“剪切环”的组装与应用：一种用于轨道式、单向周期性流体流动和剪切应力研究的新型内皮细胞模型

该模型的总体目标是建立一种简单且经济的方法，用于内皮细胞的体外周期性流体流动和剪切应力研究。该方法有助于回答内皮细胞生理学领域中的关键问题，例如，周期性剪切力如何影响内皮细胞的形态、结构和功能。

该技术的主要优势在于使用了一种结构简单的组织培养装置，可提供相对较大的表面积，用于评估细胞反应。为演示该操作步骤的是我实验室的医学生Luke White先生。首先使用演示软件创建一个剪切环构建模板，其外缘轮廓为150毫米，内径为100毫米，并将该内径置于150毫米圆的中心位置。

将模板打印在一张A4白色纸张上。在通风良好的通风橱内操作，并戴上手套，用移液器将10毫米甲基氯化物加入150毫米玻璃培养皿中。必须使用玻璃培养皿，因为甲基氯化物会溶解大多数塑料。

将一个150毫米的塑料培养皿与外部剪切模板对齐。使用旋转工具在100毫米培养皿的中心钻一个3毫米的孔。清除钻孔过程中产生的任何塑料碎屑。

用戴着手套的手握住100毫米培养皿，将其倒置，并将皿的上边缘浸入亚甲基氯溶液中约三秒钟。让多余的亚甲基氯从100毫米培养皿上滴落，然后迅速将湿润的皿边缘朝下转移至150毫米培养皿的中央，仔细将其与标记好的模板对齐。

轻轻顺时针和逆时针旋转100毫米培养皿数次，以确保其与150毫米培养皿之间良好粘附。待二氯甲烷完全干燥后，将新粘合的培养皿翻转，仔细检查接触部位。若密封不严密，用移液管通过3毫米孔注入0.5毫升二氯甲烷。

拿起培养皿并轻轻旋转，使二氯甲烷接触到边缘。确保两个培养皿之间已形成紧密密封后，用一条3毫米宽的硅橡胶密封剂封住100毫米培养皿上的孔。使用装有平头切割头的旋转工具，切掉15毫米锥形聚苯乙烯组织培养管顶部3厘米的部分，保留至少1厘米的管体在瓶盖下方。

使用切割头的平面一侧打磨切口管的边缘，直至其光滑平整。清除研磨过程中产生的任何塑料碎屑。用记号笔将15毫升离心管的切口轮廓描画在150毫米培养皿盖上，距离培养皿边缘约0.5厘米。

在画好的圆内钻孔，距离圆的边缘约一到两毫米处留出边缘。将截断的锥形管管口置于钻好的孔上。用移液枪向锥形管截断的边缘处加入约四分之一毫升（即 250 µL）的二氯甲烷，使锥形管与 150 毫米的盖子粘合。

最后，将150毫米的盖子盖在150毫米的培养皿上，并在顶部培养皿内缘周围涂上一圈约1毫米厚的硅橡胶密封剂以完成密封。图中显示了组装好的密封环示意图，其中蓝色区域代表接种的内皮细胞区域。

外侧和内侧的红色箭头表示将剪切环放置在轨道摇床时，剪切环及其内部培养基的轨道运动方向。通过15毫升锥形管接口，用移液器向新制备的剪切环中加入约10毫米的PBS，以备灭菌。轻轻旋转，以去除剪切环内部的任何残留物。

使用巴斯德吸管和真空抽吸装置移除 PBS。重复 PBS 洗涤步骤，直至所有碎片被清除。为对剪切环进行灭菌，将采用 70% 乙醇冲洗与紫外照射相结合的方法。

拧开带通气孔的瓶盖，通过加样口用移液器加入约10毫升70%乙醇，然后重新拧紧瓶盖。多次旋转并翻转密封环，确保密封环内部被充分清洗。在组织培养超净台内，抽吸除去多余的70%乙醇。

使用喷雾瓶将70%乙醇充分喷洒在接入端口和盖子上。随后将剪切环和盖子置于超净台内的紫外线下照射，直至完全干燥。待剪切环干燥后，将盖子重新拧紧。

将灭菌后的剪切环在室温下保存，直至用于细胞培养包被。进行剪切应力实验前，首先按照标准细胞培养方案，将内皮细胞接种于灭菌的剪切环中。在开始流动实验前，需使细胞培养至融合状态。

当细胞达到汇合状态时，将实验用剪切环放置于培养箱底部架子上的轨道摇床中，以尽量减少架子应力和振动。将静态对照组剪切环置于同一培养箱内。将剪切环在摇床上持续振荡至所需的剪切应力作用时间。

在细胞层暴露于剪切力达到所需时间后，从培养箱中取出剪切环。取下剪切环盖，收集细胞和/或培养基，用于后续所需的终点分析。请注意，打开剪切环后，研究人员可采用多种方法分别收集细胞和培养基用于分析。

图中显示了人脑微血管内皮细胞系 CMEC D3 单层细胞在剪切环中经 48 小时周期性流体剪切或静态培养后的典型结果。观察发现，细胞排列方向并不总是与箭头所示的流动方向平行。部分对周期性剪切的反应也在大鼠视网膜微血管内皮细胞单层中得到展示。在剪切环中经 72 小时周期性流体剪切后，血小板-内皮细胞黏附分子相对于 β-actin 上样对照显著减少。

如果操作得当，一旦掌握该技术，可在约三小时内完成多个剪切环的制备。在进行此操作时，重要的是要仔细对准内皿与外皿，并确保二者之间形成紧密的密封。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建和使用剪切环，作为一种简单的方法在体外对内皮细胞施加周期性流体流动和剪切应力。请务必注意，二氯甲烷具有潜在危险性，在操作涉及该试剂的步骤时，必须采取预防措施，例如在通风橱中进行操作。