增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

本实验的总体目标是通过限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的方法，构建可用于单碱基分辨率DNA-CpG甲基化分析的测序文库。该流程首先对高质量DNA进行MSP1限制性内切酶消化，随后进行末端修复、加尾以及连接甲基化接头。下一步是在片段大小选择后，对DNA片段进行亚硫酸氢盐转化。

通过PCR扩增片段。最后一步是进行质量控制和测序，随后进行数据可视化和分析。最终，增强型简化代表重亚硫酸盐测序可在富含CG的基因组位点上检测到定量的碱基对分辨率的胞嘧啶甲基化模式。

与微阵列等其他DNA甲基化方法相比，该技术的主要优势在于，它能够利用少量的起始材料，在单碱基分辨率及具有生物学意义的位点上，生成高覆盖度的DNA-CpG甲基化数据。我们最初萌生这一方法的想法，是源于希望探索传统检测方法所覆盖区域之外的表观遗传学模式。我们致力于开发该技术，以实现从微阵列向单碱基分辨率DNA甲基化数据生成的转变，并使这些数据能够与其他新一代技术所产生的数据进行整合。

该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题。例如，与正常对照或其他疾病状态相比，生物样本中的表观遗传模式及异质性。通常，初次接触该方法的研究人员会发现其实验流程较长、具体要求繁多，且所构建文库具有独特的测序特征，因而具有一定挑战性。

我们实验室的一名研究专员将协助演示本实验方案的起始步骤。首先，准备好已进行MSP一种限制性内切酶消化、平末端修复反应以及在3'端添加单个核苷酸的基因组DNA样本的纯化分装样品。此时，DNA产物已准备好进行接头连接。将10微升A-A-L-D-N-A样本转移至一个0.2毫升的PCR管中，并将该管置于冰上。

此外，将适量的接头分子置于冰上。接着，在冰上配制连接反应试剂混合液。将连接试剂和接头分子同时加入DNA样品中，并用移液器上下吹打数次以混匀。

将PCR管放入热循环仪中，于次日在16摄氏度条件下过夜进行连接反应。使用磁珠或基于硅胶柱的固相DNA提取试剂盒纯化连接产物。在纯化过程的最后一步。

通过加入30微升无DNA的水来洗脱DNA。纯化的DNA产物可保存在负20摄氏度，直至需要使用，适用于起始总DNA量为25纳克或更高的样品。使用自动凝胶回收装置（如PI和prep）筛选长度在150个碱基对至400个碱基对之间的连接产物。

务必从琼脂糖凝胶胶条中排除DNA可视化染料，例如溴化乙锭或Cyber Green，因为它们可能改变与分叉接头结合的DNA片段的迁移特性。也可采用标准的基于琼脂糖凝胶的片段大小选择方案来完成本步骤，以在Pippin系统上设置不含染料的2%琼脂糖胶条进行DNA电泳。在Pippin Prep控制台中创建新方案，并选择2%DF Marker L作为所用胶条类型。

然后启用使用内标选项，并确认参考泳道编号与用于分离150至400个碱基对DNA片段的泳道编号一致。选择“范围”作为收集模式，并输入以下限制参数：碱基对起始为135，碱基对结束为410，碱基对paws为240。此操作指示仪器将电泳场对准电洗脱输出端口。

当该范围内的 DNA 片段迁移至出口附近时。保存程序文件后，根据 Pippen Prep 仪器设置的标准操作流程，准备胶条盒和仪器的样品上样孔。通过向 30 微升特定连接后样品中加入 10 微升 DNA 标记物，制备用于电泳的 DNA 样品，并将混合物上样至胶条盒中。

首先，从每个样品中移除 40 微升电泳缓冲液。然后通过移液将各 40 微升的样品标记物混合液加入各自的加样孔中。返回控制台，加载已保存的程序并按下开始按钮以启动电泳。

当程序运行至240个碱基对时，手动暂停步骤，使用移液器从每个输出端口收集40微升的流出液。将这些组分标记为低分子量文库组分。收集完低分子量文库组分后，立即向出口端口加入40微升新鲜电泳缓冲液进行清洗。

用缓冲液上下吹打至少三次，然后吸出废液。重复此洗涤步骤两次，以彻底清除出口处所有短片段DNA。现在向样品中加入40 µL电泳缓冲液。

密封洗脱端口并按下运行按钮，以继续洗脱过程。当Ellucian程序在410碱基对设置下完成后，从所有出口端口收集40微升Inuit，并将这些组分标记为上层文库组分。此时，两个文库组分均已通过凝胶纯化，可直接用于亚硫酸氢盐转化。

使用市售试剂盒对两个文库组分进行亚硫酸氢盐转化实验。在转化过程的最后一步，用40微升无DNA水洗脱DNA样本。亚硫酸氢盐转化后，所得的DNA文库片段将通过引物进行富集PCR扩增，这些引物可与每个DNA分子接头末端杂交。

首先，为进行富集PCR，向给定的经亚硫酸盐转化的样本的每40微升等分试样中加入160微升PCR预混液。然后将得到的200微升混合液分至四个独立的PCR管中，每管50微升。

将试管放入热循环仪中，扩增已转化的DNA模板。富集完成后，将四组PCR产物合并至一个1.5毫升离心管中，并使用商业化的PCR纯化试剂盒对DNA进行纯化。若采用磁珠固相萃取试剂盒纯化PCR产物，需对标准操作流程进行修改：首先将合并后的下层文库PCR产物与总体积1.7倍的磁珠充分混合。

然后将合并的上层文库PCR产物与相当于其总体积1.1倍的磁珠混合。随后按照试剂盒说明书操作，直至70%乙醇洗涤步骤；在纯化过程的最后一步，每次洗涤所用体积应改为800微升。用50微升无DNA的洗脱缓冲液洗脱DNA。

将纯化后的文库在负20摄氏度保存，直至使用。采用基于荧光且对双链DNA具有选择性的定量方法，测定每个文库组分在富集后的DNA含量。此外，使用生物分析仪评估富集后文库的片段大小和质量。通过以碱基对表示的平均DNA长度，计算特定文库组分的有效DNA摩尔浓度。

确定摩尔浓度后，使用DNA的无水溶剂将每种对应的上层和下层文库组分稀释至终浓度为2纳摩尔。将下层和上层文库配对混合于同一管中，制备成每份20微升、浓度为2纳摩尔的完整文库混合物。混合后的样品现可进行测序运行。

在包括 E-R-R-B-S 在内的测序相关实验中，上下层文库分子的质量和片段大小分布是决定最终测序数据质量的关键因素。与传统的手工凝胶提取方法相比，E-R-R-B-S 实验流程中使用的自动化凝胶提取装置能够获得更一致的片段大小分布，并最大限度地降低样本间交叉污染的风险。接下来，在将经 BIS 亚硫酸氢盐转化的文库分子送入测序后，所有 DNA 链的原始数据显示，对于任意一条给定的链，每个核苷酸位点的数据质量在前三个核苷酸之后会显著提高。

由于该三核苷酸序列在绝大多数文库分子中以CGG为共识序列，数据表明E-R-R-B-S方案已产生了一组理想的基因组片段文库，这些片段主要被侧翼序列包围。从宏观角度来看，MSP仅能获得一个限制性酶切末端的信息。E-R-R-B-S方案能够提供全基因组范围内胞嘧啶甲基化位点的碱基对分辨率数据。

例如，此处显示的是12号染色体。该实验方案涵盖了基因组范围内CpG位点的简化表示。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备E-R-R-B-S文库，以获得单碱基分辨率的DNA-CpG甲基化数据。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在四天内完成。

进行此操作时，务必牢记应从高质量的DNA开始，包含所述的所有步骤，使用推荐的参数验证亚硫酸氢盐转化效率并进行测序。切记苯酚和氯仿的使用可能具有极高危险性。操作过程中应始终采取常规预防措施，例如在通风橱中操作并妥善处理废弃物。

按照本实验方案，还可采用焦磷酸测序或质谱阵列表观分型等其他方法验证研究结果。此外，可进行基因表达谱分析，以确定所检测到的DNA甲基化模式的生物学意义。

从有限的起始材料中生成单碱基分辨率的DNA甲基化图谱的能力，使得对以往无法实现的稀有细胞群体进行分析成为可能。同时也使得对大量临床样本队列进行表观遗传调控及疾病异质性的研究成为可行。