法在转基因模型中界定神经元迁移缺陷

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

利用转基因小鼠品系中的 Cre-Lox 系统进行基因删除是研究蛋白质功能的有力工具。然而，除了极少数特定的 Cre 模型外，在整个组织或细胞群体中广泛删除某种蛋白质通常会因多种相互作用的机制而产生复杂的表型。要判断某一表型是由细胞自主性机制（即细胞自身内在的机制）破坏所致，还是由非细胞自主性机制（即由该细胞所处环境受损引起）导致，往往难以区分。为了深入了解蛋白质在 in vivo 条件下的功能，胚胎内电穿孔技术（in utero electroporation, IUE）能够在发育中的大脑皮层或其它选定脑区内的少数细胞中实现基因删除。IUE 可用于靶向特定脑区，包括背侧端脑、内侧端脑、海马或神经节隆起。该方法使得在健康环境背景下观察细胞自主性基因删除所导致的后果成为可能。本实验方案的目标是展示如何利用 IUE 分析在 floxed 转基因小鼠品系中出现的放射状迁移缺陷，并重点区分蛋白质删除的细胞自主性与非细胞自主性效应。通过比较在整个皮层中进行基因删除所导致的表型与通过 IUE 在有限细胞群体中实现基因删除所产生的表型，可以获得比单独使用任一技术更深入的关于蛋白质在脑发育中功能的认识。

通过改变桨状电极在胚胎头部的位置方向，可以针对大脑的不同区域进行电穿孔（图2）。对于前脑的所有区域，需将质粒注射至侧脑室（若要靶向后脑，则应注射至第四脑室）。通常情况下，应放置电极，使两电极之间的直线穿过目标区域，并使DNA向正极方向迁移。若要靶向外侧皮层（图2A），应将正极置于绿色新月形区域上方，并略微向前倾斜一定角度。对于内侧皮层（图2B），则调换电极方向，使正极位于对侧未注射的脑室上方，此时向前倾斜的角度应更大。若要靶向海马体（图2C），应将正极置于对侧，但使正极向尾侧倾斜（电穿孔操作必须在神经前体细胞仍位于皮层镰部位、尚未迁移到海马体最终位置的发育阶段进行）。若要靶向神经节隆起（图2D），应将电极桨片与胚胎耳部对齐放置，正极略低于负极。上述各电穿孔区域的代表性图像见于图2。
验证电转脑组织中Cre介导的切除效应至关重要。理想的方法是对目标转录本或蛋白进行原位杂交或免疫组织化...

神经元迁移受到多种细胞自主性和非细胞自主性因素的调控。本方案展示了如何 在子宫内 电穿孔可用于确定转基因小鼠的表型是源于细胞内在机制的破坏，还是源于神经元与其环境之间相互作用的受损。

利用转基因小鼠品系中的 Cre-Lox 系统进行基因敲除是研究蛋白质功能的有力工具。然而，除非在非常特定的情况下……

以下实验的总体目标是利用子宫内电穿孔技术转染胚胎前脑的不同区域，分析转基因小鼠模型中神经发育和迁移过程中的缺陷。该方法通过将携带Cre基因及报告蛋白（如GFP）基因的质粒注入胚胎脑室，随后对胚胎头部施加电流，使质粒进入脑室壁的细胞内。第二步，将胚胎重新放回母鼠腹腔，使其继续发育，期间Cre表达并介导在电穿孔的神经元中特异性地进行基因切除。接下来收集胚胎，固定脑组织以进行分析，从而确定CRE介导的基因切除及随后在电穿孔神经元中蛋白质表达下调所产生的效应，获得的结果表明，通过免疫组织化学方法，目的基因的切除如何以细胞特异性的方式调控神经发育和迁移。与现有的组织特异性转基因CRE品系等方法相比，该技术的主要优势在于，CRE的电穿孔仅使研究者选定的脑区中一小部分神经元内的目的基因被切除，这大大简化了实验结果，便于表型分析。该技术的可视化演示至关重要，因为手术步骤学习难度较大，且此阶段的胚胎非常脆弱，容易在操作中意外受损。手术前，将单个质粒用无菌水稀释至每微升含2微克，并在每10或20微升稀释后的质粒溶液中加入1微升浓度为0.1%（质量/体积）的快绿染料。接着，在标准微电极拉制仪上以62摄氏度单步程序拉制玻璃微毛细管。然后使用微量进样器吸头将拉制好的针头从后端装载质粒溶液。不要将液体完全填充至针尖，否则会导致针头堵塞。在此操作中，于麻醉后的妊娠小鼠腹部下部睾丸之间的皮肤上做一切口。通过撕裂结缔组织，将皮肤与下方的肌肉层分离。然后沿肘线切开腹膜进入腹腔。插入伤口牵开器将切口边缘拉开。随后将子宫从腹腔中取出，并按图示展开。若需对不同的幼鼠注射不同的质粒，应先清点每侧的幼鼠数量，并确定每侧哪些幼鼠以及多少只幼鼠将接受何种质粒的注射；随后将子宫的一侧放回腹腔，以保持胚胎温暖和湿润，并立即用温热的生理盐水润湿暴露的子宫。接下来，将装有液体的针头插入注射装置的握持头中。使用小型手术剪刀或精细镊子小心剪去针尖，注意在确保液体能够顺利通过的前提下，尽量使针头保持较长。 然后调整显微注射器的注射时长和注射压力，使针尖出现一滴体积为0.1至0.2微升、微小但清晰可见的液滴。踩下脚踏开关时，应尽量保持不同注射针之间该液滴体积的一致性。现在选择一个胚胎，轻轻将其背部朝下放置，并使头部略微向上倾斜。将胚胎放置到位后，找到脑室，其表现为与矢状窦平行的新月形阴影。用注射针针尖以轻微角度接触脑室上方的子宫壁，并引导针头穿过子宫壁。然后将针头推过皮层进入脑室。接下来，踩下脚踏板以注入质粒溶液。持续踩踏，直至观察到绿色区域显现并符合心室的弧形轮廓。在幼小的胚胎中，染料通常会扩散至对侧心室。总共注射大约三到四个胚胎，并在整个操作过程中始终保持所有暴露胚胎的湿润，使用生理盐水。从第一个已注射的胚胎开始，放置电极板，使正极能够将质粒引入大脑的目标区域。调整负极的角度，使两电极之间的最短路径直接穿过需要进行电穿孔的结构。将电极放置到位后，施加电击。根据胚胎的年龄和大小，使用5次脉冲，电压为35至50伏，脉冲时长为5毫秒，脉冲间隔为950毫秒。进行电穿孔时，对所有已注射的胚胎重复此步骤。随后，将子宫的两侧放回小鼠体内。注意用生理盐水保持表面湿润，并避免施加过大压力，以防对羊膜囊造成损伤。接下来，使用连续简单缝合法缝合肌肉层。然后用缝合钉将皮肤缝合。现在准备4摄氏度的过滤过的4%PFA。通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠处死动物后，切开腹部。然后将子宫的两侧拉出，按照最初注射幼鼠时的方式展开。如果幼鼠注射了不同的质粒，务必定位每只幼鼠，记录任何死亡的幼鼠，并确定哪些幼鼠注射了对照质粒和实验质粒。在将子宫从雌鼠体内取出之前，需逐个将每只幼鼠从子宫和羊膜囊中取出。使用锋利的剪刀或剃须刀片断头，并将头部置于 PBS 中。对于转基因小鼠，采集组织样本用于基因分型，并将每个头部单独存放，例如放置于体视显微镜下的 12 孔板中，小心地从颅骨中取出脑组织，注意避免划伤皮层或撕裂中线。使用荧光显微镜检查脑组织是否具有 GFP 阳性区域，以确认电穿孔是否成功。随后，将脑组织在4°C条件下用PFA固定过夜。现在，将pH值先前调至6的柠檬酸溶液置于染色缸中，在微波炉或水浴中加热至75至80°C。然后将载玻片放入染色缸中处理10至15分钟。随后，在室温下用 PBS 每次洗涤载玻片 3 分钟，共洗涤 3 次。加入一抗，并根据标准实验流程进行免疫染色。然后通过共标记 GFP 和目的基因以确认基因敲低，从而验证 CRE 介导的切除效果。该图显示了通过共染色被删除基因的下游靶标来确认CRE介导的切除。RB Flocked、P107敲除P130 Flocked胚胎分别转染空载体PCI2质粒或PCI2-Cre质粒，并对GFP和KI-67（细胞增殖标志物）进行染色。在转染了Cree的神经元中观察到双染细胞，但在仅转染psig的神经元中未观察到双染细胞。通过使用基因分型引物对从载玻片上移除的组织切片中提取的DNA进行PCR，进一步验证了RB基因的切除。上方条带代表F flox等位基因，下方条带代表野生型等位基因。箭头指示的是脑部电穿孔侧被切除的等位基因。仅通过 CRE 介导的切除也可以在体外使用带有同向终止密码子的质粒进行验证。在 RFP 上游，例如 NL DS Red RFP，仅当与 Cree GFP 共同转染至 HEK 293 细胞时，在 HEK 细胞中表达，表明切除成功。采用该技术后，还可使用其他方法，如细胞培养、免疫组织化学或电生理学，以回答关于 c 介导的基因切除后单个神经元发育与功能的其他问题。观看该技术后，您可以看到如何利用子宫内电穿孔技术靶向大脑的不同区域，这将有助于深入理解我们在不同转基因动物中观察到的一些复杂表型。

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科研

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Developmental Biology

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