Name: 增强的减少表示亚硫酸氢盐测序的DNA甲基化的评估，在碱基对决议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学习增强型简化代表性亚硫酸氢盐测序技术，通过限制性内切酶消化与亚硫酸氢盐转化相结合，实现碱基对分辨率的DNA甲基化分析。该方法适用于少量起始材料，可生成高覆盖度的表观遗传学数据，助力疾病状态与正常对照的比较研究。

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我们感谢原始ERRBS报告的所有作者。感谢Mame Fall提供的技术协助。我们感谢威尔康奈尔医学院表观基因组学核心实验室提供的技术服务和帮助。本工作获得了Sass基金会Judah Folkman奖学金、NCI K08CA169055和ASH-AMFDP12005（授予FGB）、NIH R01HG006798和R01NS076465、Irma T. Hirschl和Monique Weill-Caulier慈善信托基金以及STARR联盟（I7-A765）（授予CEM）的资助，以及LLS SCORE基金（7006-13，授予AMM）的支持。

注意：本研究已获得威尔康奈尔医学院机构审查委员会的批准（方案编号 0805009783），并按照赫尔辛基宣言的规定进行。
注意：使用前请查阅相关材料的安全数据表（在本方案中以“注意”标示）。所用的多种试剂具有毒性，建议采取适当的安全防护措施（包括个人防护装备和通风橱）。
注意：除非另有说明，本方案中的所有步骤均在室温下进行
1. 基因组DNA的制备与消化
<ol>
	<li>以 50 微升（µl）无 DNase 水中的 50 ng 高质量基因组 DNA（&#62; 人类 DNA 大小超过 40 千碱基）作为起始材料。根据制造商推荐的方法，使用基于荧光的定量检测法对 DNA 进行定量。</li>
	<li>将 50 ng DNA 与 2 µl MspI（100,000 单位/毫升）、10 µl 相应的 10× 反应缓冲液以及无 DNase 水混合，使反应总体积达到 100 µl。</li>
	<li>将反应液置于 37 °C 的热循环仪或水浴中孵育至少 18 小时。</li>
	<li>DNA 提取与沉淀
	<ol>
		<li>使用苯酚-氯仿抽提法纯化已消化的 DNA。
		<ol>
			<li>向步骤 1.3 中的每个反应液加入 200 μl 的 10 毫摩尔/升（mM）三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-Cl）pH 8.0 缓冲液，使总体积达到 300 μl。</li>
			<li>在通风橱中，向 DNA 溶液中加入 150 µl Tris-乙二胺四乙酸（TE）饱和苯酚和 150 µl 氯仿混合液（1:1；注意：有危险），短暂涡旋混匀。</li>
			<li>在室温下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 10 分钟。</li>
			<li>将上一步所得的上层水相（约 300 µl）转移至新管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用乙醇沉淀法沉淀已消化的 DNA。
		<ol>
			<li>向每管中加入 1 µl 糖原（20 毫克/毫升）、1/10 体积（30 µl）的 3 M pH 5.2 醋酸钠溶液和 2.5 体积（750 µl）室温 100% 乙醇。高速涡旋混匀。</li>
			<li>在 4 °C 下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 45–60 分钟。</li>
			<li>迅速倒置管子，并用手腕快速轻弹管壁，使管子在纸巾上滑过，快速去除乙醇。确保 DNA 沉淀仍附着在管壁上。</li>
			<li>向每管中加入 600 µl 室温 70% 乙醇。观察沉淀从管壁脱落。轻轻翻转管子 5 次以混匀。</li>
			<li>在 4 °C 下，以 20,800 × g 在微量离心机中离心 45–60 分钟。</li>
			<li>迅速倒置管子，并用手腕快速轻弹管壁，使管子在纸巾上滑过，去除乙醇。</li>
			<li>小心吸除残留液体，尽可能去除所有乙醇。可使用带有无 DNase 10 µl 吸头的真空装置吸除残液，必要时让沉淀在空气中干燥，以彻底去除残留乙醇。 
			注：避免过度干燥沉淀，否则会影响下一步重悬时的溶解性。</li>
			<li>将 DNA 沉淀重悬于 30 µl 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）（缓冲液 EB）中。 
			注：为防止 MspI 消化产生的“粘性”CG 突出端重新退火，必须在同一天内完成从本步骤至连接步骤（方案步骤 4）的全部操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 末端修复
<ol>
	<li>将30 µl MspI消化的DNA（来自步骤1.4.2.8）转移至冰上（4 °C）的PCR管中，并加入表1中的试剂。</li>
	<li>在热循环仪中，于20 °C孵育末端修复反应30分钟，热盖开启。</li>
	<li>使用商业化的基于离心柱的纯化试剂盒纯化DNA产物，以去除未掺入的dNTPs及其他反应试剂；该试剂盒依据制造商建议，在高盐缓冲液条件下结合DNA，并在低盐缓冲液条件下洗脱DNA。用32 µl Buffer EB洗脱DNA产物。</li>
</ol>
3. A尾添加
<ol>
	<li>将步骤 2.3 中的 32 µl DNA 溶液转移至冰上（4 °C）的 PCR 管中，并加入表 2 中所列的试剂。</li>
	<li>在热循环仪中，于 37 °C 孵育 A-tailing 反应 30 分钟，热盖开启。</li>
	<li>使用基于商品化柱的纯化试剂盒纯化 DNA 产物，以去除未掺入的 dATP 及其他反应试剂；该试剂盒依据制造商建议，在高盐缓冲液条件下结合 DNA，并在低盐缓冲液条件下洗脱 DNA。用 10 µl Buffer EB 洗脱。</li>
</ol>
4. 连接接头
<ol>
	<li>将10 µl的A尾DNA转移至冰上（4 °C）的PCR管中</li>
	<li>按照表3中详述的成分向DNA中加入连接反应试剂，并按照表4中详述的成分加入接头</li>
	<li>在热循环仪中于16 °C孵育连接反应过夜，热盖保持开启状态</li>
	<li>使用固相可逆固定化（SPRI）磁珠分离法，按照试剂制造商的建议纯化连接产物。例如，使用Agencourt AMPure XP磁珠时，磁珠体积与样品体积的比例为1.8X（对于50 µl的连接反应，使用90 µl磁珠）。用30 µl无DNase的水洗脱产物。
	<ol>
		<li>连接后的DNA可在进行片段大小选择前于-20 °C保存</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 大小筛选
注意：根据 DNA 起始量选择第 5.1 节中的自动化片段筛选方案或第 5.2 节中的手动凝胶回收片段筛选方案。对于起始 DNA 量为 25 ng 或以上的样本，可采用自动化片段筛选方案（使用如 Pippin Prep 等仪器）。当 DNA 起始量较低（5–10 ng）时，必须采用手动凝胶回收方法。
<ol>
	<li>使用 Pippin Prep 对输入 DNA 量为 25 ng 或更高的样本进行片段大小选择（图 2A）。
	<ol>
		<li>在 Pippin Prep 上创建一个新的片段大小选择程序。</li>
		<li>选择“2% DF Marker L”作为胶条。点击“使用内部标准”按钮。确认“Ref lane”编号与实际加样孔编号一致。</li>
		<li>为每个孔选择“Range”作为收集模式。在每个孔的 &#34;BP Start&#34; 中输入 135，在 &#34;BP End&#34; 中输入 410，在 &#34;BP Pause&#34; 中输入 240。</li>
		<li>保存该程序。</li>
		<li>向来自连接反应（步骤 4.3）的每份 30 µl 样本中加入 10 µl Marker L，使总体积达到 40 µl。按照标准 Pippin Prep 操作流程准备凝胶胶条和仪器。</li>
		<li>从样本孔中移除 40 µl 电泳缓冲液，并将步骤 5.1.5 中的 40 µl 样本加入无染料凝胶胶条的 5 个孔中。 
		注意：无染料琼脂糖凝胶胶条对于适配子连接的 DNA 片段的片段大小选择至关重要，因为溴化乙锭的存在可能改变叉状适配子结合片段的迁移特性。</li>
		<li>选择在步骤 5.1.1 中创建的程序，并开始运行。</li>
		<li>当运行在 240 个碱基对（bp）处暂停时，从每个使用的孔对应的洗脱模块中收集 40 µl 洗脱液（低片段组分：135–240 bp）。仪器将为每个孔单独暂停。在每个孔于 240 bp 处暂停时，重复步骤 5.1.5–5.1.7。</li>
		<li>用 40 µl 新鲜电泳缓冲液通过移液吹打三次清洗洗脱模块，弃去 40 µl 洗涤缓冲液。额外重复清洗步骤两次，并彻底去除洗脱模块中的残留液体。清洗洗脱模块可减少低片段组分 DNA 向高片段组分收集中的残留。</li>
		<li>加入 40 µl 新鲜电泳缓冲液，重新密封洗脱模块并继续运行。</li>
		<li>当仪器提示洗脱完成时，从每个洗脱模块中收集 40 µl 洗脱液至新管中。此洗脱液包含高片段组分（240–410 bp）。若同时运行多个凝胶胶条，在进行亚硫酸氢盐转化前，将片段大小选择后的样本保存于 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手动凝胶回收法进行片段大小选择（图 2B）
	<ol>
		<li>制备含 0.2 µg/ml 溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶（注意安全）。</li>
		<li>在凝胶两侧相邻的孔中加入用上样缓冲液配制的 50 bp 和 100 bp DNA 标准物。</li>
		<li>向纯化后的连接产物中加入 2 μl 6X 橙色 G 上样染料。将每个样本的全部体积分别上样至独立的孔中，样本之间至少跳过一个孔，以避免交叉污染。</li>
		<li>以每厘米 3.5 伏的电压进行电泳，直至 DNA 标准物完全分离且橙色 G 染料迁移至凝胶底部（至少一小时）。</li>
		<li>使用洁净的剃刀片切下 DNA 标准物条带，并在紫外透射仪上观察（注意安全）。切勿将样本暴露于紫外光下。使用剃刀片或移液器吸头标记标准物的 150 bp、250 bp 和 400 bp 条带。标记标准物条带可使后续样本切胶无需暴露于紫外光下。</li>
		<li>将标准物条带与凝胶其余部分对齐。以标记的条带为参照，切下包含 150–250 bp 文库组分（低片段）的一块凝胶，以及另一块包含 250–400 bp 文库组分（高片段）的凝胶。将这两块凝胶分别放入不同的离心管中。</li>
		<li>对所有样本重复切胶操作，每次使用洁净的剃刀片处理每个凝胶孔。</li>
		<li>使用凝胶回收试剂盒，按照制造商提供的操作说明纯化低片段和高片段文库组分。每份样本洗脱至 40 µl EB 缓冲液中。为确保在步骤 7 中对低片段和高片段文库组分均能高效进行 PCR 扩增，在亚硫酸氢盐转化步骤中需将两组分作为独立样本分别处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 亚硫酸氢盐转化
<ol>
	<li>根据制造商的建议设置亚硫酸氢盐转化对照（例如，Universal Methylated Human DNA Standard 试剂盒）。在亚硫酸氢盐转化过程中，对照样品的处理方式应与待测样品完全相同。</li>
	<li>使用商业试剂盒按照制造商推荐的方案进行亚硫酸氢盐转化。应选用在处理和纯化过程中模板降解和 DNA 损失较少、同时能实现高亚硫酸氢盐转化率的商业试剂盒。若使用 EZ DNA Methylation 试剂盒，则按制造商推荐的方案操作，但以下步骤除外：将样品置于热循环仪中按如下程序孵育：55 个循环：95 °C 30 秒，50 °C 15 分钟，最后在 4 °C 保存。</li>
	<li>用 40 µl 无 DNase 水洗脱样品。应在完成亚硫酸氢盐转化的同一天进行富集 PCR（步骤 7）。经亚硫酸氢盐处理的 DNA 富含 AU 且为单链，稳定性较差。</li>
	<li>通过 Sanger 测序验证所用对照的亚硫酸氢盐转化效率，确保非甲基化胞嘧啶的转化率高于 99%。</li>
</ol>
7. 扩增 PCR
<ol>
	<li>根据表5中的试剂，为每个文库片段配制PCR预混液（优化用于FastStart Taq DNA聚合酶）。</li>
	<li>将PCR预混液加入每个40 µl的亚硫酸氢盐转化后的文库片段中，通过移液混匀。将200 µl反应体系均分为四份，每份50 µl，分装至四个PCR管中。</li>
	<li>在PCR仪中按照以下程序扩增反应：将加热盖温度设为100 oC，先在94 °C下预变性5分钟；进行18个循环的变性、退火和延伸步骤：94 °C变性20秒，65 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟；最后在72 °C下终延伸3分钟，然后在4 °C下保存。 
	注意：对于起始材料量较低（少于10 ng）或首次使用本方案的用户，建议进行18个PCR循环。可根据需要调整PCR循环数（对于50 ng起始DNA，可低至14个循环；参见表6）。</li>
</ol>
8. 纯化 PCR 反应产物
<ol>
	<li>将每组4个反应（每个文库组分包含四个50 µl的PCR反应）合并。</li>
	<li>根据生产商的建议，使用SPRI磁珠法（或其他可去除未掺入引物及其他PCR反应试剂的方法）纯化PCR产物。以下步骤已针对Agencourt AMPure XP试剂进行优化。
	<ol>
		<li>向低分子量组分的扩增产物中加入1.7倍体积的SPRI磁珠（200 μl PCR产物对应340 μl）。</li>
		<li>向高分子量组分的扩增产物中加入1.1倍体积的SPRI磁珠（200 μl PCR产物对应220 μl）。</li>
		<li>按照生产商的建议进行PCR产物纯化，洗涤步骤使用800 µl 70%乙醇。</li>
		<li>用50 µl无DNase的水洗脱，并加入1M Tris缓冲液，使每个文库的Tris-Cl浓度达到10 mM，pH 8.5。将文库储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 文库质量控制
<ol>
	<li>根据制造商推荐，使用针对双链DNA的荧光定量检测法对文库进行定量。基于分光光度法的测量结果不可靠。预期浓度范围为：较低文库组分10 - 50 ng/µl，较高文库组分3 - 15 ng/µl。</li>
	<li>使用生物分析仪（bioanalyzer）及高灵敏度DNA试剂盒评估文库片段大小和质量。观察文库产物并确定各文库组分的平均片段长度。较低文库组分的平均长度通常在180至210 bp之间，较高文库组分通常在280至310 bp之间。</li>
</ol>
10. 准备测序文库
<ol>
	<li>按如下方法计算每个文库组分的摩尔浓度：
	<ol>
		<li>使用步骤 9.2 中获得的图谱对每个文库组分进行片段大小分析。例如，若使用生物分析仪，请使用“区域（region）”功能，并覆盖所评估文库组分的起始和终止位置。</li>
		<li>记录每个文库组分的平均片段大小（单位：bp）。</li>
		<li>使用以下公式计算每个文库组分的摩尔浓度（DNA 的纳摩尔浓度）：DNA 纳摩尔浓度 = [(ng/1000)/(bp×660)]×10^9，其中 ng 表示以 ng/μl 为单位的浓度（如步骤 9.1 所测得），bp 表示文库组分的平均片段大小，660 表示标准双链 DNA 碱基对的分子量。例如：一个片段大小为 326 bp、浓度为 14.2 ng/μl 的文库，其 DNA 纳摩尔浓度为 66 nM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每个文库组分配制 10 µl 浓度为 2 nM 的溶液，使用无 DNase 的水进行稀释。</li>
	<li>将文库组分混合：对每个制备的样本文库，取 10 µl 浓度为 2 nM 的低片段组分与 10 µl 浓度为 2 nM 的高片段组分混合。该混合物即为用于测序的最终 ERRBS 文库。</li>
	<li>对 ERRBS 文库进行测序
	<ol>
		<li>上机时目标密度为每平方毫米 600,000–650,000 个簇（建议上机浓度为 7–8 皮摩尔）。</li>
		<li>在 HiSeq 2500 测序仪的高通量模式下，对文库进行至少单端 51 个循环的测序。</li>
		<li>使用指定的对照泳道（参见讨论部分了解其原理）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 数据分析
注意：有关推荐使用的命令和脚本的完整详细信息，请参阅补充代码文件 1 和 2。
<ol>
	<li>使用测序仪制造商提供的软件（例如：Illumina 的 CASAVA v1.8.2）将碱基识别文件（.bcl 文件）转换为每个样本对应的独立 FASTQ 文件。如果使用测序核心平台，此步骤可能由平台提供并/或在测序计算机上自动完成。</li>
	<li>对测序读段进行过滤，保留通过质量筛选的读段（详见补充代码文件 1）。CASAVA 生成的 FASTQ 文件包含通过和未通过质量筛选的读段。使用自定义脚本，利用序列标识符中的 &#60;is filtered&#62; 元素，仅保留通过质量筛选的读段。</li>
	<li>使用能够去除接头序列的软件工具（如 Flexbar37），从过滤后的 FASTQ 文件中读段的 3' 端切除接头序列。设置最小重叠长度（-ao）为 6，去除接头后保留的最小读段长度（--m）为 21，允许错配数的阈值（-at）为 2，其余参数使用默认值。作为 Flexbar 的替代方案，步骤 11.3 中可使用任何具备接头去除功能的软件（例如：cutadapt38、trimmomatic39）。</li>
	<li>使用 Bismark41 将经过过滤和接头切除的测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的人类参考基因组 hg19（全基因组比对策略），并确定每个胞嘧啶的甲基化背景。Bismark 是一种定制的短读段比对工具，可将经亚硫酸氢盐处理的读段比对至一个所有“C”被转换为“T”的参考基因组，并返回 CpG、CHG 和 CHH 背景下胞嘧啶的甲基化状态。通常将种子长度（-l）设为读段长度以提高比对准确性，其余参数使用默认值。</li>
	<li>比对完成后，首先按染色体、然后按起始位置、最后按链方向对已比对的读段进行排序。</li>
	<li>使用自定义脚本（详见补充代码文件 2 中的脚本命令），遍历 Bismark 输出的已排序甲基化调用结果，计算每种胞嘧啶甲基化背景（CpG、CHG、CHH）下亚硫酸氢盐转化的胞嘧啶（T；代表未甲基化的 C）和未转化的胞嘧啶（代表甲基化的 C）的甲基化百分比得分，仅保留 Phred 质量得分不低于 20 且覆盖深度至少为 10× 的胞嘧啶。 
	注：输出结果为每种胞嘧啶背景的甲基化得分文件，各列分别为：位置、链、覆盖深度、胞嘧啶百分比和胸腺嘧啶百分比；对于 CHG 和 CHH 背景，另包含一列表示下一个碱基（H）。</li>
	<li>使用自定义脚本（详见补充代码文件 2 中的脚本命令）根据甲基化得分计算转化率，并输出所考虑的其他胞嘧啶（CHG 和 CHH 背景）总数、平均转化率和中位转化率。分别计算两条链的转化率，并对整个文库进行汇总统计。平均转化率定义为非 CpG 背景下的 C 数量（包括转化和未转化）占总 C 数量的比例。CHG 或 CHH 背景下的胞嘧啶通常未甲基化，因此在测序数据中表现为胸腺嘧啶。</li>
	<li>使用 Bismark 提供的 bismark2SAM_v5_xm.pl41 和 SAMTOOLS42 生成比对读段的 BAM 文件，并使用自定义脚本将 CpG 甲基化调用结果转换为 wiggle 格式文件。后处理输出可进一步转换为其他格式（如 bedgraph），并在基因组浏览器（如 UCSC Genome Browser43 或 IGV44）中查看。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案可获得生物相关基因组区域胞嘧啶甲基化的碱基对分辨率数据。当前方案已针对50 ng起始材料进行优化，但亦可调整以适用于不同量的输入材料（5 ng或以上）。26这将需要对方案中的某些步骤进行调整，如所示。 表6ERRBS文库适用于双端测序，通过超过51个循环的读长测序可进一步提高基因组覆盖度。多重测序可降低每个样本的测序成本，但会导致数据中每个CpG位点的覆盖深度降低图5 和 表8），无法提供足够的覆盖深度，以进行需要每个CpG位点高覆盖度的分析（例如 如Landan所述 等33最后，本实验方案（或任何基于亚硫酸氢盐的方案）无法区分甲基化胞嘧啶与羟甲基化胞嘧啶。46,47然而，所生成的数据可与其他实验方案的结果进行整合48,49 以阐明不同的修饰类型，以及最近报道的其他胞嘧啶修饰50，如果这些内容会引起兴趣的话。
高质量的文库如图3A-C所示，合并后进行测序时会产生如图3G（红色轨迹）所示的峰图，表明两个文库组分的摩尔浓度相等。文库构建失败可能发生在实验流程的任何步骤中。若使用降解的DNA进行处理，则所得文库中MspI片段不会富集，从而导致按照本方案所述测序参数获得的CpG覆盖度较低。若某一酶失活或意外遗漏于某一步反应中，将无法获得预期的文库。若连接反应效率低下、接头浓度高于预期和/或引物浓度在最终扩增步骤中成为限制性因素，均可能导致文库构建失败。文库中过量的接头（在生物分析仪结果中表现为约150 bp处的峰；图3D-F）也会干扰测序，因为文库和过量接头会无差别地发生簇生成。尽管此类文库可能表现出看似正常的测序结果，但其中相当一部分测序读段仅为接头序列。若在文库中观察到过量接头，最好在材料允许的情况下，使用最佳输入量与接头比例重新进行文库构建。最后，为确保文库的PCR扩增效率，在整个亚硫酸氢盐转化和PCR富集步骤中，应将较小和较大的文库组分保持为独立的样品。若未如此操作，则在PCR扩增过程中，大小不同的文库组分扩增效率将出现差异（如图3G蓝色轨迹所示），并可能导致测序时各文库组分所覆盖的基因组位点代表性不均。用户可选择在亚硫酸氢盐转化后立即加入定量PCR步骤，以进一步确定扩增所构建文库所需的最优PCR循环数。
ERRBS 文库构建方案包含多个关键步骤，各步骤中建议使用特定的试剂。在末端修复步骤中，使用四种核苷酸的 dNTP 混合物可对不含 CG 突出末端的产物进行末端修复，例如由 MspI 酶的星号活性产生的片段或原始 DNA 样本中存在的机械剪切 DNA 片段，从而提高结果中 CpG 位点的代表性。在连接步骤中，必须使用高浓度连接酶（2,000,000 单位/mL）和甲基化接头，以确保连接反应高效，并防止后续的亚硫酸氢盐转化影响接头序列——这些序列对数据的准确比对至关重要。在 PCR 步骤中，必须使用能够扩增经亚硫酸氢盐处理的富含 GC 的 DNA 片段的聚合酶，以实现高特异性。最后，为彻底去除多余的接头和引物，建议采用 SPRI 磁珠纯化法（例如：Agencourt AMPure XP），而非基于离心柱的纯化方法，用于连接产物和 PCR 产物的分离。
为了获得高质量的数据，确保高效的亚硫酸氢盐转化至关重要。所提供的对照使用户能够在测序前评估转化效率。作为替代方案，可使用非人类来源的DNA（如λ DNA）作为内参对照（spike-in）。由于物种差异，此类对照可直接用于后续测序分析例如 如 Yu 所用 等34然而，如果使用了外源添加的对照序列（spike-in），则除非在文库测序之前对其进行特异性扩增并独立测序，否则无法用于测定文库测序前的转化效率。所测定的转化率基于非CpG位点的甲基化状态，因此在非CpG背景下胞嘧啶甲基化水平较高的情况下（例如胚胎干细胞），该方法可能不适用；此时可采用平行样本或其他方法来评估转化效率。
ERRBS文库测序存在一些独特的注意事项。由于MspI识别切割位点（C^CGG；见图4B、C），所测序的文库片段前三个碱基几乎完全非随机，这可能导致测序过程中尽管表观簇密度较高，但因簇定位不佳而导致低质量读段，进而造成显著的数据丢失。为克服这一障碍，建议在独立通道中加入高复杂度文库作为专用对照（如PhiX对照或其他类型文库）。高复杂度文库在测序前四个碱基中具有均衡的A、C、T和G分布。合适的对照通道可包括RNA-seq、ChIP-seq、全基因组测序文库，或测序仪制造商提供的对照（例如 PhiX Control v3）。当指定为相应测序运行的对照通道时，该对照可用于生成测序前四个碱基的矩阵，以实现簇位置的准确识别。由此获得的高质量读段可使每个CpG位点的平均覆盖度提高5.2倍（n = 4）。此外，也可采用此前描述的“暗测序”（dark sequencing）方法来克服这一技术难题23。其他测序参数应遵循制造商标准操作程序。最后，数据分析中选择的每个CpG位点的覆盖度将由用户根据具体研究需求决定。10x覆盖度阈值可支持高覆盖度分析策略，但若研究需要，该阈值也可适当降低。
对ERRBS数据分析的全面讨论超出了本文的范围，但可以使用开源工具来确定差异甲基化的胞嘧啶和区域31,51-53。其他分析注意事项和方法已有详尽描述54,55，建议读者查阅相关文献，选择最适合计划中分析工作的工具。
与其他已发表的方法相比，ERRBS 提供了一个为期四天的实验流程，按照所述方法操作可获得高重复性。该方法已通过与金标准 MassARRAY EpiTYPER26 的对比验证，具有成本效益，适用于高覆盖度测序数据，并可根据不同起始材料量（有利于临床样本处理及低丰度细胞类型）和测序策略进行灵活调整。ERRBS 能在生物学相关位点提供单碱基分辨率，可用于与其他全基因组技术（如转录因子结合、染色质重塑、表观遗传标记及其他感兴趣的胞嘧啶修饰谱型分析）联合的整合分析。在这些研究中使用 ERRBS 数据有助于构建全面的分子研究策略，支持对生物模型和人类疾病的高维度分析。

胞嘧啶上的DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶）是一种在哺乳动物细胞中至关重要的表观遗传标记，参与多种生物学过程，包括但不限于基因组印记、X染色体失活、发育以及基因表达调控1-8。对恶性肿瘤及其他疾病中DNA甲基化模式的研究已确定了与特定疾病相关的甲基化特征，增进了对疾病发病机制的理解，并推动了潜在生物标志物的发现9-17。&#160;目前已有多种用于检测表观基因组中DNA甲基化状态的实验方案。这些方法可分为基于亲和富集、基于限制性内切酶以及基于亚硫酸氢盐转化的检测技术，后续通常结合微阵列或测序平台进行分析。此外，还有一些方法跨越了上述分类，包括但不限于联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析法18和简化基因组亚硫酸氢盐测序（RRBS19）。
RRBS 最初由 Meissner 等人19,20 描述。该方案引入了一个富集基因组中 GC 富集区域的步骤，随后进行亚硫酸氢盐测序，从而获得具有单碱基分辨率且成本效益较高的定量数据21,22。GC 富集区域通过 MspI（C^CGG）限制性内切酶进行靶向，胞嘧啶甲基化状态则通过亚硫酸氢盐转化（未修饰的胞嘧啶脱氨为尿嘧啶）后经聚合酶链式反应（PCR）扩增来解析。RRBS 能够覆盖大部分基因启动子和 CpG 岛，仅需全基因组测序一小部分的测序量；然而，其对 CpG 海岸区及其他具有生物学意义的基因间区域的覆盖有限。自最初报道以来，多个研究团队已发表更新的 RRBS 方案，改进了方法学并提升了对这些基因组区域的覆盖度23-25。增强型简化基因组亚硫酸氢盐测序（Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing, ERRBS）相较于 RRBS，在文库构建步骤和数据分析比对策略方面进行了优化26。ERRBS 能在生成的数据中呈现更多的 CpG 位点，并显著提高所有被检测基因组区域的覆盖度26。该方法已被用于解析人类患者及其他动物样本中的 DNA 甲基化模式26-30。
本文所述的ERRBS方案详细介绍了完成实验所需的全部步骤，所用数据通过代表性的人类DNA生成（样本来源于先前报道的、去标识化的患者样本31，以及一名正常人类供体的CD34+骨髓样本）。该方案包含自动化的片段大小筛选步骤，可缩短每个样本的处理时间，并提高文库片段大小选择的准确性。本方案结合了一系列成熟的分子生物学技术：首先使用对甲基化不敏感的限制性内切酶（MspI）消化高分子量DNA，随后进行末端修复、A尾添加以及甲基化接头的连接；接着对富含GC的片段进行大小筛选，再经亚硫酸氢盐转化和PCR扩增后用于测序。亚硫酸氢盐转化方法此前已有描述32，而数据分析与应用的详细综述不在本文范围内，但为读者提供了相关建议和参考文献。该方案可在四天内完成，适用于微量起始材料（50 ng或更少）。按本方案操作可获得每个CpG位点的高覆盖度数据，不仅足以进行差异甲基化位点和区域的鉴定，还可用于检测表观遗传多态性，如Landan et al.33 所述。

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>MspI 酶的反应缓冲液；方案步骤 1.2</td></tr><tr><td>苯酚溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>用 10&amp;nbsp;mM Tris HCl（pH&amp;nbsp;8.0）平衡；参见 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 上的安全与操作说明</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>参见 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 上的安全与操作说明</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19–22 毫克/毫升</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M，pH 5.2</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 证明，用于分子生物学</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl，pH 8.5</td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>配制 1 M、pH 8.5 的溶液</td></tr><tr><td>Tris-乙二胺四乙酸（TE）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>按制造商推荐稀释为 1× 缓冲液</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10× 浓度</td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>每种核苷酸 10 mM</td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶 I 大片段（Klenow 片段）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于方案步骤 2.3 中的 DNA 产物纯化</td></tr><tr><td>2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸（dATP）</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow 片段（3&#039;&amp;rarr;5' 外切酶缺陷型）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>用于方案步骤 3.3 中的 DNA 产物纯化</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 单位/毫升</td></tr><tr><td>甲基化接头寡核苷酸试剂盒</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于实施磁珠纯化步骤的方案部分（步骤 4.3 和 8.2）。使用前平衡至室温。</td></tr><tr><td>Pippin Prep 凝胶盒，2% 琼脂糖，无染料</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>含内部标准品</td></tr><tr><td>认证低分子量超纯琼脂糖</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 毫克/毫升</td></tr><tr><td>50 bp DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>凝胶上样染料，橙色（6×）</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>手术刀&amp;nbsp;刀片&amp;nbsp;编号&amp;nbsp;11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 甲基化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>用于方案步骤 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA 甲基化-快速试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>步骤 6.2 的替代方案</td></tr><tr><td>通用甲基化人 DNA 标准品</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>用作亚硫酸氢盐转化对照</td></tr><tr><td>FastStart 高保真 PCR 系统</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>基于荧光的 DNA 定量检测；用于方案步骤 1.1、9.1 和 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 检测试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA 样品制备</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>用于文库多重分析的条形码接头；多重分析方案见补充文件。</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干式恒温金属浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外或蓝光透射仪</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的dna甲基化分析

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA甲基化模式图谱在正常组织和病变组织中均受到广泛研究。目前已建立多种方法用于检测细胞中的胞嘧啶甲基化模式。简化基因组重亚硫酸盐测序（Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing）旨在检测富含GC的基因组位点上具有单碱基分辨率的定量胞嘧啶甲基化模式。该方法通过结合限制性内切酶消化与重亚硫酸盐转化来实现。增强型简化基因组重亚硫酸盐测序（Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing, ERRBS）可提高生物学相关基因组位点的覆盖范围，已被用于分析人、小鼠及其他生物DNA中的胞嘧啶甲基化谱。ERRBS首先对DNA进行限制性内切酶消化，以产生低分子量的片段用于文库构建。这些片段随后进行标准的下一代测序文库制备流程。在最终扩增步骤前，对未甲基化的胞嘧啶进行重亚硫酸盐转化，从而实现对覆盖区域内胞嘧啶甲基化水平的单碱基定量解析。该实验方案可在四天内完成。尽管测序前三个碱基复杂度较低，ERRBS文库在使用指定测序对照通道时仍可获得高质量数据。随后进行序列比对与生物信息学分析，所得数据可轻松整合至多种全基因组分析平台。ERRBS仅需少量起始材料，因此适用于处理人类临床样本，并广泛适用于各类科研应用。本视频展示了ERRBS实验方案中的关键步骤。

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序是一种基于限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析测序文库制备方法。该方案需要50 ng起始材料，可获得在基因组GC富集区域的碱基对分辨率数据。

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

DNA甲基化模式在正常及病变组织中受到广泛研究。已有多种方法用于检测胞嘧啶……

本实验的总体目标是通过限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的方法，构建可用于单碱基分辨率DNA-CpG甲基化分析的测序文库。该流程首先对高质量DNA进行MSP1限制性内切酶消化，随后进行末端修复、加尾以及连接甲基化接头。下一步是在片段大小选择后，对DNA片段进行亚硫酸氢盐转化。通过PCR扩增片段。最后一步是进行质量控制和测序，随后进行数据可视化和分析。最终，增强型简化代表重亚硫酸盐测序可在富含CG的基因组位点上检测到定量的碱基对分辨率的胞嘧啶甲基化模式。与微阵列等其他DNA甲基化方法相比，该技术的主要优势在于，它能够利用少量的起始材料，在单碱基分辨率及具有生物学意义的位点上，生成高覆盖度的DNA-CpG甲基化数据。我们最初萌生这一方法的想法，是源于希望探索传统检测方法所覆盖区域之外的表观遗传学模式。我们致力于开发该技术，以实现从微阵列向单碱基分辨率DNA甲基化数据生成的转变，并使这些数据能够与其他新一代技术所产生的数据进行整合。该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题。例如，与正常对照或其他疾病状态相比，生物样本中的表观遗传模式及异质性。通常，初次接触该方法的研究人员会发现其实验流程较长、具体要求繁多，且所构建文库具有独特的测序特征，因而具有一定挑战性。我们实验室的一名研究专员将协助演示本实验方案的起始步骤。首先，准备好已进行MSP一种限制性内切酶消化、平末端修复反应以及在3'端添加单个核苷酸的基因组DNA样本的纯化分装样品。此时，DNA产物已准备好进行接头连接。将10微升A-A-L-D-N-A样本转移至一个0.2毫升的PCR管中，并将该管置于冰上。此外，将适量的接头分子置于冰上。接着，在冰上配制连接反应试剂混合液。将连接试剂和接头分子同时加入DNA样品中，并用移液器上下吹打数次以混匀。将PCR管放入热循环仪中，于次日在16摄氏度条件下过夜进行连接反应。使用磁珠或基于硅胶柱的固相DNA提取试剂盒纯化连接产物。在纯化过程的最后一步。通过加入30微升无DNA的水来洗脱DNA。纯化的DNA产物可保存在负20摄氏度，直至需要使用，适用于起始总DNA量为25纳克或更高的样品。使用自动凝胶回收装置（如PI和prep）筛选长度在150个碱基对至400个碱基对之间的连接产物。务必从琼脂糖凝胶胶条中排除DNA可视化染料，例如溴化乙锭或Cyber Green，因为它们可能改变与分叉接头结合的DNA片段的迁移特性。也可采用标准的基于琼脂糖凝胶的片段大小选择方案来完成本步骤，以在Pippin系统上设置不含染料的2%琼脂糖胶条进行DNA电泳。在Pippin Prep控制台中创建新方案，并选择2%DF Marker L作为所用胶条类型。然后启用使用内标选项，并确认参考泳道编号与用于分离150至400个碱基对DNA片段的泳道编号一致。选择“范围”作为收集模式，并输入以下限制参数：碱基对起始为135，碱基对结束为410，碱基对paws为240。此操作指示仪器将电泳场对准电洗脱输出端口。当该范围内的 DNA 片段迁移至出口附近时。保存程序文件后，根据 Pippen Prep 仪器设置的标准操作流程，准备胶条盒和仪器的样品上样孔。通过向 30 微升特定连接后样品中加入 10 微升 DNA 标记物，制备用于电泳的 DNA 样品，并将混合物上样至胶条盒中。首先，从每个样品中移除 40 微升电泳缓冲液。然后通过移液将各 40 微升的样品标记物混合液加入各自的加样孔中。返回控制台，加载已保存的程序并按下开始按钮以启动电泳。当程序运行至240个碱基对时，手动暂停步骤，使用移液器从每个输出端口收集40微升的流出液。将这些组分标记为低分子量文库组分。收集完低分子量文库组分后，立即向出口端口加入40微升新鲜电泳缓冲液进行清洗。用缓冲液上下吹打至少三次，然后吸出废液。重复此洗涤步骤两次，以彻底清除出口处所有短片段DNA。现在向样品中加入40 µL电泳缓冲液。密封洗脱端口并按下运行按钮，以继续洗脱过程。当Ellucian程序在410碱基对设置下完成后，从所有出口端口收集40微升Inuit，并将这些组分标记为上层文库组分。此时，两个文库组分均已通过凝胶纯化，可直接用于亚硫酸氢盐转化。使用市售试剂盒对两个文库组分进行亚硫酸氢盐转化实验。在转化过程的最后一步，用40微升无DNA水洗脱DNA样本。亚硫酸氢盐转化后，所得的DNA文库片段将通过引物进行富集PCR扩增，这些引物可与每个DNA分子接头末端杂交。首先，为进行富集PCR，向给定的经亚硫酸盐转化的样本的每40微升等分试样中加入160微升PCR预混液。然后将得到的200微升混合液分至四个独立的PCR管中，每管50微升。将试管放入热循环仪中，扩增已转化的DNA模板。富集完成后，将四组PCR产物合并至一个1.5毫升离心管中，并使用商业化的PCR纯化试剂盒对DNA进行纯化。若采用磁珠固相萃取试剂盒纯化PCR产物，需对标准操作流程进行修改：首先将合并后的下层文库PCR产物与总体积1.7倍的磁珠充分混合。然后将合并的上层文库PCR产物与相当于其总体积1.1倍的磁珠混合。随后按照试剂盒说明书操作，直至70%乙醇洗涤步骤；在纯化过程的最后一步，每次洗涤所用体积应改为800微升。用50微升无DNA的洗脱缓冲液洗脱DNA。将纯化后的文库在负20摄氏度保存，直至使用。采用基于荧光且对双链DNA具有选择性的定量方法，测定每个文库组分在富集后的DNA含量。此外，使用生物分析仪评估富集后文库的片段大小和质量。通过以碱基对表示的平均DNA长度，计算特定文库组分的有效DNA摩尔浓度。确定摩尔浓度后，使用DNA的无水溶剂将每种对应的上层和下层文库组分稀释至终浓度为2纳摩尔。将下层和上层文库配对混合于同一管中，制备成每份20微升、浓度为2纳摩尔的完整文库混合物。混合后的样品现可进行测序运行。在包括 E-R-R-B-S 在内的测序相关实验中，上下层文库分子的质量和片段大小分布是决定最终测序数据质量的关键因素。与传统的手工凝胶提取方法相比，E-R-R-B-S 实验流程中使用的自动化凝胶提取装置能够获得更一致的片段大小分布，并最大限度地降低样本间交叉污染的风险。接下来，在将经 BIS 亚硫酸氢盐转化的文库分子送入测序后，所有 DNA 链的原始数据显示，对于任意一条给定的链，每个核苷酸位点的数据质量在前三个核苷酸之后会显著提高。由于该三核苷酸序列在绝大多数文库分子中以CGG为共识序列，数据表明E-R-R-B-S方案已产生了一组理想的基因组片段文库，这些片段主要被侧翼序列包围。从宏观角度来看，MSP仅能获得一个限制性酶切末端的信息。E-R-R-B-S方案能够提供全基因组范围内胞嘧啶甲基化位点的碱基对分辨率数据。例如，此处显示的是12号染色体。该实验方案涵盖了基因组范围内CpG位点的简化表示。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备E-R-R-B-S文库，以获得单碱基分辨率的DNA-CpG甲基化数据。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在四天内完成。进行此操作时，务必牢记应从高质量的DNA开始，包含所述的所有步骤，使用推荐的参数验证亚硫酸氢盐转化效率并进行测序。切记苯酚和氯仿的使用可能具有极高危险性。操作过程中应始终采取常规预防措施，例如在通风橱中操作并妥善处理废弃物。按照本实验方案，还可采用焦磷酸测序或质谱阵列表观分型等其他方法验证研究结果。此外，可进行基因表达谱分析，以确定所检测到的DNA甲基化模式的生物学意义。从有限的起始材料中生成单碱基分辨率的DNA甲基化图谱的能力，使得对以往无法实现的稀有细胞群体进行分析成为可能。同时也使得对大量临床样本队列进行表观遗传调控及疾病异质性的研究成为可行。

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科研

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生物学

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