Name: 人类神经干细胞从外周血造血祖细胞直接诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解从外周血造血祖细胞直接诱导人类神经干细胞的方法。该方法利用CD34阳性细胞转录因子重编程，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为再生医学研究提供新途径。

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作者无任何利益冲突需要披露。

1. 从成人全血中富集造血祖细胞
注意：造血祖细胞或 CD34+ 细胞可从多种来源获得的外周血单个核细胞（PBMC）中纯化，这些来源包括脐带血、白细胞分离物和全血，常用基于密度梯度离心的方法进行分离。此处列出的方法以全血为例。
<ol>
	<li>从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）：
	<ol>
		<li>通过插入件的中心孔，用移液器将 4.5 ml 淋巴细胞分离液加入 SepMate 管中。</li>
		<li>用等体积含 2% 人血清（v/v）的无菌 DPBS 稀释血液样本。例如，将 5 ml 样本与 5 ml DPBS + 2% 人血清混合稀释。</li>
		<li>沿管壁缓慢加入稀释后的样本，注意不要直接通过中心孔倾倒。</li>
		<li>在室温下以 1,200 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>小心移除 PBMC 层上方的上清液。</li>
		<li>将 PBMC 层（浑浊层）收集至新管中。</li>
		<li>向管中加入 15 ml 含 2% 人血清的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），在室温下以 150 × g 离心 10 分钟，关闭刹车。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 15 ml 含 2% 人血清的 DPBS 中，并计数细胞数量。</li>
		<li>在室温下以 690 × g 离心 10 分钟，完全移除管中所有上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 15 ml 含 1% 抗生素（v/v）和 10% 人血清（v/v）的 Iscove 改良杜氏培养基（IMDM）中，使细胞密度为 1 × 107 个细胞/ml。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜孵育，随后进行 CD34+ 细胞的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 CD34 MultiSort 试剂盒从 PBMC 中进行 CD34+ 细胞的阳性筛选： 
	注意：操作应迅速，并使用预冷溶液使细胞保持低温，以防止抗体在细胞表面发生帽化及非特异性标记，具体操作请参照试剂盒说明书。
	<ol>
		<li>将所有 PBMC 收集至 50 ml 管中，并计数培养基中的总细胞数。</li>
		<li>以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除所有上清液。</li>
		<li>每 300 µl 磁珠缓冲液（含 0.5% 人血清（v/v）和 2 mM EDTA 的 DPBS）中重悬最多 108 个细胞。</li>
		<li>加入 100 µl FcR 阻断试剂和 100 µl CD34 MultiSort MicroBeads。</li>
		<li>充分混匀，在冰箱中（2 - 8 °C）孵育 30 分钟。</li>
		<li>每 108 个细胞加入 2 ml 磁珠缓冲液洗涤细胞，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除上清液。</li>
		<li>每 500 µl 缓冲液中重悬最多 108 个细胞。</li>
		<li>将 MACS LS 柱置于 MACS 分离器的磁场中，用 3 ml 磁珠缓冲液冲洗柱子进行预处理。</li>
		<li>将细胞悬液加至柱子中央。未标记的细胞将流过，可根据需要收集。</li>
		<li>用 3 ml 磁珠缓冲液洗涤柱子三次。</li>
		<li>将柱子从分离器上取下，放置于 15 ml 管上。</li>
		<li>向柱子中加入 5 ml 磁珠缓冲液，并立即通过推动柱芯将磁性标记的细胞冲洗出来。</li>
		<li>每 1 ml 细胞悬液中加入 20 µl MultiSort 释放试剂，充分混匀，在冰箱中（2 - 8 °C）孵育 10 分钟。</li>
		<li>每 107 个细胞加入 1 - 2 ml 磁珠缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底移除上清液。</li>
		<li>每 107 个细胞用 50 µl 磁珠缓冲液重悬细胞。</li>
		<li>每 107 个细胞加入 30 µl MultiSort 终止试剂，在冰箱中孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 5 ml 磁珠缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从 CD34+ 细胞诱导神经干细胞的衍生
<ol>
	<li>CD34+ 细胞培养： 
	注意：新鲜配制的培养基在冰箱中储存时应在 7 天内使用。细胞在 24 小时后可能会出现明显的 CD34+ 细胞数量减少，但细胞应开始显著增殖，尤其是在第 5 天之后。如果细胞数量持续下降或无增殖现象，则提示培养基或 CD34+ 细胞质量不佳，不应用于下一步实验。
	<ol>
		<li>将 CD34+ 细胞重悬并接种于 CD34+ 维持培养基（StemSpan SFEM 培养基，含人血小板生成素（TPO，100 ng/ml）、fms 样酪氨酸激酶 3（Flt-3）配体（100 ng/ml）、干细胞因子（SCF，100 ng/ml）、白细胞介素-6（IL-6，20 ng/ml）和白细胞介素-7（IL-7，20 ng/ml））中，置于 24 孔板（每孔最多 3 × 105 个细胞，每孔 1 ml 培养基），在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
		<li>24 小时后，收集悬浮细胞，于室温下以 110 × g 离心，去除贴壁细胞和细胞碎片。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 新鲜 CD34+ 维持培养基中，接种至新的 24 孔板（每孔最多 1 × 105 个细胞），在 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养 5 天。</li>
		<li>每隔一天更换一半培养基，小心吸走上清液的上半部分，而 CD34+ 细胞仍悬浮于孔底（图 1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仙台病毒转染：
	<ol>
		<li>第 5 天，收集 CD34+ 细胞，于室温下以 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于新鲜培养基中，以每孔 1 × 105 个细胞的密度接种于 24 孔板（每孔 1 ml 培养基）。</li>
		<li>解冻仙台病毒重编程试剂盒（Cytotune-iPS Sendai），先将管底浸入 37 °C 水浴中 10 秒，随后在室温下完全解冻。短暂离心后置于冰上。根据相应批次的分析证书（COA）中推荐的每种病毒体积配制仙台病毒混合液。建议 MOI 为 15。</li>
		<li>将仙台病毒混合液加入各孔 CD34+ 细胞中，轻轻摇动混匀。将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
		<li>24 小时后观察转染效率。注意，细胞聚集体和球状结构的形成是转染成功的标志（图 1B）。</li>
		<li>通过小心转移上清液的上半部分至另一新孔来更换一半培养基。若新孔中存在细胞球，需加入等量新鲜培养基。</li>
		<li>每隔一天更换培养基，重复步骤 2.2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经干细胞诱导： 
	注意：根据细胞状态，转染后约 5 至 7 天，单层贴壁细胞将达到 30–50% 汇合度（图&#160;1C）。
	<ol>
		<li>移除含有悬浮细胞和细胞球的上清液，向贴壁细胞中加入 1 ml 神经前体细胞培养基（DMEM/F12 培养基，含 1× N2 添加剂、0.1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）、1%（v/v）抗生素、20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和 20 ng/ml 表皮生长因子（EGF））。</li>
		<li>可选步骤：通过轻柔吹打使细胞球解离，于 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 神经前体细胞培养基中，接种至预先按说明包被 Matrigel 的新 24 孔板中作为备份。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基，直至细胞达到 60–80% 汇合度，通常需 1 周左右。</li>
		<li>弃去上清液，加入 1 ml 神经干细胞培养基（无血清培养基，NSC SFM）。使用细胞刮刀刮下细胞，随后轻柔吹打使其解离。</li>
		<li>收集细胞，将全部细胞接种至 6 孔板中的一个孔内。再加入 1 ml 神经干细胞培养基，使每孔总体积为 2 ml。将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基。</li>
		<li>当细胞达到 60% 汇合度时，按照步骤 2.3.4 和 2.3.6 的方法进行解离，并以 1:3 的比例传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经干细胞冻存：
	<ol>
		<li>通过向神经干细胞培养基中加入 20% 二甲基亚砜（DMSO）配制神经干细胞冻存液。将冻存液置于冰上保存。</li>
		<li>使用细胞刮刀刮下 6 孔板中的细胞，随后轻柔吹打使其解离。计数细胞。于室温下以 170 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于神经干细胞培养基中，浓度为 1 × 106/ml。向细胞悬液中加入等体积的冻存液。</li>
		<li>将 1 ml 细胞悬液（共 5 × 105 个细胞）加入冻存管中。使用 Mr. Frosty 冻存盒，按照说明书操作进行细胞冻存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 神经细胞分化
<ol>
	<li>神经元细胞分化：
	<ol>
		<li>当神经干细胞达到80%融合度时，使用细胞刮轻轻刮下神经干细胞，并通过轻柔吹打进行解离。</li>
		<li>计数细胞，并用神经干细胞培养基将细胞浓度调整至1 × 105/ml。</li>
		<li>进行神经元分化时，将细胞以每孔1 × 105个的密度接种于24孔板中预先包被多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白的盖玻片上。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
		<li>24小时后，更换为神经分化培养基（DMEM/F12培养基，含1× N2添加剂、1× B27添加剂、300 ng/ml cAMP、0.2 mM 维生素C、10 ng/ml 脑源性神经营养因子（BDNF）和10 ng/ml 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF））。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育。</li>
		<li>每周更换两次神经分化培养基，持续2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>星形胶质细胞分化：
	<ol>
		<li>通过吹打法解离神经干细胞。</li>
		<li>计数细胞，并将细胞浓度调整至5 × 104 个/ml，接种于24孔板中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
		<li>更换为含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，并将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育。</li>
		<li>每周更换两次培养基，持续2周。若细胞在2周内达到融合状态，则按照步骤3.2.1和3.2.2重新传代细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>少突胶质细胞分化：
	<ol>
		<li>通过吹打法解离神经干细胞。</li>
		<li>计数细胞，并将1 × 105个细胞接种于预先包被多聚-L-鸟氨酸的24孔板中，每孔加入1 ml少突胶质细胞分化培养基，该培养基由DMEM/F12基础培养基组成，包含N2添加剂、10 ng/ml血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA）、2 ng/ml神经营养因子-3（NT-3）、2 ng/ml音猬因子（Shh）和3 nM三碘甲腺原氨酸（T3）。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
		<li>每周更换两次培养基，持续2周。</li>
		<li>更换为含1× N2添加剂和3 nM T3的DMEM/F12培养基，继续培养1周以促进髓鞘碱性蛋白（MBP）的生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>用4%多聚甲醛（PFA）替换培养基，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>弃去PFA，用含0.1% Triton X-100的PBS（PBS-T）洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下对细胞进行透化处理，持续10分钟。</li>
	<li>用含4%山羊血清的PBS-T在室温下封闭细胞20分钟。</li>
	<li>将细胞与相应的一抗在含0.1% BSA的PBS-T中稀释后孵育，室温下2小时或4°C过夜。</li>
	<li>用PBS-T洗涤细胞3次，每次5分钟。然后将细胞与相应荧光染料标记的二抗按1:400比例稀释于含0.1% BSA的PBS-T中，在摇床上避光孵育1小时。</li>
	<li>用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS-T在室温下洗涤细胞10分钟。</li>
	<li>再用PBS-T在室温下洗涤细胞两次，每次5分钟。</li>
	<li>使用显微镜观察标记的细胞并拍照（图3）。</li>
</ol>

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<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+patient+specific+iPS+cells+as+a+novel+approach+to+study+the+pathophysiology+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis.</a> Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).</li>
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<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+into+Stably+Expandable+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
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<li>Jin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Sendai+virus+provides+a+highly+efficient+gene+transfer+into+human+cord+blood-derived+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.</a> Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li>
</ol>

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院内基金资助。

提供了一种从外周造血祖细胞直接生成神经干细胞的详细方案。
与成纤维细胞相比，人外周血更容易获取。采用本方案，可从10 ml全血中富集出超过1 × 105个造血祖细胞，即CD34阳性细胞。尽管通常难以完全避免血小板污染，但通过较低速度的离心可有效减少污染，且该污染不会影响神经干细胞的生成。然而，CD34细胞的质量和数量将决定最终神经干细胞的产量。CD34细胞的质量可通过其对CD34培养基的反应进行粗略判断。良好的反应，即CD34细胞在培养基中快速增殖，是后续成功转化的关键。若CD34细胞未能增殖，甚至出现显著的细胞丢失，则转化将变得困难，并导致所得细胞增殖能力下降。因此，建议仅使用高质量的CD34细胞启动转化实验。尽管对于经验丰富的研究人员而言，1 × 105个CD34细胞已足够，但初学者可使用3 × 105个细胞。
使用仙台病毒可提供一种非整合、高效且便捷的方法，将转录因子导入靶细胞14,15。最初用于诱导多能干细胞（...

体外神经元培养已被用作神经系统疾病研究的基本工具。在这些研究中，最常用的模型是原代动物（主要是啮齿类）神经细胞培养1,2以及来源于胶质瘤或其他肿瘤的人类神经细胞系。然而，人们已认识到啮齿类与人类细胞之间存在显著差异，许多基于啮齿类动物的研究发现无法在人类中重现。此外，随着大规模基因组信息分析技术的快速发展，以及基因编辑和全基因组测序技术的日益简便，研究趋势越来越倾向于发现易感疾病基因，并阐明其在特定疾病中的功能与作用，这使得目前有限的人类神经细胞系的应用更加受限。理论上，从患者神经系统组织直接获取的原代人类神经细胞培养是最佳选择，但这类样本难以获得，因此必须寻求替代方法。近年来，已有若干方法被探索，其中两种尤为突出。随着利用小鼠和人类体细胞生成诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展3,4，可进一步将这些细胞分化为神经细胞5-7。然而，iPSC的生成与鉴定过程耗时耗力，技术要求高，有时甚至难以实现。此后不久，另一种方法被开发出来，即直接将体细胞转化为神经元细胞8,9。但由于所获得的神经元不具备增殖能力，限制了其在需要大量细胞的深入研究和药物筛选中的应用。为了结合上述两种技术的优势，多个研究团队已开始探索直接从体细胞诱导生成神经干细胞/前体细胞的方法10-12，该方法避免了iPSC生成与鉴定的繁琐过程，同时仍能提供足够数量的神经干细胞用于后续的神经分化。我们此前已证明，在将Yamanaka转录因子导入造血祖细胞后，可通过神经前体细胞筛选培养基直接生成神经干细胞13。本文中，我们将详细报告该方法。

<table><tbody><tr><td>淋巴细胞分离介质</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>人血清</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort 试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM 培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai 重编程试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube 冻存管</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冻存盒</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0.1% (w/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC 无血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片</td><td>BD Biosciences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>维生素 C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0.2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>吐温 X-100（TritonX-100）</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 Nestin 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>抗 SOX2 抗体</td><td>Applied Stemcell</td><td>ASA0120</td><td>即用型</td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;beta;III-微管蛋白抗体</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>1:1,000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗 GFAP 抗体</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗 O4 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM；1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗兔抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>1:400 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgM 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td>1:250 稀释</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &amp;mu;g/ml</td></tr></tbody></table>

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

人类疾病特异性的神经元培养物对于生成 体外 用于人类神经系统疾病的研究模型。然而，难以获取原代人类成体神经细胞培养物带来了独特的挑战。近年来，诱导性多能干细胞（iPSC）技术的发展提供了一种替代方法，可通过患者特异性的iPSC从皮肤成纤维细胞中获得神经细胞培养物，但该过程耗时耗力，需要特殊的专业技术和大量资源，且通常需要数月时间。这限制了该技术在神经系统疾病研究中的广泛应用。为克服上述部分问题，我们开发了一种直接从人类成体外周血中获取神经干细胞的方法，从而绕过iPSC的诱导过程。该方法通过富集人类成体外周血中的造血祖细胞并进行培养 体外 并使用含有转录因子 Sox2、Oct3/4、Klf4 和 c-Myc 的仙台病毒载体进行转染。转染后细胞发生形态学改变，并通过添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的人类神经前体细胞培养基进一步筛选。所获得的细胞表达神经干细胞标志物，如 nestin 和 SOX2。这些神经干细胞可在特定的分化培养基中进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。利用易于获取的人外周血样本，该方法可用于获取神经干细胞，进而分化为神经细胞以用于 体外 神经系统疾病的建模可能推动与这些疾病发病机制及治疗相关研究的进展。

CD34细胞的质量对于神经干细胞转导的成功至关重要。高质量的CD34细胞在培养的最初几天内会增殖，表现为非贴壁、形态均一的圆形细胞，悬浮于培养容器底部上方（图1A）。成功感染后会形成细胞团簇，并随时间逐渐扩大（图1B），而在细胞培养过程中也可能出现非特异性的细胞团簇，其体积会增大但结构松散。贴壁细胞通常在转染后约三到五天出现，多呈双极形态，并进一步增殖形成单层细胞（图1C）。经过神经前体细胞培养基筛选后，大部分贴壁细胞表达nestin和SOX2，但不表达OCT4（图2）。诱导获得的神经干细胞可进一步分化为神经元和胶质细胞（图3）。
<img alt="细胞培养的显微镜图像，展示用于分析的不同细胞密度和形态。" src="/files/ftp_upload/52298/52298fig1.jpg" data-altupdatedat="178...

已建立一种方法，可直接从外周血细胞中富集的造血祖细胞诱导生成人类神经干细胞。

人类疾病特异性的神经元培养物对于构建人类神经系统疾病的体外模型至关重要。然而，由于难以获取……

本实验的总体目标是将血细胞直接诱导为神经干细胞。该过程首先从血液中富集 CD34 阳性的造血祖细胞，第二步是利用含有转录因子的仙台病毒转染 CD34 阳性细胞。接下来，使用选择性培养基分离神经干细胞。最后一步是将诱导的神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。最终，通过免疫荧光显微镜对所获得的细胞进行表征。与现有方法（例如直接从成纤维细胞诱导神经元，或诱导性多能干细胞（iPS）生成）相比，该技术的主要优势在于，它避开了繁琐的iPS细胞生成与扩增过程，但仍能获得大量可进一步分化为神经元的神经样细胞。我最初产生这一方法的构想，是由于注意到经转染的CD34细胞在贴壁后表现出的形态特征与原代培养的神经前体细胞极为相似，这提示该操作具有可行性。本实验由我实验室的技术员Marines首先实施。在根据文本方案中的说明从外周血单个核细胞中分离出CD34细胞后，开始进行CD34细胞的培养：用CD34培养基重悬CD34细胞，随后将细胞以每毫升培养基含三乘以十的五次方个细胞的密度接种至24孔板中，每孔接种一毫升细胞悬液。在含5%二氧化碳、37摄氏度的组织培养箱中孵育24小时后，收集悬浮细胞，将细胞悬液在室温下以110 × g离心。然后弃去上清液，用新鲜的CD34维持培养基重悬细胞。以每孔1毫升培养基接种新的24孔板，每孔接种1 × 10⁵个细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中继续孵育5天，每隔一天更换一半培养基。在第5天，当CD34细胞沉降至孔板底部时，小心吸取上清液的上半部分。接种后，收集CD34细胞，在室温下以170 × g离心10分钟，弃去上清液，按前述方法重悬细胞，并以每孔1 × 10⁵个细胞的密度将细胞接种至新的24孔板中，每孔加入1 mL培养基。接下来，解冻一份CytoTune iPS Sendai重编程试剂盒。首先将试管底部浸入37摄氏度水浴中10秒，然后在室温下完全解冻。短暂离心试管后置于冰上。根据分析证书中对应批次所列每种病毒的推荐体积，混合制备仙台病毒混合液。建议感染复数为15。将仙台病毒混合物加入至每孔CD34细胞中，然后通过轻轻摇动培养板混匀各孔。24小时后，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育细胞。观察转导效率。注意，细胞聚集体和类球体（如本图所示）是转导成功的指标。然后将细胞置于组织培养孵育箱中孵育5至7天，每隔一天观察一次，直至贴壁细胞出现并达到30%至50%融合度，如图所示。通过小心地将上半部分培养基转移至另一个孔中，更换一半培养基。若细胞球体被转移至新孔中，则加入等量的新鲜培养基。使用倒置显微镜检查细胞的融合度。当细胞融合度达到30%至50%时，吸除上清液并保留，然后向每孔加入1毫升神经前体细胞培养基，利用上清液中的类球体作为备用培养板。将保留的上清液在170 × g条件下离心10分钟。随后吸除上清液，将沉淀物重悬于神经前体细胞培养基中，并接种至基质胶包被的24孔板中。与之前相同，每隔一天更换每孔细胞的培养基，直至细胞达到60%至80%融合度，通常需要一周左右。当细胞达到所需融合度后，吸除上清液，每孔加入一毫升神经干细胞培养基。然后使用细胞刮刀解离细胞，再进行非常轻柔的移液操作。接着，将24孔板中一个孔的细胞转移至6孔板的一个孔中。向孔中再加入1毫升培养基，对所有孔重复此操作后，将六孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中。每隔一天更换一次完全培养基，直至细胞达到60%融合度，随后以1:3的比例消化并重新接种细胞，如前所示冻存一部分未分化的神经干细胞。首先，通过向神经干细胞培养基中加入20%二甲基亚砜（DMSO）配制干细胞冻存液，并置于冰上。然后用细胞刮和轻柔的吹打将六孔板中的细胞解离。保留一部分细胞悬液用于细胞计数，同时将剩余细胞在室温下以170 × g离心10分钟。在细胞离心过程中，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对保留的悬液样本进行细胞计数，并计算所需培养基体积，以获得每毫升含1 × 10⁶个细胞的细胞浓度。离心结束后，弃去上清液，并将沉淀重悬于神经干细胞培养基中，密度为每毫升1×10⁶个细胞。然后加入等体积的冻存液，将5×10⁵个细胞以1毫升体积移入冻存管中，按照生产商说明书的要求将细胞置于冻存盒中进行冻存。当六孔板中的神经干细胞达到80%融合度时，使用橡胶刮刀将其从培养皿上刮下，再通过轻柔吹打进行解离。将细胞悬液汇集至无菌管中。使用血细胞计数板、细胞计数仪或自动细胞计数器对细胞进行计数，并用神经干细胞培养基将细胞悬液浓度调整至每毫升1 × 10⁵个细胞。随后，重复上述操作以处理所需数量的孔，在24孔板的每孔中，将1 mL细胞悬液滴加至预先涂有聚D-赖氨酸和层粘连蛋白的盖玻片上。同前孵育24小时。孵育时间结束后，吸去培养基，更换为神经分化培养基，在37°C和5%二氧化碳条件下继续孵育两周，每周更换两次培养基。神经干细胞应如图所示完全分化，并可用于后续实验操作，例如免疫荧光染色。前两张图像显示神经干细胞表达 nestin 和 SOX2，而第三张图像表明 OCT4 未表达，DPI 用作细胞核标记物，比例尺代表 200 微米。按照视频中所述的分化方案操作后，分化得到的神经元表达神经元标志物 beta three tubulin。人神经干细胞也可分化为胶质细胞。当分化为星形胶质细胞时，细胞表达星形胶质细胞标志物 GFAP。最后，在此图像中，细胞已分化为少突胶质细胞，并表达少突胶质细胞标志物 O4。一旦掌握该技术，从外周血诱导生成人神经干细胞可在约三周内完成。如果操作得当，神经干细胞可进一步分化为神经元，从而绕开耗时且复杂的诱导多能干细胞（iPS）生成过程，成为在该技术成熟后获取患者特异性神经元培养物的一种简便选择。该技术为神经科学领域的研究人员探索各类神经系统疾病的个体化细胞培养模型提供了新途径，可能更准确地反映特定疾病中的遗传差异，尤其是来自个体患者样本的遗传特征。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人类神经干细胞从外周血造血祖细胞直接诱导

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频展示了利用仙台病毒将外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）的方法。仙台病毒是一种非整合型病毒，可作为一种高效且安全的细胞重编程载体。...

从外周血单个核细胞（PBMNCs）生成诱导性神经干细胞（iNSCs）：一种基于仙台病毒的将PBMNCs重编程为iNSCs的操作流程

本视频展示了将基因修饰的造血祖细胞直接重编程为神经干细胞的过程。造血祖细胞表达的转录因子触发了一系列分子事件，促进其转化。随后使用特定的培养基来筛选并扩增诱导产生的神经干细胞。...

造血祖细胞直接重编程为神经干细胞

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

本方案描述了通过强制表达转录因子，从人多能干细胞高效诱导生血内皮细胞和多能造血祖细胞的方法。...

通过转录因子过表达在人多能干细胞中直接诱导生血内皮和血液细胞

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

本文介绍了一种对脐带血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞进行免疫表型鉴定以及细胞因子诱导其向四种髓系谱系分化的实验方案。该方案可用于研究髓系疾病相关突变或小分子化合物对CD34+细胞髓系分化的影响。...

人脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞的泛髓系分化

了解从外周血造血祖细胞直接诱导人类神经干细胞的方法。该方法利用CD34阳性细胞转录因子重编程，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，为再生医学研究提供新途径。

直接诱导人外周血造血祖细胞生成神经干细胞

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