Name: 完整的和更新的轮虫混养法饲养第一移送斑马鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习轮虫混养法饲养斑马鱼幼鱼的技术，利用盐水轮菌促进生长与存活率。该方法显著减少实验所需时间与空间，适用于发育生物学和神经科学研究。

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本方案中为获得代表性结果所生成的鱼类的护理与使用，均严格遵循波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）制定的指南，方案编号 # 14-05-2673R。

1. 轮虫培养
<ol>
	<li>使用100 L培养容器的培养系统基本组成
	<ol>
		<li>收集轮虫培养系统所需的所有组件。轮虫培养系统包括用于培养轮虫的培养容器（CV）；用于维持投喂量轮虫的类似容器（投喂培养容器，FCV）；用于储存藻类饲料混合物（AFM）的圆底孵化瓶（饲料储液罐，FR）；气源（AS），用于向CV、FCV和FR供气增氧；带计量定时器的蠕动泵（PMT），用于控制向CV和FCV输送藻类饲料；以及置于CV内部的绒毛颗粒过滤器（FPF）。 
		注意：完整的耗材和组件清单见于 材料清单.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置
	<ol>
		<li>将CV和FCV置于支架或桌面上，以便通过排水接头将培养物轻松收集到收集容器中（图1使用柔性供气管将空气供应装置（AS）连接至每个培养容器中的刚性管。确保管子足够长，能够将空气输送到培养容器（CV）或浮动培养容器（FCV）的底部。</li>
		<li>使用小容量气管将空气源（AS）连接至一段刚性管，该管延伸至含有AFM的饲养箱（FR）底部。在每根气管上安装一个阀门以调节气流。将饲养箱（FR）通过饲料输送管连接至投喂管理装置（PMT），并将输送管从PMT引出，穿过在CV/FCV侧壁上部钻出的孔洞。 图1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初创企业
	<ol>
		<li>用反渗透水（RO）将培养容器填充至可用体积的90%。若无反渗透水，可使用洁净的去氯市政用水；但应进行生物安全风险评估，以确保水源中不存在潜在的致病生物。注：此类分析可由任何具备资质的水质检测实验室完成。</li>
		<li>向培养容器的水中加入水族盐，使盐度达到15 g/L。调节通入容器的气流，以维持 &#34;微沸&#34;，然后将称量好的盐缓慢加入培养容器中，直至通过曝气完全溶解。继续对水体进行曝气处理，持续时间为 &#62;1 小时，以确保其充分氧合。</li>
		<li>配制藻类饲料混合液。向3 L干净的、去氯的淡水（0 ppm）中加入100 g NaHCO₃。3 以及100 g氨中和剂（羟甲基磺酸钠）。该试剂还可有效中和自来水中残留的氯或消毒培养设备后残留的漂白剂中的氯。必须确保这些化合物完全溶解。然后加入1 L藻类浓缩液（生物量干重约15%）。将饲料混合物加入FR中，并于4 °C保存。</li>
		<li>添加500万至1000万的起始培养物 褶皱臂尾轮虫 将轮虫加入含有充气的15 g/L盐度水的培养容器中。如果轮虫在运输或储存过程中被冷藏，应将其在30分钟或更长时间内逐步适应培养容器中的水温（25 - 27 °C）。</li>
		<li>打开PMT，开始将藻类饲料泵入轮虫培养容器中。利用PMT的定时功能，设定藻类饲料混合物的输送速率，使每百万只轮虫每天输送约1.6 ml藻类饲料混合物。在24小时周期内，以相等时间间隔分多次少量投喂；投喂频率越高，效果越好。</li>
		<li>通过手动开启光电倍增管（PMT）并持续设定时间来校准泵的输送速率（例如， 1 分钟）并在此期间将泵出的藻类收集到量筒或烧杯中。例如，如果 PMT 在 1 分钟内输送了 5 ml 藻液，则给药速率为 5 ml 藻液/分钟。</li>
		<li>通过将轮虫数量（以百万计）乘以1.6 ml，计算所需的每日投喂量。例如，一个轮虫数量为1亿的轮虫培养体系，每天大约需要160 ml的饵料（100 × 1.6 ml）。</li>
		<li>将 PMT 设置为在 24 小时内以固定时间间隔分次投加全天所需的总饲喂量。例如，全天总饲喂量为 160 ml 时，可使用 PMT 以每次 5 ml/min 的泵送速率运行 4 分钟，每 3 小时投加一次，每日共投加 8 次（5 ml/min × 4 min = 20 ml × 8 次 = 160 ml）。</li>
		<li>让培养物生长至达到所需种群数量，通常需要 48 - 72 小时，然后进行收获。在启动培养 24 小时后，将牙线颗粒过滤器添加到培养容器中，并开始常规维护。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维护 
	注意：该培养体系需持续运行，且需要进行日常维护，理想情况下应每天在同一时间按以下顺序操作。
	<ol>
		<li>将清洁的无氯淡水注入FCV，至可用体积的90%，并加入10 g/L的水族盐。确保充分混匀，使所有盐完全溶解。调节通入容器的气流，以维持 &#34;剧烈沸腾&#34;使用折射仪测量盐度，确保盐度为10 g/L。必须达到此目标值，且不得超出。</li>
		<li>在CV中取轮虫样品：确保培养物充分混匀，然后使用移液管或自动移液器从培养物的不同部位分别采集3份2–3 ml的样品。将这些样品合并至一个大小合适的试管或小瓶中例如， 10 ml。</li>
		<li>将1-2 ml混合样品转移至培养皿中，以便在解剖显微镜下观察。检查培养物质量（轮虫的游动行为、是否存在脱落的卵、有无污染的原生动物）。</li>
		<li>向剩余的混合样品中加入 100 µl 50% 碘-碘化钾溶液，使轮虫固定。加入碘-碘化钾溶液后数秒内，可观察到轮虫停止游动。此时可方便地对轮虫进行计数。 
		注意：可使用乙醇、稀释漂白剂或醋替代卢戈氏碘液。醋（每10 ml加2滴）具有无毒、储存过程中不会像漂白剂和碘溶液那样失效、且不会引起轮虫收缩的优点，因此可清晰观察纤毛冠及轮虫的其他形态特征。 &#34;足&#34; 保持伸展状态，动物外观显得更加自然。</li>
		<li>确保样品充分混匀（固定的轮虫会迅速沉降），然后迅速用塑料移液管吸取约 2 ml 的子样品，并将 1 ml 加入 Sedgewick-Rafter 计数板（20 × 50 个 1-mm 方格）中（图2）。使用解剖显微镜或复式显微镜，计数附着在这些轮虫上的完整轮虫个体及卵的总数 （图2）尽可能计数载玻片区域，直至计得约100个轮虫。计算每毫升样品中的轮虫数量，并将结果记录于电子表格或实验记录本中。</li>
		<li>收获CV中约30%体积的轮虫：移除CV的气源和棉线过滤器，缓慢打开CV底部阀门，使水流经53 µm筛网的浮游生物收集器。将通过收集器底部流出的水收集至水桶或排入下水道。控制水流为轻柔至中等流速，避免损伤轮虫。切勿使轮虫在筛网上干燥。</li>
		<li>出于一致性的考虑，建议每天使用固定数量的轮虫来建立FCV。&#160; 因此，根据已知的CV轮虫密度和收获体积，调整FCV的总体积，以达到一致的最终密度（例如，1,500 个轮虫/毫升。&#160;将收集的轮虫加入FCV：使用装有洁净盐水（10–15 g/L）的洗瓶，轻轻将轮虫从收集筛网上转移。将筛网倒置于FCV上方，用温和的盐水流将轮虫冲洗入FCV中。启动PMT，向FCV输送饵料（约每天每百万轮虫1.57 ml）。</li>
		<li>用干净、柔软的尼龙刷或清洁垫彻底刷洗CV内部。</li>
		<li>在5加仑的桶中，通过向定量的洁净反渗透水中加入适量盐，配制15 g/L的新盐水混合液，以补充收获过程中损失的水量。将盐加入桶中的水中，充分搅拌直至完全溶解，然后加入CV系统中。</li>
		<li>使用水槽中的高压喷水冲洗牙线过滤器，直至无残留碎屑，然后将其放回CV。</li>
		<li>根据每日轮虫/毫升的数量，通过调整每次投喂时间来调节输送至CV的藻类流速。使用上述步骤1.3.8中提供的计算方法确定应投喂的适当饵料量。</li>
		<li>约24小时后重复该过程。首先，以与上述相同的方法（步骤1.4.2–1.4.10）收集FCV中剩余的轮虫（即前一天未使用的轮虫）。将其浓缩于2 L新鲜、洁净的去氯水（盐浓度5 g/L）中。这些轮虫可作为备用资源在4 °C下保存，也可用于喂养本实验方案所述之外的后期鱼类幼体。 
		注意：由于CV中的轮虫在未收获的情况下仍可耐受较长时间，本方案允许在正常自动喂养条件下减少培养维护时间，最长可达2 - 3天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 混合培养
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>通过将产卵事件中产出的胚胎倒入茶筛，然后用洗瓶中的无菌鱼水（或任何其他无污染且适当调节的溶液来源；例如，胚胎培养基、E3等）轻轻冲洗，收集斑马鱼胚胎至培养皿中。</li>
		<li>将胚胎在培养皿中于25 - 28 °C条件下孵育，每皿放置40 - 50枚胚胎，持续5天。</li>
		<li>在受精后第5天开始共培养阶段，或当超过90%的孵化幼鱼在水体中活跃上浮游泳时开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种
	<ol>
		<li>直接从FCV取500 ml轮虫培养物加入3.5 L的育苗缸中；加入轮虫培养液可提供藻类饲料，以维持共培养期间轮虫的营养成分。</li>
		<li>将一个培养皿中的幼鱼轻轻倒入育苗缸中，确保无幼鱼残留在皿内。</li>
		<li>从循环系统或专用水源中加入500 ml清洁且调节过的鱼水至缸中，使最终体积达到1 L，最终盐度为5 g/L。 
		注意：此盐度至关重要，因为若盐度&#62;7 g/L，将对斑马鱼幼鱼的存活产生负面影响；而若盐度&#60;2 g/L，则会影响轮虫的存活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共培养阶段 
	注意：共培养阶段应持续至接种后最多4天（总共5天，对应受精后第5至第9天）。
	<ol>
		<li>在此期间每天至少观察一次共培养缸，确保轮虫和鱼类均存在并正常生长。确认轮虫在整个水体中可见，同时鱼类也在水体中清晰可见，并在轮虫群中游动。</li>
		<li>启动通过培养缸的正常水流。在排水口处安装筛网或挡板，防止幼鱼被冲出缸外。 
		注意：此阶段结束时，鱼类体型已足够大，可摄食较大的饵料，如卤虫（Artemia）无节幼体或粒径在75 - 125 µm范围内的加工饲料。 
		注意：通过与步骤1.4.2 - 1.4.5中所述相同的方法对代表性共培养缸中的轮虫进行取样和计数，以测定轮虫种群动态。该操作从共培养阶段开始之日起每日进行一次，直至阶段结束。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ribas, L., Piferrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+a+model+organism%2C+with+emphasis+on+applications+for+finfish+aquaculture+research%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research.</a> Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).</li>
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<li>Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+rearing+first-feeding+larval+zebrafish%3A+polyculture+with+Type+L+saltwater+rotifers+%28Brachionus+plicatilis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis).</a> Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+husbandry+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish husbandry and management.</a> Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).</li>
<li>Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+saltwater+rotifers+%28Brachionus+plicatilis%29+for+rearing+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish.</a> Zebrafish. 9, 140-146 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biology+and+Culture+of+Channel+Catfish%22">Biology and Culture of Channel Catfish</a>. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).</li>
</ol>

E.C. Henry 任职于 Reed Mariculture, Inc.，这是一家向水产养殖和观赏鱼爱好者市场提供轮虫、藻类浓缩物及其他用品的公司。

成功实施轮虫多品种共培养法以喂养早期斑马鱼幼鱼，需要有效完成两项任务的操作方案：建立并维持一个持续的轮虫培养系统以供鱼类摄食，以及在同一水体中将初摄食的斑马鱼幼鱼与轮虫共同培养。
最初由 Lawrence 及其合著者首次描述的用于斑马鱼实验室的连续海水轮虫培养系统14，已在多个方面进行了修改和优化，使其在应用上更加稳定且具有普适性。新方案在设备和方法学方面均进行了改进。
目前，藻类饲料混合物的储存系统采用鲶鱼养殖系统中使用的孵化罐15。将饲料储存在这些圆底罐中有利于充分混合藻类饲料，防止其分层或结块，从而避免输送管道堵塞——这一问题在原始方案中曾频繁出现。同样，使用一体化可编程定时/计量泵减少了组件总数，并简化了对轮虫的定量投喂过程。此外，该装置可在24小时内按小时频率向轮虫投喂饲料，相比次数较少但单次投喂量较大的方式更为理想，因为这种频繁投喂能提高饲料的同化效率。
本方案包含了一种轮虫计数方法，可实现对轮虫培养物投喂量的精细调...

斑马鱼（Danio rerio）是一种重要的模式生物，被广泛应用于越来越多的科学研究领域，包括但不限于发育遗传学、毒理学、行为学、水产养殖、再生生物学以及多种人类疾病的建模1-5。尽管该物种在实验室中相对容易维持，但其养殖过程中仍存在诸多管理难题6。其中最突出的问题是幼体培育，尤其是在鱼苗首次开始摄食、且鳔已充气之后的阶段7。在正常且受控的条件下，这一发育事件通常发生在受精后约5天（dpf），随后的3至5天生长阶段尤为关键7。此阶段最主要的技术难点在于充分满足初孵幼鱼的营养需求——饲料必须大小适宜、易于消化、具有吸引力，并且几乎持续供应，同时又不能在养殖水体中产生过多废物。传统上，这一目标通常通过向养殖缸中的鱼体多次投喂少量饲料并结合常规换水来实现8,9。尽管这些方法在一定程度上有效，但效率较低，需要大量人力投入，且生长率和存活率往往不稳定且有限10。
在自然环境中，斑马鱼幼鱼可能以水体中大量存在的小型浮游动物为食11因此，幼体培养方案中需包含活体饵料，例如 草履虫，轮虫，和 卤虫 通常效率最高72010年，Best及其同事证明，可以在静置的半咸水中饲养幼年斑马鱼，并在开始外源性摄食的前5天内同时提供海水轮虫。12该方法利用轮虫培养物天然的高生产力，提供充足且营养丰富的饵料，同时不会污染水体，因而能在投入较少人力的情况下，实现幼体的高生长率和高存活率。12,13近年来，全球越来越多的实验室采用了该方案的各种改良版本，目前已有许多实验室以连续培养的方式培育轮虫，以支持育苗系统。14.
近年来，轮虫/斑马鱼多营养级共养体系及轮虫生产方法不断优化，日趋标准化并更易于规模化。本文提供了以下两部分内容的逐步操作指南：1）轮虫的持续稳定生产；2）建立轮虫/斑马鱼多营养级共养系统，以支持斑马鱼在开始外源摄食的前5天内实现良好生长。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;轮虫培养基础设施&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L 培养容器</td><td>Aquaneering</td><td>定制</td><td>聚碳酸酯养殖容器，锥形底部，带排水阀</td></tr><tr><td>5 加仑培养桶套装</td><td>里德海洋养殖</td><td>CCS 启动套装</td><td>小型设施用小体积培养容器</td></tr><tr><td>硬质透明管 1/2&quot; O.D., 36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>用于供气的硬质透明管</td></tr><tr><td>网状管</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>牙线过滤器的网状管支撑架</td></tr><tr><td>轮虫棉絮</td><td>里德海洋养殖</td><td>轮虫棉絮 12&amp;rdquo; × 42&amp;rdquo;</td><td>颗粒废物收集器</td></tr><tr><td>蠕动计量定时泵，5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&amp;nbsp;</td><td>用于向轮虫投喂饲料的带定时器计量泵</td></tr><tr><td>蠕动计量定时泵，1-100 mL/小时（用于小规模培养）</td><td>Coral Vue</td><td>SKU: IC-LQD-DSR</td><td>用于向轮虫投喂饲料的带定时器计量泵</td></tr><tr><td>硅胶管&amp;nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>用于将藻类输送至轮虫培养容器的管路</td></tr><tr><td>刚性透明管 &quot; O.D.,36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>用于向藻类糊输送空气的硬质透明管</td></tr><tr><td>刚性透明管外径，36&amp;rdquo;</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>用于藻类输送的硬质透明管</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;轮虫&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>活体褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）L型</td><td>里德海洋养殖</td><td>L型 500万</td><td>用于系统启动的轮虫种群培养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;轮虫饲料&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>羟甲基磺酸钠</td><td>里德海洋养殖</td><td>ClorAm-X&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1磅装容器</td><td>用于藻类饲料混合物的氨还原剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B</td><td>用于藻类饲料混合物的pH缓冲液</td></tr><tr><td>微藻浓缩液</td><td>里德海洋养殖</td><td>Rotigrow Plus&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt; 1 升袋装</td><td>营养优化的轮虫饲料</td></tr><tr><td>RG完全培养基</td><td>里德海洋养殖</td><td>RG Complete 6盎司瓶装</td><td>一种基于微藻的集成式饲料，适用于小规模培养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;水体准备&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Reef Crystals 海水盐</td><td>那条鱼的地方</td><td>198210</td><td>用于配制培养水的盐（注意：此物品仅为示例，可使用任何无污染物的盐类配方）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>折射仪</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>测量盐度</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;轮虫培养设备&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浮游生物收集器 12&quot; Dia，53 微米</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>用于收集轮虫的网筛</td></tr><tr><td>海绵擦洗垫</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SCR-58</td><td>用于清洁培养容器内部的 scrub 垫</td></tr><tr><td>刷子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水桶</td><td>格雷格供应公司&amp;nbsp;</td><td>43Y530</td><td>用于配制培养水的量筒桶</td></tr><tr><td>孵化罐</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>藻类饲料混合物的储存</td></tr><tr><td>Lugol&amp;rsquo;s 溶液，稀释</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>用于固定活体轮虫以进行计数的试剂</td></tr><tr><td>塞奇威克-拉夫特浮游生物计数板（带网格）&amp;nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>计数轮虫</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>茶漏</td><td>厨房用品</td><td>971972</td><td>用于收集斑马鱼产卵后的胚胎</td></tr></tbody></table>

用于培育初孵斑马鱼的完整且更新的“轮虫共培养法”

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

斑马鱼（Danio rerio）是多个科学领域中日益重要的模式生物。在实验室条件下养殖该物种时，最具挑战性的技术环节之一是将开始摄食的仔鱼高效培育至幼鱼阶段，同时实现较高的生长率和存活率。这一发育阶段的核心管理难题在于：如何在几乎持续不断地向鱼类提供高营养饵料的同时，不损害水质。由于斑马鱼仔鱼在自然环境中已适应于摄食水体中的小型动物浮游生物，因此活体饵料（如臂尾轮虫、Artemia 和 Paramecium）被广泛认为是首选饲料，至少在鱼类达到幼鱼阶段并能够有效摄食人工加工饲料之前均是如此。本实验方案描述了一种将新孵化的斑马鱼仔鱼与海水轮虫（Brachionus plicatilis）在同一系统中共同培养的方法。这种共培养模式为鱼类提供了“按需供应”的营养丰富的活饵来源，且不会产生足以限制其生长表现的化学废物。尤为重要的是，该系统充分利用了轮虫自身天然的高繁殖能力以及鱼类的摄食行为偏好，因而日常维护所需的人工投入较低。以下方案详细阐述了一种经过优化的、逐步操作的流程，其中包含轮虫的生产培养（可根据需求进行规模放大），用于斑马鱼仔鱼与轮虫的共培养体系，以促进外源性摄食开始后前5天内的最佳生长表现。

本文所述的轮虫连续培养系统具有动态性，若每日投喂和采收速率存在波动，轮虫数量随时间发生小幅波动属于正常现象。在波士顿儿童医院水产养殖设施中，按照上述方法维持的一个活跃培养体系中的轮虫种群数量被连续监测了30天（图3）。在此期间，培养物的平均密度为932个轮虫/mL，最高密度为1,330个轮虫/mL，最低密度为510个轮虫/mL。这代表了按照本方案进行培养的轮虫培养体系的典型表现。
多物种共培养水箱中轮虫种群的动态变化如图4所示。在一个3.5 L的鱼缸中接种了500 ml来自FCV的轮虫培养液、500 ml灭菌鱼水以及40条5日龄的野生型（图宾根品系）幼鱼，以展示轮虫与斑马鱼在典型的多物种共培养水箱中的表现。在共培养的第二天，轮虫种群密度达到峰值，为747个轮虫/mL（图4）。在为期5天的共培养期间，共培养水箱中的轮虫密度逐渐下降，至第5天时降至最低值4...

幼年斑马鱼适应于以浮游动物为食。在实验室中，可以利用这一自然特性，将初次摄食的鱼苗与活的海水轮虫在同一系统中共同培养。这种“多物种共养”策略可促进鱼苗的高生长率和高存活率，同时将人工投入和对幼鱼的干扰降至最低。

斑马鱼（Danio rerio）是科学多个领域中日益重要的模式生物。其中最具挑战性的技术环节之一是……

轮虫多级培养法的总体目标是利用海水轮虫的自然生产力和生物学特性，创造一个促进初孵斑马鱼幼鱼快速生长和最大限度存活的环境。该技术的主要优势在于，它显著减少了成功培育大量斑马鱼幼鱼所需的时间和空间，从而满足科研实验的需求。开始轮虫培养的维护时，先用洁净、去氯的淡水将投喂培养容器（FCV）装至90%容量，并加入每升10克的水族盐。确保水充分混合，且所有盐完全溶解。然后调节通入容器的气流，以维持持续沸腾状态。使用折射仪测量液体的盐度。接下来，从培养容器（CV）中取样轮虫。确保培养物充分混匀。然后，使用移液管从培养物的不同部位分别取三份2至3毫升的样品，并将这些样品汇集到一个离心管中。取1至2毫升混合后的样品转移至培养皿中。在解剖显微镜下观察样品，并检查培养物的质量。向样品中加入 100 微升 50% 的卢戈氏碘液，以固定轮虫并进行计数。立即用塑料移液管取 2 毫升子样品，并将 1 毫升转移至塞奇威克-拉夫特计数板中。使用解剖显微镜，计数载玻片上足够大的区域，直至统计到100个完整的轮虫以及附着在轮虫上的卵的总数。然后计算每毫升轮虫的数量，以供后续使用。通过移除气源和毛刷过滤器，开始收获操作。缓慢打开连续采样器（CV）底部的阀门，使水流轻柔地流入带有53微米筛网的浮游生物采集器中。将经过过滤后从采集器底部流出的水收集到水桶中或排入下水道。接着，用每升含10至15克清洁海水的溶液将瓶子装满。将筛网翻转至FCV上方，用轻柔的盐水流将轮虫冲洗到FCV中。启动可编程计量定时器（PMT），向FCV输送饲料。随后，用干净的清洁垫彻底刷洗CV内壁。用一个五加仑的桶配制新的15克/升混合液，以补充因收获而损失的水量。剧烈搅拌溶液，直至混合物完全溶解。然后，将该溶液加入CV中。接下来，用高压喷雾冲洗牙线滤器。当牙线滤器无碎屑残留时，将其放回 CV 中。通过调整每次加样时间来调节输送至 CV 的藻类投喂速率。24 小时后重复该过程，开始收获 FCV 中剩余的轮虫。用每升含 5 克盐的两升新鲜、洁净、除氯的水浓缩轮虫。这些胚胎可作为备用供应在4°C下保存，或用于喂养本方案所述阶段之后的鱼类。通过将产卵事件中获得的胚胎倒入茶筛中来收集斑马鱼胚胎，然后用洗瓶中的无菌鱼水轻轻冲洗至培养皿中。收集完所有胚胎后，进行孵化。当超过90%的孵化幼体在水体中活跃上浮时，开始共培养阶段。从FCV直接取500毫升轮虫培养液加入3.5升的育苗池中。接下来，将幼虫从一个培养皿中轻轻倒入育苗池中，确保培养皿中无幼虫残留。从专用水源向池中加入500毫升清洁的、经过处理的鱼用水，使最终体积达到1升，并使最终盐度为5克/升。每天至少观察一次共培养水箱，以确保轮虫和鱼类均存在且正常生长。检查轮虫是否在水体中均匀分布并可见。确保鱼类也在水体中可见，并在轮虫群中游动。每天必须评估每个水箱的状况，以确保轮虫存活且游动正常，并为所有鱼苗提供充足的食物。在确认轮虫和鱼苗正常生长后，开始向水箱中通入正常的水流。最后，在排水口处放置筛网，以防止鱼苗随水流排出水箱。对轮虫培养物的典型生长情况进行了为期30天的监测，培养物平均密度达到每毫升932个轮虫，最高密度为每毫升1,330个轮虫。在与斑马鱼进行共培养的培养罐中，轮虫种群的平均密度为每毫升589.4个轮虫。每毫升 481 个轮虫的最低值比此前发表的研究结果高出 10 倍。在为期五天的实验期间，斑马鱼每天均表现出稳定的生长，平均总长度从 3.9 毫米增长至 5.4 毫米。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养轮虫，以用于满足初孵斑马鱼营养需求的多物种共养系统。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

完整的和更新的“轮虫混养法”饲养第一移送斑马鱼

本方案概述了斑马鱼养殖过程中为维持最佳条件所需的常规维护与护理措施。视频演示了系统维护、日常饲养、喂食、繁殖以及斑马鱼幼体培育的操作流程。...

斑马鱼（Danio rerio）实验室的常规护理与维护：入门指南

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低成本且易于建造的斑马鱼养殖设施的构建

斑马鱼, 养殖设施, 实验室建设, 水生模式生物, 动物房设计, 成本效益, 实验动物管理, 水循环系统, 实验室基础设施

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

使用斑马鱼进行DNA复制时间分析 在体 内 模型系统

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。...

斑马鱼原代细胞的培养与转染

本实验方案的目的是以高通量方式测量荧光标记食物通过斑马鱼幼体肠道的转运时间。...

利用幼年斑马鱼进行肠道通过时间的高通量测量

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

本方案概述了获取无菌（GF）鱼类胚胎并将其从幼虫期饲养至幼鱼阶段的主要步骤，包括取样及检测其无菌状态。在研究微生物对宿主健康作用的过程中，利用无菌模型进行感染实验具有重要意义。...

从幼虫到幼鱼阶段无菌斑马鱼模型的建立、维持与鉴定

本文介绍一种新型、易于构建且低成本的循环水斑马鱼养殖方案。...

一种定制的循环式斑马鱼养殖系统

研究癌前细胞进展的早期事件及其与先天免疫细胞的相互作用，对于理解与治疗癌症至关重要。本文描述了一种条件性诱导上皮细胞转化的方法，并对表达HRASG12V的斑马鱼幼鱼皮肤细胞与先天免疫细胞之间的相互作用进行后续活体成像。...

利用可诱导的Gal4/UAS表达系统对幼年斑马鱼皮肤中先天免疫细胞与癌前细胞相互作用进行活体成像

学习轮虫混养法饲养斑马鱼幼鱼的技术，利用盐水轮菌促进生长与存活率。该方法显著减少实验所需时间与空间，适用于发育生物学和神经科学研究。

用于培育初孵斑马鱼的完整且更新的“轮虫共培养法”

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