增强的减少表示亚硫酸氢盐测序的DNA甲基化的评估，在碱基对决议

该程序的总体目标是生成用于碱基对分辨率 D-N-A-C-P-G 的测序文库，基于限制性内切酶消化与亚硫酸盐转化胞嘧啶结合的甲基化分析。这是通过首先对高质量 DNA 进行 MSP one 限制性内切酶消化，然后进行末端修复、甲基化接头的加尾和连接来实现的。下一步是在亚硫酸盐转化后对大小选定的片段进行亚硫酸盐转化。

使用 PCR 扩增片段。最后一步是进行质量控制和测序，然后进行数据可视化和分析。最终，亚硫酸氢盐测序的增强减少表示可检测富含 CG 的基因组位点上胞苷甲基化模式的定量碱基对分辨率。

与其他 DNA 甲基化方法（如微阵列）相比，该技术的主要优点是它可以利用少量起始材料在碱基对分辨率和生物学相关位点生成高覆盖率的 D-N-A-C-P-G 甲基化数据。当我们对探索传统分析所涵盖区域以外的表观遗传模式感兴趣时，我们第一次有了这种方法的想法。我们对开发这项技术感兴趣，以从微阵列过渡到生成碱基对分辨率 DNA 甲基化数据，这些数据可以与其他下一代技术生成的数据集成。

这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题。例如，与正常对照或其他疾病状态相比，生物样品中的表观遗传模式和异质性。一般来说，由于手术的长度、众多的特定要求以及生成的文库的独特测序特性，刚接触这种方法的人会发现它具有挑战性 Mamie fall.

我们实验室的研究专家将协助演示开始此协议的程序。首先，制备纯化的基因组 DNA 样品等分试样，这些样品经过 MSP one 限制性内切酶消化、平末端修复反应和三个引物末端的单个核苷酸添加。此时，DNA 产物将准备好进行接头连接，开始将 10 μL A-A-L-D-N-A 样品转移到 0.2 mL PCR 管中，并将管放在冰上。

此外，将接头分子的等分试样置于冰上。接下来，在冰上制备连接试剂混合物。将连接试剂和接头分子添加到 DNA 样品中，并上下移液几次以混合。

将 PCR 管放入热循环仪中，第二天在 16 摄氏度下进行连接反应过夜。使用基于磁珠或硅胶柱的固相 DNA 提取试剂盒纯化连接产物。在纯化过程的最后一步。

通过添加 30 μL DNA 游离水洗脱 DNA。纯化的 DNA 产物可以在零下 20 摄氏度下储存，直到样品需要为止，样品的总 DNA 从 25 ng 或更高开始。使用自动凝胶提取装置（如 PI 和 prep）选择长度在 150 个碱基对和 400 个碱基对之间的连接产物。

请务必从 agros 盒中排除 DNA 可视化染料，例如以太坊溴化物或赛博绿，因为它们会改变分叉接头结合片段的 DNA 迁移特性。基于 agros 凝胶的标准尺寸选择方案也可用于方案的这一步，以在 pippin 2% 无染料的 aros 盒上设置 DNA 电泳。在 Pippin Prep 控制台中创建新方案，并选择 2%DF 标记物 L 选项作为首选包包。

然后启用 use internal standards（使用内标）选项，并验证参比泳道编号是否与用于分离 150 个碱基对和 400 个碱基对的 DNA 片段的泳道编号匹配。选择范围选项作为收集模式，然后输入以下限制参数：135 表示碱对开始，410 表示碱对末端，240 表示碱对爪。这指示设备将电泳场对准电洗脱输出端口。

当该范围内的 DNA 片段在出口附近移动时。保存方案文件后，在仪器设置时，按照 Pippen Prep 的标准作程序制备凝胶盒和仪器的样品加载孔。通过将 10 μL DNA 标记物添加到给定连接后样品的 30 μL 等分试样中，将混合物加载到凝胶盒上，制备用于电泳的 DNA 样品。

首先，从每个样品中取出 40 μL 电泳缓冲液。然后通过将每 40 微升样品标记物混合物移液到单个孔中来更换体积。返回控制台，加载保存的方案，然后按 start（开始）开始电泳。

当程序达到 240 个碱基对时，暂停步骤用移液器从每个输出端口手动收集 40 微升 OUIT。将这些级分标记为较低的文库级分。收集下部文库组分后，立即加入 40 μL 新鲜电泳缓冲液清洗出口端口。

上下移液缓冲液至少 3 次，然后吸出 snet。再重复洗涤两次，以去除出口处的所有短长度 DNA 种类的痕迹。现在向样品中加入 40 μL 电泳缓冲液。

密封 elucian 端口并按下运行按钮以恢复 elucian 过程。在 410 碱基对设置下完成 Ellucian 程序后，从所有出口端口收集 40 微升因纽特人，并将这些馏分标记为上部文库馏分。此时，两个文库组分都经过凝胶纯化，并且已经用于亚硫酸氢盐转化。

使用市售试剂盒，对两种文库组分进行亚硫酸氢盐转化测定。在转化过程的最后一步，用 40 μL 游离 DNA 的水洗脱 DNA 样品。亚硫酸氢盐转化后，所得 DNA 文库片段将使用在每个 DNA 分子的接头末端杂交的引物进行富集 PCR 扩增。

为了首先制备富集 PCR，将 160 μL PCR 预混液添加到每 40 μL 等分试样中，由硫化物转化的样品中。然后将所得 200 μL 混合物分成四个 50 μL 的等分试样。在单独的 PCR 管中。

将试管放入热循环仪中并扩增转化的 DNA 模板。富集后，将 4 个 PCR 后产物拉入单个 1.5 mL 试管中，并使用市售 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA。如果使用磁珠固相萃取试剂盒纯化 PCR 产物，请修改标准作程序，首先将组合的下文库 PCR 产物与其珠子总体积的 1.7 倍混合。

然后将组合的上文库 PCR 产物与磁珠中总体积的 1.1 倍混合。然后按照制造商的方案进行，直到 70% 乙醇洗涤步骤，在纯化过程的最后一步，每个洗涤体积应更改为 800 微升。用 50 μL 游离 DNA 洗脱缓冲液洗脱 DNA。

将纯化的文库储存在负 20 摄氏度下，直到需要为止，使用对双链 DNA 具有选择性的基于荧光的测定法定量每个文库组分的富集后 DNA 含量。此外，使用生物分析仪评估富集后文库的大小和质量。使用以碱基对表示的平均 DNA 长度来计算特定文库组分的有效 DNA 摩尔浓度。

一旦知道摩尔浓度，使用 DNA 的游离水将每个相应的上下文库部分稀释至 2 纳摩尔的最终浓度。将下部和上部文库对合并成一个试管，以产生每个 20 微升的两纳摩尔空穴文库混合物。混合样品现在已准备好进行测序运行。

在测序相关分析中，包括 E-R-R-B-S，文库上部和下部文库分子的质量和大小分布是决定最终测序数据质量的关键因素。与传统的手动凝胶萃取方案相比，E-R-R-B-S 方案中使用的自动凝胶萃取仪将产生一致的尺寸分布，并最大限度地减少交叉样品污染的可能性。接下来，在发送 BIS 亚硫酸盐转化的文库分子进行测序时，来自所有 DNA 链的原始数据表明，对于任何给定的链，每个核苷酸位置的数据质量在前三个核苷酸之后都会显着提高。

由于绝大多数文库分子的这三个核苷酸的共有序列是用 CGG 设置的，因此数据表明 E-R-R-B-S 方案已经产生了一个文库集合，其中包含一组主要侧翼的理想基因组片段。使用 MSP，一个限制性摘要从鸟瞰角度结束。E-R-R-B-S 方案可以产生整个基因组中胞苷甲基化位点的碱基对分辨率数据。

例如，此处显示了 12 号染色体。该方案涵盖了全基因组 CPG 的减少表示。看完这个视频，你应该对如何准备 E-R-R-B-S 文库有一个很好的了解，以生成碱基分辨率 D-N-A-C-P-G 甲基化数据一旦掌握了，如果执行得当，这项技术可以在四天内完成。

在尝试此过程时，请务必记住从高质量的 DNA 开始，包括描述的所有步骤，使用推荐参数验证硫酸氢盐转化和测序的效率。不要忘记，使用苯基和氯仿可能非常危险。执行此程序时，应始终采取常见的预防措施，例如在化学罩中工作和妥善处理废物。

遵循此过程。可以执行其他方法，例如 spyro 测序或质谱表型来验证结果。此外，可以进行基因表达谱分析以确定检测到的 DNA 甲基化模式的生物学意义。

从有限数量的起始材料中生成碱基对分辨率 DNA、甲基化模式的能力使稀有细胞群的分析成为可能，这是前所未有的。它还使大型临床样本队列的分析成为可能，以探索表观遗传介导的调节和疾病的异质性。