Name: 鼠回结肠肠管切除原发性吻合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习小鼠回结肠切除与端端吻合技术，通过结扎回结肠血管、切除缺血肠段并构建吻合口，为研究肠道切除术后疾病模型提供可靠的手术方法。

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我们谨此感谢加拿大外科研究基金、埃德蒙顿市公务员研究援助基金以及通过阿尔伯塔创新署拨款资助的阿尔伯塔炎症性肠病联盟所提供的资金支持。

动物使用方案已获得阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会的批准。
1. 仪器、动物和手术装置的准备
<ol>
	<li>在手术前24小时，将动物转移至新的清洁笼具中，并移除所有固体食物。动物可自由饮水，并可随意摄取液体饮食直至手术开始。</li>
	<li>对手术所需的所有器械进行高压灭菌。使用70%乙醇清洁手术台面和麻醉鼻罩。</li>
	<li>在手术台面上合理布置手术显微镜、麻醉机及相关用品，确保术者操作舒适。术者肘部应能自然 resting 在手术台上，双手和前臂不受设备阻碍。手术器械、缝线、棉签和10 ml注射器应放置在术中易于取用的位置。</li>
	<li>设置上方的加热灯，既为动物在手术过程中提供保温，也为手术区域提供照明。</li>
	<li>用0.9%生理盐水填充一个50 ml锥形管，另取一个1.5 ml离心管装入凡士林，并将其置于手术台附近。 
	注意：所有器械和外科用品均需灭菌。由于手术涉及肠道横断，该操作本身不属于无菌手术，而被视为清洁-污染手术。应采取措施避免外源性感染源的引入。</li>
</ol>
2. 回结肠切除术与吻合术
<ol>
	<li>通过异氟烷挥发器经鼻罩以 2 L/min 的氧气流速给予 4% 异氟烷诱导麻醉，直至动物呼吸频率减慢至约 30–40 次/分钟。在开始操作前，对小鼠后肢足部施加中等压力，确认无疼痛反应。此时将异氟烷浓度下调至 2%，氧气流速调至 0.5 L/min。在手术过程中间歇检查疼痛反应，并相应调整异氟烷流速。</li>
	<li>在眼睛上涂抹凡士林以防止手术期间角膜干燥，并使用透明胶带固定四肢，将小鼠保持仰卧位固定。</li>
	<li>用聚维酮碘溶液清洁腹部，并更换为新的无菌手套。</li>
	<li>使用尖头解剖剪在腹部上中线处作一个 1.5 cm 的皮肤切口，暴露筋膜和腹膜。沿腹白线以类似方式切开筋膜/腹膜层，以暴露腹腔内容物。</li>
	<li>与人类不同，小鼠的盲肠通常位于腹部左上象限。确认盲肠后，用镊子轻轻夹住并将其经切口引出。使用湿润的棉签将自盲肠延伸出的约 3 cm 的末端回肠在覆盖于腹部表面的无菌纱布上展开（图&#160;1A）。在整个操作过程中，确保暴露的肠段始终用 0.9% 生理盐水保持湿润。</li>
	<li>在手术显微镜下识别沿结肠走行的回结肠动脉（图&#160;1A）。分离回结肠动脉周围的无血管组织，环绕并以 5-0 丝线结扎该动脉。随后，定位末端回肠的区域血供，并选择距离回盲部 1.5–2 cm 近端处作为切断点。按上述方法结扎该段回肠的供血分支。使用显微解剖剪切断动脉。</li>
	<li>切断回肠和结肠的缺血部分，确保断端具有充足的血液供应（图&#160;1B）。为增大管腔直径，使其更接近结肠口径，常可将回肠以 30 度角斜行切断。切除回盲部肠段后，将回肠与结肠的断端在纱布上对齐，确保各自的系膜缘对齐。</li>
	<li>使用间断的 8-0 聚丙烯缝线将回肠断端与结肠断端吻合（图&#160;1C）。第一针缝合位于系膜侧，随后每隔 0.5 mm 缝合一针，直至回结肠吻合口完全密闭。缝针穿过回肠和结肠时，应确保切缘不发生卷曲，进针点距离肠壁切缘 0.5 mm。一次典型的吻合通常需要 14 至 16 针间断缝合。完成吻合后，通过将棉签自近端向远端在回肠上滚动，推动内容物通过吻合口，以检测吻合口的完整性和通畅性。小肠内容物应能自由通过吻合口，无渗漏现象。</li>
	<li>用 10 ml 注射器中的 3–4 ml 0.9% 生理盐水冲洗暴露的肠段，清除肠表面的粪便，然后将肠管还纳至腹腔。使用 2 ml 0.9% 生理盐水冲洗腹腔，随后通过轻压腹壁侧方将液体排出。</li>
	<li>用 3-0 丝线连续缝合关闭切口，并停止异氟烷供气。皮下注射 0.1 mg/kg 长效阿片类药物——丁丙诺啡，用于术后镇痛。</li>
	<li>在加热灯下观察动物直至其恢复活动能力，然后将其转移至持续保温的笼具中。</li>
</ol>
3. 术后护理与监测
<ol>
	<li>当天剩余时间内将动物置于持续保温的笼子中，持续监测其痛苦迹象。将动物转移回动物饲养设施，放入新的无菌笼子中，并可自由获取液体饮食和饮水。动物可每3-4只一组共同饲养。</li>
	<li>术后次日早晨检查动物，确保动物无痛苦表现。仅饲喂液体饮食。若动物表现出不适（即， 若动物出现弓背姿势或活动极少，应追加一次皮下注射布托啡诺。在术后第1天下午再次检查动物一次。</li>
	<li>术后第2天早晨，动物应已完全恢复。进食和排便情况良好是恢复正常的积极迹象。此时可恢复动物的固体饲料饮食。 
	注意：动物痛苦的迹象包括弓背姿势、毛发凌乱及活动减少。若动物出现明显的痛苦迹象，应实施安乐死。</li>
	<li>使用4%异氟烷在O₂中诱导深度麻醉，使动物安乐死2 以2 L/min的流速持续通气，直至动物对足部压力无反应。实施颈椎脱位术，并观察安乐死成功的迹象。</li>
	<li>指南各不相同，因此请参考相关机构关于小鼠安乐死适应证及适当方法的建议。</li>
</ol>

<ol><li>Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neo-adjuvant+chemoradiotherapy+and+multivisceral+resection+to+optimize+R0+resection+of+locally+recurrent+adherent+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer.</a> European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).</li>
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<li>Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+review%3A+Healing+in+gastrointestinal+anastomoses%2C+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I.</a> Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

ICR 小鼠是一种强大的模型，可用于研究手术对肠道疾病的影响。本文介绍了一种在小鼠中实施 ICR 的方法，成功率高达 95%，且术后体重稳定，持续至术后 28 天，未出现生长不良问题。成功实施 ICR 面临的最主要挑战包括避免吻合口处发生肠梗阻和吻合口漏。
为预防梗阻，手术中的技术要点在于尽量增大吻合口处的管腔直径。在横断回肠时，将肠管以30度角进行斜行切开（即扩口处理），可增加管腔直径，如图&#160;1A所示。使用缝合针夹取肠壁组织时，必须将肠管边缘展平，并使针距切缘约0.5 mm处进针。若缝合组织过多，将导致管腔狭窄。在构建吻合口时，为避免管腔狭窄，可选择使用可降解支架，具体方法如Kiernan et al.15所述。为避免梗阻的非技术性措施包括：选用足够细的缝线4，以及在术前1天至术后2天内给予动物液体饮食，以减少管腔内容物的体积。
术后死亡的第二大常见原因是吻合口漏。避免这一并发症需要严格遵守肠道吻合的基本原则。第一条是保...

回结肠切除术（ICR）是一种常用于多种疾病的急诊和择期手术。克罗恩病和结肠癌是实施 ICR 的两个最常见指征。在这两种疾病中，术后肠道手术部位的复发均构成重要的临床问题。即使采用最彻底的切除术，结肠癌的局部复发率仍是一个难题1。在克罗恩病患者接受 ICR 术后，高达 80% 的患者在术后 1 年内于新末端回肠处出现疾病复发2。鉴于这两种疾病的影响及其术后复发情况，了解 ICR 术后局部肠道因素对疾病自然病程的内在影响显得尤为重要。此外，还需关注 ICR 术后的吻合口愈合情况。在术后早期，吻合口漏可对患者造成严重后果，导致再次手术、造口形成、显著的并发症发生率甚至死亡3。尽管该课题至关重要，但目前关于吻合口愈合的研究仍处于初级阶段。ICR 的动物模型，尤其是小鼠模型，是研究术后肠道及吻合口愈合过程的优良平台。
ICR 小鼠模型最初由 Helmrath et al. 建立，用作短肠综合征的研究模型4。作者尝试了多种饮食方案和缝合线规格，以优化 ICR 术后动物的存活率。他们得出结论：在围手术期给予液体饮食，并使用 9-0 单股缝合线，可使术后存活率达到最佳的 88%。自该初步研究发表以来，切除小鼠 50% 小肠的 ICR 模型已被多项研究采用，用于探索大范围小肠切除后的动态变化及适应性生长反应，旨在为短肠综合征开发新的治疗方法5,6。
首次将ICR小鼠模型应用于克罗恩病的研究采用了IL-10-/-小鼠模型，该模型可自发产生结肠炎7。研究发现，在进行回肠造口再吻合术（ICR）后，这些动物的新生末端回肠出现炎症，类似于术后克罗恩病患者的表现，且这种炎症依赖于细菌的存在7。最近，该模型被用于探索ICR诱导的细菌变化。在克罗恩病中，存在菌群失调，表现为具有抗炎特性的细菌相对减少，而侵袭性细菌种类增加8,9。这一关联在术后复发病例中同样成立10。两项研究旨在识别由ICR引起的微生物变化。第一项研究使用了IL-10基因敲除小鼠，并通过变性凝胶电泳比较ICR术后小肠与结肠之间的细菌相似性11。该研究表明，ICR术后小肠和结肠中的细菌种群趋于相似。随后的另一项研究采用野生型小鼠，并在术后利用16S焦磷酸测序对细菌种类进行系统发育分类。该研究显示，仅手术本身即可导致细菌种类发生显著改变，其中梭菌属（Clostridium）成为优势菌群，同时γ-变形菌（ϒ-proteobacteria）数量增加。研究结果还证实了先前研究的发现，即ICR术后小肠与结肠中存在相似的菌群组成12。
对于累及盲肠和升结肠的结肠癌患者，回盲部切除术（ICR）是一种常见手术方式。目前越来越认识到，机体对手术的应答可能在局部和远处肿瘤复发中均发挥重要作用13。尽管有此认识，ICR 的动物模型尚未被用于结直肠癌及术后复发的研究。深入了解 ICR 所引起的全身性和局部免疫学变化，对于探索未来治疗策略具有重要意义。ICR 术后癌症复发可能涉及的潜在通路包括：生长因子上调，可能使肿瘤细胞逃逸凋亡并促进其增殖；机械性肿瘤破坏导致细胞脱落；以及术后免疫抑制引起的免疫监视功能下降13,14。
ICR 小鼠模型在研究短肠综合征、克罗恩病和结肠癌方面具有重要潜力。该模型还可通过进一步明确新构建吻合口愈合过程中涉及的细胞和生化通路，为预防术后早期吻合口并发症提供重要启示。目前应用小鼠 ICR 模型的主要障碍在于其技术难度较高。肠道吻合需要使用 8-0 或 9-0 缝线、手术显微镜，并具备显微外科技术的培训背景。本文旨在提供清晰的操作指南，以指导在小鼠中实施 ICR 手术，从而推动该技术在疾病模型中的应用。

<table><tbody><tr><td>LD101 液体啮齿动物饲料</td><td>testdiet.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td>Baxter</td><td>FKE1324</td><td>注射级生理盐水</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Ziess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉蒸发器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-0483</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott&amp;nbsp;</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td></td><td></td><td>用作手术台面</td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 微型持针器，弯型</td><td>World Precision Instruments</td><td>503377</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 直剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>555530S</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>敷料镊 × 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>500363</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线预剪缝线</td><td>Ethicon</td><td>A182H</td><td>用于血管结扎</td></tr><tr><td>8-0 Prolene 缝线，带 BV130-5 针</td><td>Ethicon</td><td>8732H</td><td>用于吻合术</td></tr><tr><td>3-0 丝线，带 FS-2 针</td><td>Ethicon</td><td>8665G</td><td>用于腹壁关闭</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Vaseline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% 聚维酮碘外科洗手液</td><td>&lt;a href=&quot;http://betadine.com">betadine.com&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.&amp;nbsp;</td><td>PL36699/0006</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠回结肠切除术及一期吻合

Murine Ileocolic Bowel Resection with Primary Anastomosis

肠道切除术常用于治疗累及胃肠道的疾病，克罗恩病和结肠癌是其中两个常见例子。尽管此类手术十分常见，但在描述肠道切除对宿主生理及疾病病理生理内在影响方面，仍存在显著的知识空白。本文提供了小鼠回结肠切除术及一期端端吻合术的详细操作步骤，以及为最大限度提高术后成功率所必需的围手术期护理要点。若严格遵循本方案，长期存活率可达95%，无发育不良情况，且能最大程度减少术后肠梗阻和吻合口漏等并发症。由于在小鼠中实施该手术存在技术难点，限制了其在科研中的广泛应用。本文所述技能无需先前外科经验即可掌握。一旦熟练掌握，小鼠回结肠切除术将成为研究肠道切除在人类疾病模型中作用的可重复性工具。

术后死亡率及体重变化。 
129S1野生型小鼠接受ICR手术后的死亡率通常约为5%。最常见的死亡原因为吻合口处的肠梗阻。其他死亡原因包括吻合口漏和内疝导致的肠梗阻。
术后体重下降可持续至14天，但通常无显著性差异。小鼠通常在术后第28天完全恢复至术前体重（图 2）。
技术的可转移性 
为评估无外科手术经验的操作者是否能够掌握该技术，对一名新入学的研究生（BM）进行了ICR手术操作培训。培训首先从学习使用8-0尼龙缝线进行单个间断缝合开始，该缝合方式与吻合术中所用的缝合方法类似。练习时，先在乳胶手套上切开切口，再用缝线将其闭合。当BM能够在不撕裂手套的前提下高效完成缝合后，其先观摩了三例完整的手术操作，然后尝试独立完成第一例手术。完成首例手术后，又观摩了一次手术，并相继尝试了另外两例。在BM完成的三例动物实验中，后两例动物术后存活良好，而第一例动物因吻合口并发症被实施安乐死。
<p class="jove_content" fo:keep-...

回结肠切除术常用于治疗多种人类疾病，但关于肠道切除对手术相关疾病影响的研究仍较少。本文介绍了在小鼠中成功实施该手术的操作步骤，为研究回结肠切除术在疾病模型中的影响提供了方法。

肠道切除术常用于治疗累及胃肠道的疾病，如克罗恩病和结肠癌……

本操作的总体目标是切除回肠末段和盲肠，并进行回肠-结肠吻合术。首先结扎回盲部的血液供应，第二步是切除缺血的肠段。接下来，构建回结肠吻合口。最后一步是检查吻合口的完整性和通畅性。最终，评估术中结肠镜（IOC）对结肠的影响。切除术可在多种疾病模型中确定。因此，该方法的可视化演示至关重要，因为切除与吻合操作需要高度精确的解剖细节。开始时，将动物转移至一个新的清洁笼具中，术前24小时禁食固体食物，但可自由饮水和摄入液体饮食，直至手术开始。提前对操作所需的所有器械进行高压灭菌，并使用70%乙醇清洁操作台面和麻醉鼻罩。接着，在工作区域内合理安置手术显微镜、麻醉机及外科手术用品。器械、缝线、棉签和10毫升注射器应放置在便于操作过程中取用的位置。在操作过程中，设置一个上方加热灯，以提供 warmth（温暖）并为操作区域提供照明。最后，取一支 50 毫升的锥形管，装入 0.9% 生理盐水，另取一支 1.5 毫升的离心管，装入石蜡油，并放置在操作区域附近。准备就绪后，确认麻醉小鼠的镇静深度。完全麻醉后，降低异氟烷和氧气的流速。在操作过程中定期检查疼痛反应，并相应调整异氟烷的流速。在眼睛上涂抹凡士林后，用透明胶带固定四肢，将小鼠以仰卧位固定。接下来，使用聚维酮碘溶液清洁腹部。随后，更换为新的无菌手套。在腹部正中上方做一道1.5厘米的切口，暴露筋膜和腹膜；一旦暴露，切开白线以显露腹腔内容物。与人类不同，小鼠的盲肠通常位于腹腔的左上象限。确认后，用镊子轻轻夹住盲肠，并将其经切口引出。在腹部表面放置无菌纱布，用湿润的棉签将从盲肠延伸出的约三厘米长的末端回肠展开。在整个手术过程中，确保暴露的肠管用0.9%生理盐水保持湿润。使用手术显微镜，沿结肠寻找由肠系膜上动脉分出的回结肠动脉。分离回结肠动脉周围无血管的组织。分离后，用5.0丝线结扎动脉并打结。接着，找到回肠末端的区域血供，并在回盲瓣连接处近端0.1至2厘米范围内选择横断位置。结扎供应该段回肠的血管分支（如前所示），并用显微解剖剪剪断动脉。切除回肠和结肠的缺血部分，并确保横断端有充足的血液供应。通常可将回肠以30度角斜行切开，扩大其管腔直径，使其更接近结肠的管径，这一步骤常有帮助。接下来，将回肠和结肠的横断端置于纱布上并对齐，确保各自的肠系膜边缘对齐。将回肠横断端与结肠横断端对合，构建吻合口。使用间断的8-0聚丙烯缝线，第一针缝合位于肠系膜侧边缘，随后每隔0.5毫米缝一针，直至结肠吻合处。吻合口应严密不漏水。缝合针穿过回肠和结肠时，应确保切缘未发生卷曲，且进针点距离肠管切缘0.5毫米。通常吻合口需要14至16针间断缝合。完成吻合后，通过将棉签从近端向远端沿回肠滚动，以检测吻合口的完整性和通畅性。为促使内容物通过小肠，应确保内容物可自由进入结肠，且无吻合口漏出。使用10毫升注射器中的3至4毫升0.9%生理盐水冲洗暴露的肠段，以清除肠表面的粪便，然后将肠管送回腹膜腔。使用2毫升0.9%生理盐水。冲洗腹腔。通过轻柔地从侧面按压腹壁来引流液体。使用3.0丝线连续缝合关闭切口。停止异氟烷的通气，并给予镇痛药以控制术后疼痛。将动物置于加热灯下观察，直至其恢复活动能力，然后转移至持续保温的笼子中。在持续保温的笼子中监测动物是否有痛苦迹象。当天其余时间，将动物转移回动物护理中心，放入新的无菌笼具中，并提供液体饲料和水，添加 libido。术后第一天早晨检查动物状况。如果动物表现出不适，可在术后第二天再给予一次布托啡诺剂量。它们应表现为完全恢复。排便和进食是恢复良好的积极迹象。若观察到这些情况，则可恢复固体饲料饮食。再次观察，与基线相比，在术后第14天和第28天，各组之间的体重差异均无统计学意义。回肠和结肠的H&E染色组织切片排列展示缝合针穿过组织的轨迹，从A点开始至B点结束。结应打在C点，因此一旦掌握，若操作得当，该技术可在约45分钟内完成。

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