Name: 中脑多巴胺神经元的数目在成年小鼠环境的调变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 了解成年小鼠环境调控方法，通过性别配对和丰富环境刺激神经可塑性，结合药物输注技术研究中脑多巴胺神经元变化。该技术有助于揭示环境诱导的脑可塑性机制。

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本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助（资助号：1022839）。AJH 获得澳大利亚研究理事会（ARC）未来学者基金（FT100100835）。弗洛里神经科学与心理健康研究所感谢维多利亚州政府运营基础设施支持基金提供的支持。

注意：所有动物实验程序均经弗洛里神经科学研究所批准 &amp;#38; 动物伦理委员会心理健康分委会，并符合澳大利亚国家卫生与医学研究委员会发布的《科学用途动物护理与使用实践守则》（7th 第2版，2004年
1. 环境调控
<ol>
	<li>性别配对
	<ol>
		<li>使用性成熟（&#62;8周龄、年龄匹配的雄性和雌性小鼠 
		注意：我们通常使用 C57BL/6 小鼠，但在本方案中使用 Swiss 小鼠也获得了相同的结果。每次实验通常使用 n = 8 只雄性小鼠和 n = 8 只雌性小鼠，分为 n = 2 对雄性-雄性配对（n = 4 只雄性），n = 2 对雌性-雌性配对（n = 4 只雌性），以及 n = 4 对雄性-雌性配对（n = 4 只雄性和 n = 4 只雌性）。</li>
		<li>进入动物饲养设施后，按性别将小鼠分组饲养 &#62;3 天适应期。此处及后续的性别配对过程中，均需避免无关环境刺激（例如 环境温度、光照：黑暗周期、食物、水、抓取和清洁）保持恒定或均等地分配给所有小鼠。</li>
		<li>将每只小鼠随机分配至雄性-雄性配对、雌性-雌性配对或雄性-雌性配对。将每对小鼠单独置于洁净的笼具中（2只/笼），并 随意摄取 自由饮水和进食，并以此方式连续饲养7天。 
		注意：在此期间可进行常规动物饲养管理，但必须对所有小鼠均等地实施。注意避免同窝雄性和雌性小鼠配对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>环境丰富化
	<ol>
		<li>使用性成熟的（&#62;8周龄、性别匹配的雄性或雌性小鼠 
		注：我们通常在每项实验中使用 n = 18 只小鼠，分为 n = 6/处理组。</li>
		<li>进入动物饲养设施后，将它们以相同的标准化饲养（SH）条件进行群养（例如 此阶段的条件如下） &#62;3 天以适应环境。此处及整个实验过程中，需避免无关环境刺激（例如 环境温度、光照：黑暗周期、食物、水、抓取和清洁）保持恒定或均等地分配给所有小鼠。</li>
		<li>开始环境富集时，将每只小鼠随机分配至以下3组之一：标准饲养（SH）、跑步轮（RW）或环境富集（EE），并将每组小鼠共同置于相同的洁净笼具中 随意摄取 食物和水的获取 
		注意：此处对所有组别均使用了较大的大鼠饲养笼，尺寸为宽27 cm、长42 cm、深16 cm。
		<ol>
			<li>此外，为每组提供以下环境条件：SH组仅在笼底铺设垫料（纸粒或木屑）；RW组在SH基础上增加2个跑轮；EE组在RW基础上再添加玩具（如绳索、梯子、管道以及空的纸巾卷和纸巾碎片等），供动物探索、玩耍、攀爬、躲藏和筑巢。</li>
			<li>以这种方式持续饲养14天。 
			注意：在此期间可进行常规动物饲养管理，但必须对所有小鼠均等地实施。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将EE组小鼠进行额外的“超级丰富化”（SE）处理，即将它们共同放置于一个更大的笼子中，内含 新颖的 每天1小时玩具时间（每天同一时段），每周5天。 
		注意：此处使用了一个宽46 cm、长69 cm、深40 cm的塑料容器。
		<ol>
			<li>每次实验时提供不同的玩具组合以保持新颖性。对于需再次提供给小鼠的玩具，先用肥皂水和80%乙醇清洗，以去除气味残留。</li>
			<li>每次SE训练结束后，将小鼠放回其EE饲养笼中。在此期间，对SH和RW组小鼠的处理方式与SE组小鼠相同（SE操作本身除外）。例如 将每只SH和RW小鼠从笼中取出并放回其笼中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. 用于药物输注的渗透泵和脑部输注套管植入
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>使用 commercially 可购得的无菌渗透泵和脑部灌注套件。在植入前一天，采用无菌技术&#160;技术，通过将每个泵、连接管和导管填充无菌药物或载体溶液（具体操作见泵附带的说明书），对植入物进行预处理。将各部件连接在一起，并在37 °C的无菌生理盐水中孵育过夜。药物填充和载体填充的植入物应分别孵育，以避免交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外科手术 
	注意：根据实验人员所在国家的不同，开展此类手术及术后实验可能需要特殊的动物实验许可或批准。
	<ol>
		<li>对所有手术器械进行灭菌，并采用无菌操作技术&#160;在整个技术过程中。麻醉一只小鼠（例如 使用含1-2%异氟烷的空气进行麻醉，并将动物固定于立体定位仪头架中。在整个操作过程中监测麻醉深度，并根据需要追加麻醉剂 （例如 足部受到有害夹捏时无肢体回缩反应表明麻醉效果充分。使用润滑性眼膏保护小鼠眼睛，防止角膜干燥，并在整个手术过程中维持其体温正常。</li>
		<li>从两眼之间开始，沿中线切开皮肤，至颅骨后缘向后2 cm处结束。钝性分离皮肤与下方筋膜，沿小鼠背部向后剥离，形成一个皮下“囊袋”，大小应足以舒适地容纳泵体及连接管（插管植入后，连接管不应弯曲）。刮除覆盖在颅骨背侧的筋膜。</li>
		<li>使用直径约1.5 mm的牙科钻头，在相应的立体定位坐标处钻入颅骨，直至仅剩一层薄而柔韧的骨片。用精细镊子将此骨片剥离（以避免牙科钻头损伤下方的硬脑膜和脑组织）。确保清除颅骨上的血液和骨碎片，并确认无进一步出血。</li>
		<li>将套管固定在套管架上，将泵和连接管置于小鼠背部皮下“囊袋”内。接着，将套管尖端定位至相应立体定位坐标点，并使其位于脑表面。小心地将套管缓慢插入脑组织，但需在达到目标深度前约1 mm处停止。 
		注意：剩余深度将在应用第一层牙科丙烯酸树脂后确定。</li>
		<li>再次确保颅骨表面清洁且干燥，然后准备少量牙科丙烯酸树脂，用牙签将其均匀涂抹于整个暴露的颅骨表面，包括围绕套管的颅骨钻孔区域。在丙烯酸树脂硬化前，将套管尖端继续缓慢下放至目标深度。</li>
		<li>准备少量牙科丙烯酸树脂，将其覆盖在第一层之上，并覆盖导管的白色塑料支撑部分，以固定导管位置。根据需要重复添加丙烯酸树脂层。</li>
		<li>待丙烯酸树脂硬化后，小心取下套管固定器，并使用经丁烷火焰加热的手术刀片切除白色塑料可拆卸套管标签。最后，缝合皮肤，完全覆盖整个植入物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物术后处理
	<ol>
		<li>将抗菌药膏涂抹于皮肤边缘，并向小鼠施用抗炎药物（例如 美洛昔康，3 mg/kg，皮下注射）。将小鼠从固定架上取下，置于加热灯下，并观察直至其恢复意识。在小鼠完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同居的环境中。 
		注意：性别配对和环境富集等实验操作最早可在手术后的次日开始或恢复。</li>
		<li>每天监测其体重、一般行为和外观。处理感染迹象（例如 手术切口周围出现肿胀、发红、化脓等情况时，使用局部外用抗菌软膏。如出现任何疾病、疼痛、应激或不适症状，应及时处理（例如 缺失 &#62;10% 体重减轻、社交退缩、缺乏理毛行为、“炸毛”、运动功能障碍、癫痫发作）根据需要使用全身性镇痛药和/或抗生素治疗。</li>
		<li>如果小鼠需要实施安乐死 &#62;体重减轻15%或出现疾病、疼痛、应激或不适症状，且在采取补救措施后1周内无法恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑组织制备、免疫组织化学处理与体视学分析
<ol>
	<li>灌注
	<ol>
		<li>在环境/药物干预后立即准备脑组织以供研究。 
		注意：在本报告所述实验中，测量并比较了各不同处理组中黑质致密部TH+神经元的数量。</li>
		<li>首先注射过量麻醉剂以处死小鼠（例如 100 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠）。麻醉后但在心脏停止跳动前，将小鼠仰卧放置，并固定或用针固定双侧前肢。</li>
		<li>使用解剖刀切除覆盖胸腔的皮肤，然后在肋骨下方切开肌肉，进入腹腔。在肋骨的剑突部位放置止血钳，将肋骨向上提起并远离肝脏，以暴露膈肌。</li>
		<li>用大剪刀从两侧横向剪开膈肌和肋骨，直至能将肋骨向头部方向翻折，以暴露肺和心脏。用精细剪刀在右心房做一小切口，作为血液及灌注液的流出通道，然后在左心室底部剪开，将导管经左心室向上插入，穿过左心房，进入主动脉。</li>
		<li>将套管固定后，通过血管系统泵入温热（37 °C）的肝素化0.1 M磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），直至从右心房流出的液体完全无血。接着，通过血管系统泵入冷的（4 °C）固定液（如含4%多聚甲醛的PBS），直至整只小鼠充分固定。取出脑组织，置于含30%蔗糖的PBS中，浸泡2–3天，直至脑组织沉底。 
		注意：根据相应实验室的专业技术，可采用其他类型的组织制备方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>游离式冷冻切片的制备
	<ol>
		<li>在目标脑区进行连续切片，并将切片收集于PBS中。 
		注意：我们使用冷冻切片机切割40 µm厚的切片。根据相应实验室的专业技术，也可采用其他类型的组织切片方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学
	<ol>
		<li>对目标蛋白进行标准免疫组织化学染色。室温下用含5%正常山羊血清和0.3% Triton X-100的PBS溶液孵育切片30分钟，随后在4 °C下与多克隆兔抗TH抗体（1:400）反应48小时，再在室温下与生物素化多克隆山羊抗兔抗体（1:1,000）反应2小时。</li>
		<li>接下来，室温下用亲和素-过氧化物酶（1:500）孵育1小时，然后在室温下用钴-镍增强的二氨基联苯胺（0.5 mg/ml）孵育18–20分钟；在二氨基联苯胺孵育的最后3–5分钟内加入过氧化氢（0.01%），以催化色原沉淀。上述每一步操作前后及之间，均需用PBS洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。</li>
		<li>将切片贴附于明胶包被的载玻片上，自然晾干，随后进行尼氏染色（中性红），酒精脱水，透明处理（X-3B），最后封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体视学
	<ol>
		<li>使用无偏倚体视学方法估算 TH+ 和 TH- 的黑质致密部（SNc）（以及腹侧被盖区 VTA 和蓝斑 LC）神经元的总数。确保体视学分析人员对所接受的处理分组保持盲态。根据细胞体直径排除胶质细胞 &#60;5 µm，并仅计数具有可见细胞核的细胞。</li>
		<li>根据 Paxinos 和 Watson 的脑图谱，通过 TH+ 细胞的空间位置以及解剖标志/边界来确定黑质致密部（SNc）（以及腹侧被盖区 VTA 和蓝斑 LC）7在计数框内（55 × 55 µm = 3025 µm²）计数TH+细胞2以预定的固定间隔（黑质致密部：x = 140 µm，y = 140 µm；腹侧被盖区和蓝斑：x = 100 µm，y = 100 µm）在每第四个脑片的每个核团内进行取样。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

环境操作
设计这些环境干预措施（性别配对和环境丰富化）的动机是确定环境本身，以及由环境引发的行为，是否与中脑多巴胺（DA）神经元数量的变化相关。因此，研究的重点是提供能够激发中脑DA信号传导的环境，并诱导相应的相关行为。这些行为包括与异性配对，以及提供包含跑轮、绳索、梯子、隧道和可供探索、玩耍、攀爬、躲藏和筑巢物体的丰富化环境。这两种环境均应促进与奖赏动机相关的认知、情绪及运动行为，而这些行为已被证明与中脑DA神经元放电频率的急性增加以及DA释放的增加相关（例如e.g.8）。我们的假设是，这些环境也可能通过改变中脑DA神经元的数量，引起中脑DA信号传导的持久性变化。本文及其他研究6提供了证据，表明情况确实如此。
我们的研究最初采用性别配对方案（1.1），因为它包含一种核心的、原始的、基本的由奖赏驱动的行为即 交配）。此外，已知生殖、配对结合及社会行为会在其他神经化学系统中诱导出类似的变化。例如 下丘脑中催产素、血...

中脑腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNc）神经元的多巴胺能信号传导被认为对奖赏驱动的认知、情绪和运动行为具有重要作用。然而，中脑多巴胺（DA）信号过强或过弱均会导致多种神经系统疾病（例如帕金森病、注意缺陷多动障碍、精神分裂症和药物成瘾）中的许多致残症状。能够增强或减弱DA信号的药物可缓解这些症状，但也会因信号调节失常和脱靶效应而产生副作用。此外，由于大脑的代偿性反应，药物疗效会随时间推移而下降。因此，挑战在于以更精准且符合生理的方式恢复正常的中脑DA信号传导，其中一种备受青睐的策略是增加或减少中脑DA神经元的数量。
几十年来，已有越来越多的证据表明，成熟成年细胞中参与多巴胺（DA）及其他儿茶酚胺代谢与转运的相关基因和蛋白质的表达具有可塑性（综述见1在中脑中，经神经毒素处理后，酪氨酸羟化酶免疫阳性（TH+，多巴胺合成限速酶）神经元的数量先减少后增加2,3，而TH免疫阴性（TH-）神经元的数量则呈现相反的模式（即 先增加后减少3）。这与某些细胞失去后又获得“DA表型”的现象一致。已有研究显示，在接受不同处理后，这些细胞的电活动发生改变，随之黑质致密部（SNc）中TH阳性与TH阴性神经元的数量也呈现出相反方向但幅度相等的变化。4,5例如，将小电导钙激活钾（SK）通道拮抗剂阿帕明注入中脑持续2周，可减少TH+神经元数量，同时以相同程度增加TH- SNc神经元数量4,5相比之下，灌注SK通道激动剂1-EBIO可增加TH阳性SNc神经元数量，同时以相同程度减少TH阴性SNc神经 neuronal 数量4,5在针对黑质致密部神经元活动的多种处理之后，也观察到了类似的变化，其中包括一些针对传入输入的干预措施4这种由神经元活动和传入输入对SNc多巴胺能神经元数量表现出的明显调控作用，提示环境或行为可能影响SNc神经元的数量。事实上，暴露于不同环境的成年小鼠中脑（SNc和VTA）TH+神经元数量有所增减，且至少部分由环境诱导的改变可被同时阻断中脑突触输入所消除6本文的目的是：（1）进一步详细说明如何实施环境干预和药物灌注；（2）提供进一步的数据，支持我们关于环境可调控中脑多巴胺能神经元数量的观点。 通过 传入输入

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, 澳大利亚</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET 渗透泵 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET 脑部输注套件 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>ALZET 导管固定器 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex 单体自凝剂（牙科丙烯酸溶剂）</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, 荷兰</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex 自凝粉（牙科丙烯酸粉末）</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, 荷兰</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM（美洛昔康）</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 澳大利亚</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, 澳大利亚</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Merck Millipore Headquarters&amp;nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Merck Millipore Headquarters&amp;nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的多克隆山羊抗兔抗体</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, 澳大利亚 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>亲和素过氧化物酶</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠中脑多巴胺能神经元数量的环境调节

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

大脑中的长期变化，即“脑可塑性”，是适应性行为以及脑在疾病或损伤后自我修复的基础。此外，我们与环境的相互作用能够诱导脑可塑性。目前研究正日益致力于识别哪些环境刺激能够促进对治疗脑部和行为障碍有益的脑可塑性。本文描述了两种环境干预措施，它们可分别增加或减少成年小鼠中脑内酪氨酸羟化酶免疫阳性（TH+，即多巴胺（DA）合成限速酶）神经元的数量。第一种干预是将雄性和雌性小鼠持续配对共处1周，结果使雄性小鼠中脑TH+神经元数量增加约12%，而雌性小鼠则减少约12%。第二种干预是将小鼠持续饲养在包含跑轮、玩具、绳索、筑巢材料等的“丰富环境”（EE）中达2周，使雄性小鼠中脑TH+神经元数量增加约14%。此外，本文还介绍了一种在进行上述环境干预的同时，直接向中脑持续灌注药物的实验方案，以帮助揭示环境诱导脑可塑性的潜在机制。例如，通过同步阻断突触输入至中脑神经元，可完全消除丰富环境所诱导的中脑TH+神经元增多效应。综上，这些数据表明，有关环境的信息通过突触输入传递至中脑神经元，从而开启或关闭“DA”相关基因的表达。因此，适当的环境刺激，或针对其潜在机制的药物干预，可能有助于治疗与中脑多巴胺系统失衡相关的脑部和行为障碍（例如帕金森病、注意缺陷与多动障碍、精神分裂症以及药物成瘾）。

成年小鼠经过这些环境干预后，中脑（黑质致密部和腹侧被盖区）的酪氨酸羟化酶阳性（TH+）神经元数量发生改变，而蓝斑核（LC）的TH+神经元数量未受影响。丰富环境（EE）结合中脑灌注picrotoxin或bicuculline（GABAA受体拮抗剂）可消除丰富环境诱导的黑质致密部TH+神经元增加。这些数据先前已发表于文献6。当前数据来自作为前期研究一部分重复进行的实验，但尚未在其他地方发表。
具体而言，与成年雌性小鼠配对的成年雄性小鼠，其黑质致密部（SNc）和腹侧被盖区（VTA）（中脑）的TH+神经元数量多于与雄性配对的雄性小鼠；而与雄性配对的雌性小鼠，其TH+ SNc和VTA神经元数量则少于与雌性配对的雌性小鼠（见参考文献6中的图1）。本文提供的图1给出了另一个示例，显示了性别配对后立即检测的雄性和雌性小鼠TH+ SNc神经元的平均值±标准误（SE）。与雌性配对7天的雄性小鼠，其TH+ SNc神经元数量比与雄性配对的雄性小鼠多约12%（...

本方案描述了两种不同的环境干预方法以及一种同步进行的脑内灌注方案，用于研究成年小鼠中由环境诱导的、介导适应性行为和脑修复的脑部变化。

大脑的持久性改变，或称“脑可塑性”，是疾病或损伤后适应性行为以及脑修复的基础。此外，……

以下实验的总体目标是提供可控的环境条件，以刺激小鼠大脑的可塑性及行为改变。可通过将小鼠按雌雄配对饲养，与雄性-雄性、雌性-雌性对照配对进行比较，研究长期性别配对对大脑的影响；或者，也可将小鼠共同饲养在装有多种可供探索和玩耍物体的笼子中，与标准饲养笼进行对比，以研究环境丰富化对大脑的作用。此外，还可结合药物干预等其他处理方式，与上述环境刺激联用，以帮助揭示所观察到的大脑与行为变化背后的机制。结果表明，这些环境富集和处理措施会诱导中脑多巴胺能神经元数量发生变化，而这种变化依赖于中脑的 GABA 能突触传递。环境富集是一种增加小鼠躯体感觉、运动和认知刺激的范式。采用这种方法，多项研究已在多种疾病模型中观察到神经可塑性增强，以及学习和记忆能力的改善。该技术的意义在于有助于理解环境因素影响下成年大脑可塑性的机制，这对于治疗多种脑部和精神疾病具有重要意义。我们最初产生这一方法的设想，是在首次观察到中脑多巴胺神经元的数量会随着由突触输入驱动的中脑神经元活动的扰动而发生变化时。渗透泵和脑部输注套管的可视化演示可能至关重要，因为这些操作仅通过文字描述很难掌握。关于性别配对，将性成熟且年龄匹配的小鼠按性别分组，避免同窝配对，将每只小鼠随机放入清洁的笼子中，组成雄-雄配对、雌-雌配对或雄-雌配对，并单独饲养，自由获取食物和水，此条件适用于整个性别配对过程。保持所有无关环境刺激恒定或在所有小鼠中均等分布，并将动物持续饲养七天。进行环境富集时，将性成熟且年龄匹配的雄性或雌性小鼠随机分配至以下三组之一：标准饲养、配备跑轮饲养或环境富集饲养，至少持续三天。保持此种状态不变。在为期14天的实验期间，动物可自由获取食物和水。在环境富集过程中，标准饲养笼内应仅包含垫料。跑轮组笼具应包含垫料和两个跑轮，而环境富集组应包含垫料、两个跑轮以及玩具。将环境富集小鼠置于更大的笼子中进行额外的超级富集处理，每天一次，每次一小时，笼内放置新颖的玩具。每周五天，在每天同一时间将小鼠送回其原有的环境富集笼中。每次训练结束后，通过为每次训练提供不同的玩具组合以保持新颖性。用肥皂水和80%乙醇清洁所有将提供给小鼠的玩具。为去除任何气味，每天以相同方式、相同持续时间置换标准饲养环境组和跑轮组的小鼠，但在植入前一日不添加超级丰富化材料。采用无菌技术，根据制造商说明书，用无菌药物或对照溶剂溶液填充每个无菌渗透泵、连接管和套管。然后将各部件连接在一起，在手术当天置于无菌生理盐水中，37摄氏度下孵育过夜。通过足部夹捏确认麻醉效果后，为动物涂抹眼膏，并将其仰卧置于加热垫上。接下来，采用无菌技术，从颅骨后缘向后2厘米处开始，沿中线切开皮肤，至两眼之间结束；随后钝性分离皮肤与下方筋膜，沿小鼠背部向下剥离，形成一个皮下腔隙，大小需足以舒适地容纳泵体及连接导管。然后用刮匙将颅骨背侧表面的筋膜彻底清理干净，使用直径约1.5毫米的牙科钻头，在相应的立体定位坐标处钻入颅骨，直至仅剩一层薄而柔韧的骨片，再用精细镊子将其剥离。待颅骨表面的血液和骨碎片完全清除，且无进一步出血后，使用套管固定器将泵体及连接导管置入刚形成的囊腔中。现在将套管尖端定位至脑表面相应的立体定位坐标位置，随后小心地将导管缓慢下插至距离目标深度1毫米处。再次确保颅骨表面清洁且干燥，然后使用牙签将新配制的牙科丙烯酸树脂均匀涂抹于整个暴露的颅骨区域，包括在树脂硬化前环绕导管的钻孔部位。将导管尖端继续下放至目标深度。随后，当导管就位后，小心地在颅骨表面以及导管的白色塑料支撑结构上再覆盖一层新配制的牙科丙烯酸树脂，以固定导管位置。待丙烯酸树脂硬化后，小心移除套管固定器，并使用加热的手术刀片熔穿塑料套管的标签部分。然后将皮肤缝合，完全覆盖整个植入物。在皮肤切口边缘涂抹抗菌药膏，并给予动物抗炎药物。最后，将小鼠从固定架上取下，置于加热灯下，并持续观察动物直至其完全恢复。与雌性成年小鼠配对七天的雄性成年小鼠，其中脑酪氨酸羟化酶阳性黑质致密部（SNC）区域神经元数量比与雄性配对的雄性小鼠多约12%。相比之下，与雄性配对的雌性小鼠的黑质致密部（SNC）TH阳性神经元数量比与雌性配对的雌性小鼠少约12%。在成年雄性小鼠中，经过14天的环境富集配对加超级富集处理后，其黑质致密部（SNC）和腹侧被盖区TH阳性神经元数量也有所增加。在环境富集加超级富集并接受载体灌注的动物中，SNC的TH阳性神经元数量约增加14%。随后，标准饲养条件下注射溶剂的动物与接受环境富集加超级富集饲养并注射 GABAA 受体拮抗剂的动物相比，并未表现出这种增加。在进行环境干预时，重要的是要尽量将对动物的干扰降至最低，例如将噪音保持在最低水平并避免频繁更换笼具。在建立富集环境时，关键是要提供多种类型的筑巢材料，并保持巢穴位置恒定，以最大限度地减少动物的应激反应。观看本视频后，您应能充分理解如何通过调控成年小鼠的生活环境，从而诱导其大脑与行为发生改变。在使用药物时请注意，这些物质可能具有极高危险性，因此在制备渗透泵时务必穿戴防护服。

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