人类神经干细胞从外周血造血祖细胞直接诱导
January 28th, 2015
的方法的开发是为了直接从外周血细胞富集的造血祖细胞衍生的人神经干细胞。
该程序的总体目标是直接从血细胞中诱导神经干细胞。这是通过首先从血液中富集 CD 34 阳性造血祖细胞来实现的。第二步是用含有转录因子的 sendi 病毒转染 CD 34 细胞。
接下来，使用选择性培养基提取神经干细胞。最后一步是将诱导的神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。最终，免疫荧光显微镜用于表征所得细胞。
与现有方法相比，该技术的主要优点，例如直接来自成纤维细胞的神经元的持续时间，以及 IPS 生成，是该方法绕过了 IPS 生成和计算的繁琐过程，但仍然提供大量可以与神经元相关、分化的神经元细胞。当我注意到贴壁转染的 CT 34 细胞实际上显示出与原代培养的神经祖细胞非常相似时，我第一次想到了这种方法，这表明该程序将是我生活中的技术人员 Marines。根据文本方案中的说明从外周血单核细胞中分离 CD 34 细胞后，开始通过 Resus 培养 CD 34 细胞的过程，将 CD 34 细胞悬浮在 CD 34 培养基中，然后将细胞以 10 倍的 3 倍接种到 24 孔板中，至每孔第五个细胞在一毫升培养基中。
在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的组织培养箱中孵育 24 小时后，收集漂浮细胞并在室温下以 110 倍 G 离心细胞悬液。然后弃去上清液，将细胞重悬于新鲜的 CD 34 维持培养基中。在每毫升培养基中以每孔 10 到 5 个细胞一次看到一个新的 24 孔板，在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中再孵育 5 天，每隔一天更换一半的培养基。
当 CD 34 细胞位于孔底部时，小心吸出上清液的上半部分，如此处在第五天所示。铺板后，收集 CD 34 细胞，在室温下以 170 倍 G 离心细胞 10 分钟，弃去上清液，像以前一样重悬细胞，并以每孔 10 倍至第 5 个细胞的速度在 1 毫升培养基中接种新鲜的 24 孔板。接下来解冻 cyto tune IPS Sendi 重编程试剂盒。
首先将试管底部浸入 37 摄氏度的水浴中 10 秒，然后在室温下完全解冻。短暂离心试管并将它们放在冰上。通过混合相应批次分析证书上列出的每种病毒的推荐体积来制备仙台病毒混合物。
建议感染的多重数为 15。将仙台病毒混合物添加到 CD 34 细胞的每个孔中。然后轻轻摇动板，混合孔。
24 小时后，将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育。观察转导效率。请注意，细胞聚集体和球体（如此处所示）是转导成功的指标。
然后将细胞在组织培养箱中孵育 5 到 7 天，直到出现贴壁细胞并达到 30% 至 50% 汇合，如图所示，每隔一天一次。小心地将培养基的上半部分转移到另一个孔中，更换一半的培养基。如果将细胞球转移到新的培养基中，则加入等量的新鲜培养基。
使用倒置显微镜检查细胞的共融合度。当细胞汇合 30% 至 50% 时，吸出上清液并保留，然后向每个孔中加入 1 毫升神经祖细胞培养基，以使用上清液离心机中的球体制作备份板，保留上清液为 170 倍 G 10 分钟。然后吸出上清液，并将沉淀重悬于基质胶包被的 24 孔板中的神经祖细胞培养基板中。
和以前一样，每隔一天更换每板细胞中的培养基，直到细胞达到 60% 至 80% 汇合。通常在一周后。一旦细胞达到所需的汇合度，吸出上清液并向每个细胞中加入 1 毫升神经干细胞培养基。
然后用细胞刮刀解离细胞，然后非常轻柔地移液。接下来，将细胞从 24 孔板的一个孔中转移到 6 孔板的一个孔中。孔板。
向孔中加入另一毫升培养基，对所有孔重复该过程后，将六孔板放入 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中。每隔一天更换一次全体积的培养基，直到细胞达到 60% 汇合，然后以 1 比 3 的比例解离和充气细胞，如前所述，以冷冻一部分未分化的神经干细胞。首先，通过向神经干细胞培养基中加入 20% 二甲基亚砜或 DMSO 来制备干细胞冻存培养基，并置于冰上。
然后解离六孔板中的细胞。使用细胞刮刀和轻柔移液。保留一份等分的悬浮液用于细胞计数，然后在细胞旋转时在室温下以 170 倍 G 离心细胞 10 分钟，使用血液、细胞仪或自动细胞计数仪对悬浮液等分试样中的细胞进行计数，并计算得到 1 倍 10 至 6 个细胞/毫升细胞浓度所需的培养基体积。
离心完成后，弃去上清液，以 10 倍/mL 的 6 个细胞的速度将沉淀重悬于神经干细胞培养基中。然后将等体积的冷冻培养基移液管 5 乘以 10 倍的体积添加到第五个细胞中，体积为 1 毫升，放入冷冻瓶中，并根据制造商的说明将细胞冷冻在冷冻容器中。当六孔板中的神经干细胞达到 80% 汇合时，使用橡胶警察将它们分离，然后通过轻轻移液解离。
将细胞悬液汇集到无菌管中。使用血液、细胞仪或自动细胞计数器对细胞进行计数，并使用神经干细胞培养基将细胞悬液浓度调节为每毫升 10 至 5 个细胞的 1 倍。然后，将 1 毫升细胞悬液移液到聚 D 赖氨酸上，并在 24 孔板的一个孔中重复该过程，然后对所需数量的孔重复该过程。
像以前一样孵育 24 小时。孵育时间过后，吸出培养基并替换为神经分化。培养基在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两周，两周后每周更换两次培养基。
神经元干细胞应如图所示完全分化，并准备好用于免疫荧光染色等下游应用。前两张图片显示神经干细胞表达巢穴，SOX 2 表达。虽然第三张图像表明 OCT 4 没有表示，但 DPI 用作核标记，比例尺代表 200 微米。
遵循视频中概述的分化方案后，分化的神经元表达神经元标志物 β 3 微管蛋白。人类神经干细胞也可以分化为神经胶质细胞。当分化为星形胶质细胞时，细胞表达星形胶质细胞标志物 GFAP。
最后，在这张图片中，细胞已经分化成少突胶质细胞并表达少突胶质细胞标志物。O 四。一旦掌握，从外周血中产生诱导的人类神经干细胞可以在大约三周内完成。
如果执行得当，神经干细胞可以进一步分化为神经元，并且由于漫长而复杂的 IPS 生成过程而不清楚方法，并且可能是在其发育后生成患者特异性神经元培养物的简单选择。这种技术途径为神经科学领域的研究人员探索各种神经系统疾病的个体细胞培养建模，这可能更好地代表特定疾病的遗传差异，尤其是来自个体患者样本的遗传差异。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究提出了一种直接从外周血获得的造血祖细胞衍生人类神经干细胞的方法。该过程涉及富集CD34阳性细胞，用特定的病毒载体转染它们，并将它们分化为各种神经细胞类型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞分化
背景
- 造血祖细胞可以从外周血中获得。
- CD34阳性细胞对于衍生神经干细胞至关重要。
- 转录因子在细胞重编程中起关键作用。
- 免疫荧光显微镜对于细胞表征至关重要。
研究目的
- 开发从血细胞直接诱导神经干细胞的方法。
- 增进对干细胞分化的理解。
- 为研究和治疗提供潜在的神经细胞来源。
使用的方法
- 从血液中富集CD34阳性造血祖细胞。
- 用含有转录因子的sendl病毒转染CD34细胞。
- 使用选择性培养基衍生神经干细胞。
- 通过免疫荧光显微镜对细胞进行表征。
主要结果
- 成功从造血祖细胞衍生神经干细胞。
- 诱导的细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
- 表征确认了衍生细胞类型的身份。
- 该方法提供了一种生成神经细胞的新方法。
结论
- 该研究展示了一种从血液中衍生神经干细胞的可行方法。
- 这种方法可能促进再生医学的进展。
- 需要进一步研究以探索其治疗应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells enables rapid generation of patient-specific neural cultures, bypassing the labor-intensive iPSC process. This approach accelerates the creation of disease-relevant in vitro models for neurological research, supporting earlier and more scalable target validation. The method enhances portfolio flexibility by enabling access to neural cell types from minimally invasive blood samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of disease mechanisms using patient-derived neural cells.
- Facilitates functional target validation in human-relevant cellular contexts.
- Supports predictive confidence by modeling genetic diversity from individual samples.
Screening & Assay Development
- Provides a renewable source of validated neural stem cells for assay development.
- Improves reproducibility and standardization in neural differentiation protocols.
- Enables scalable preparation of neurons, astroglia, and oligodendrocytes for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant human biology for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation using patient-specific cells.
- Reduces biological risk by enabling mechanistic de-risking in human neural systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research, providing a bridge between patient sample acquisition and disease modeling.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification using directly induced neural cells.
- Screening: Delivers assay-ready neural stem cells and differentiated lineages for robust screening workflows.
- Analytics: Supports quantitative immunofluorescence readouts for cell identity and differentiation status.
- Translational Research: Enables modeling of neurological disorders with patient-specific genetic backgrounds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating neural cells from accessible blood samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural disease modeling.
- Operational Value: Streamlines workflows by bypassing iPSC generation and reducing time to neural cell availability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in neurological portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurological targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hematopoietic cell isolation and viral transfection techniques.
- Needs access to cell culture, immunofluorescence, and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible neural differentiation outcomes.
- Adaptation may be needed for different blood sample sources or disease contexts.
- Dependent on quality and viability of starting hematopoietic progenitor cells.
