直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

本实验的总体目标是将血细胞直接诱导为神经干细胞。该过程首先从血液中富集 CD34 阳性的造血祖细胞，第二步是利用携带转录因子的仙台病毒转染 CD34 细胞。

接下来，使用选择性培养基分离神经干细胞。最后一步是将诱导的神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。最终，通过免疫荧光显微镜对所获得的细胞进行表征。

与现有方法（如直接由成纤维细胞诱导产生神经元，或诱导多能干细胞（iPS）生成）相比，该技术的主要优势在于，它避开了繁琐的iPS细胞生成与扩增过程，但仍能获得大量可进一步分化为神经元的神经样细胞。我最初产生这一方法的想法，是由于注意到贴壁转染后的CD34细胞在形态上与原代培养的神经前体细胞极为相似，这提示该操作具有可行性。本实验由我实验室的技术员Marines首先实施。在根据文本方案中的说明从外周血单个核细胞中分离出CD34细胞后，开始进行CD34细胞的培养：用CD34培养基重悬CD34细胞，随后将细胞以每毫升培养基含3×10⁵个细胞的密度接种至24孔板中，每孔接种1毫升细胞悬液。

在含5%二氧化碳的37摄氏度组织培养孵箱中孵育24小时后，收集悬浮细胞，将细胞悬液在室温下以110 × g离心。然后弃去上清液，将细胞重悬于新鲜的CD34维持培养基中。以每孔1毫升培养基接种新的24孔板，每孔接种1 × 10⁵个细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳孵箱中继续孵育5天，每隔一天更换一半培养基。

在第5天，当CD34细胞沉降至孔板底部时，小心吸取上清液的上半部分。接种后，收集CD34细胞，在室温下以170 × g离心10分钟，弃去上清液，按前述方法重悬细胞，并以每毫升培养基含1 × 10⁵个细胞的密度接种至新的24孔板中，每孔1毫升。接下来，解冻一份CytoTune iPS Sendai重编程试剂盒。

首先将试管底部浸入37摄氏度水浴中10秒，然后在室温下完全解冻。短暂离心试管后置于冰上。根据分析证书上对应批次所列每种病毒的推荐体积，混合制备仙台病毒混合液。

建议感染复数为15。将仙台病毒混合物加入至每孔CD34细胞中，然后轻轻摇动培养板以混匀各孔。

24小时后，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育细胞。观察转导效率。注意，细胞聚集体和类球体（如本图所示）是转导成功的指标。

然后将细胞置于组织培养孵育箱中孵育5至7天，每隔一天观察一次，直至贴壁细胞出现并达到30%至50%融合度，如图所示。通过小心地将培养基上层转移至另一孔，更换一半培养基。若细胞球体被转移至新孔中，则加入等量的新鲜培养基。

使用倒置显微镜检查细胞的融合度。当细胞融合度达到30%至50%时，吸除上清液并保留，然后向每孔加入1毫升神经前体细胞培养基，利用上清液中的类球体作为备份培养板。将保留的上清液在170 × g条件下离心10分钟。随后吸除上清液，并将沉淀物重悬于神经前体细胞培养基中，接种至基质胶包被的24孔板中。

与之前相同，每隔一天更换每孔细胞的培养基，直至细胞融合度达到60%至80%，通常需要一周时间。当细胞达到所需融合度后，吸除上清液，每孔加入一毫升神经干细胞培养基。

然后使用细胞刮刀解离细胞，接着进行非常轻柔的移液操作。接下来，将24孔板中一个孔的细胞转移至6孔板的一个孔中。

向孔中再加入1毫升培养基，对所有孔重复上述操作后，将六孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。每隔一天更换一次完全培养基，直至细胞达到60%汇合度，随后以1:3的比例消化并重新接种细胞，如前所示冻存一部分未分化的神经干细胞。首先，通过向神经干细胞培养基中加入20%二甲基亚砜（DMSO）制备干细胞冻存液，并置于冰上。

然后用细胞刮刀和轻柔的吹打方法，将六孔板中的细胞进行解离。保留一部分细胞悬液用于细胞计数，其余细胞在室温下以170 × g离心10分钟。在细胞离心的同时，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对保留的悬液样本进行细胞计数，并计算所需培养基的体积，以获得每毫升含1 × 10⁶个细胞的细胞浓度。

离心结束后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于神经干细胞培养基中，密度为每毫升1×10⁶个细胞。然后加入等体积的冻存液，将5×10⁵个细胞以1毫升体积移入冻存管中，按照制造商的说明将细胞置于冻存容器中进行冷冻。当六孔板中的神经干细胞达到80%融合度时，使用橡胶刮刀将其从培养皿上刮下，再通过轻柔吹打进行解离。

将细胞悬液汇集至无菌管中。使用血细胞计数板、细胞计数仪或自动细胞计数器对细胞进行计数，并用神经干细胞培养基将细胞悬液浓度调整至每毫升1 × 10⁵个细胞。随后，重复上述操作以处理所需数量的孔，在24孔板的每孔中，将1毫升细胞悬液滴加至预先涂有聚D-赖氨酸和层粘连蛋白的盖玻片上。

同前孵育24小时。孵育时间结束后，吸去培养基，更换为神经分化培养基，在37°C和5%二氧化碳条件下继续孵育两周，每周更换两次培养基。

神经干细胞应如图所示完全分化，并可用于后续实验操作，例如免疫荧光染色。前两张图像显示神经干细胞表达nestin和SOX2，而第三张图像表明OCT4未表达，DPI用作细胞核标记物，比例尺代表200微米。

按照视频中所述的分化方案操作后，分化得到的神经元表达神经元标志物 beta three tubulin。人神经干细胞也可分化为胶质细胞。当分化为星形胶质细胞时，细胞表达星形胶质细胞标志物 GFAP。

最后，在此图像中，细胞已分化为少突胶质细胞，并表达少突胶质细胞标志物 O4。一旦掌握该技术，从外周血诱导生成人神经干细胞可在约三周内完成。

如果操作得当，神经干细胞可进一步分化为神经元，且该方法避开了耗时且复杂的诱导多能干细胞（iPS）生成过程，因而可能成为在技术成熟后获取患者特异性神经元培养物的简便途径。该技术为神经科学领域的研究人员探索各类神经系统疾病的个体化细胞培养模型提供了新路径，有助于更准确地反映特定疾病中的遗传差异，尤其是来自个体患者样本的遗传特征。