使用常规紫外激光共聚焦显微镜诱导细胞应激与死亡

该细胞消融方法的总体目标是在细胞培养或活体动物中选择性地损伤或杀死单个细胞。该方法使研究人员能够研究单个死亡细胞的命运，以及小胶质细胞和星形胶质细胞等细胞对消融位点周围环境的反应。该技术的主要优势在于能够精确定位单个细胞，且仅需配备405纳米激光器的常规共聚焦显微镜即可实现。

我们采用斑马鱼作为研究运动神经元疾病或额颞叶痴呆等神经退行性疾病的模型系统。通过观察运动神经元的死亡过程及其后续影响，能够更好地理解疾病中涉及的动态过程。我们以剂量依赖的方式诱导细胞应激，从而对细胞间的相互作用进行详细表征。

例如，神经元死亡后的小胶质细胞清除过程。尽管该方法可为活体生物的疾病机制提供见解，但也可类似地应用于培养的分离细胞。根据文本方案建立用于交配的雄性和雌性转基因品系后，使用塑料茶筛过滤鱼缸水，以在成功产卵后收集胚胎。

然后用卵水冲洗卵，并将卵转移至培养皿中的卵水中。在光学显微镜下观察胚胎，以确定是否受精。随后将受精卵在28摄氏度条件下进行孵育。

当胚胎发育至受精后2至5天（DPF）时，将其置于荧光体视显微镜下，筛选出具有适当荧光蛋白表达的胚胎。随后将荧光标记清晰的鱼分离至含有卵水的新培养皿中，以备后续包埋。进行斑马鱼琼脂糖包埋前，通过向含有卵水的培养皿中逐滴加入4克/升的MS 222，配制麻醉溶液。

配制低熔点琼脂糖和卵水的储备液，并分装至1.5毫升微量离心管中。取一份分装样品置于38至40摄氏度的加热金属块中，使其温度平衡。对于超过四小时的成像实验，用移液器将约300微升琼脂糖沿玻璃底培养皿内壁呈环形加入，制备成中心带有小开口的环形（类似甜甜圈形状）结构。

为了将斑马鱼幼鱼包埋在琼脂糖中用于显微镜观察，首先根据文本方案麻醉幼鱼，然后使用可调移液器吸取一条幼鱼，并让其沉降至吸头底部。将幼鱼以最小体积的液体滴入预热的琼脂糖中。接着用移液器吸取含有幼鱼的琼脂糖，并迅速将其注入预先准备好的玻璃底35毫米培养皿中。

在解剖显微镜下，使用普通的画笔将动物或多个动物在琼脂糖中侧向摆放，使其身体和尾部保持平坦。让包埋的鱼类静置10至15分钟，直至琼脂糖完全凝固。然后，加入约2毫升含三卡因的卵水，小心地补满35毫米的培养皿。

将含有固定幼虫的培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，使用明场照明和40倍放大倍数，对准动物脊髓的背侧。切换至适当的荧光设置，观察目标结构，以确认所有成像参数均符合后续消融实验的要求。为确定紫外激光消融所需结构的厚度，使用Z轴驱动功能，通过手动上下调节焦距，验证目标结构的顶部和底部边界。

手动记录将要消融的Z平面，例如细胞的中心。要进行激光消融，请点击软件菜单顶部的下拉菜单，启动FRAP向导。

在新窗口中，通过选择格式、扫描速度和平均次数来确定消融操作的图像参数。如果尚未选择消融的Z平面，请按下“Live”按钮并调节焦距，使待消融的荧光结构或目标Z平面清晰对焦。设置好基本图像参数后，进入“Bleach”步骤以控制具体的消融组件。

然后通过激活 405 纳米激光器来启动漂白程序。接下来，使用“放大”选项缩小扫描范围，从而提高所选 ROI 的漂白强度，并最大化驻留时间。在图像采集窗口中使用任意绘图工具选择一个或多个 ROI 进行消融。

例如，使用约四到八微米的圆形绘制工具靶向轴突起始段。确定 ROI 后，选择“时间过程”按钮，并确认 ROI 将被扫描和消融的循环次数。根据需要选择光漂白前和光漂白后的帧，以便在光漂白过程之前和之后立即查看整个图像的概览。

这些设置使研究人员能够进行多层面的优化。通过调节激光功率、扫描速度、线平均、感兴趣区域大小和重复次数，该技术提供了高度的灵活性，可对单个细胞施加应力或诱导其死亡。在确定所有必要的消融参数后，点击“运行实验”并监测消融效率。

有关更多细节，请参阅文本方案。在本实验中，对转基因斑马鱼脊髓中表达GFP的运动神经元进行了紫外激光消融。由运动神经元启动子（如3 MINX one、IO one或MET）驱动的GFP表达，可实现对细胞体、主轴突以及延伸至肌肉的周围分支的高分辨率成像。

当消融后荧光立即消失且永不恢复时，表明脊髓中神经元的成功消融。该方法的特异性已在此得到证实：通过使用光转化荧光蛋白 Kaede，单个靶向神经元在紫外光照射后其发射光从绿色转变为红色。为以不同强度靶向细胞，可通过调节激光功率、扫描速度、线平均次数、待消融 ROI 的大小以及重复次数，实现多层级的精细调控。

如图所示，使用较低紫外激光强度在胞体处消融后，具有长轴突投射的运动神经元表现出特征性的出泡现象，该现象随时间从胞体沿轴突持续延伸。在进行此操作时，需注意每台共聚焦显微镜系统的配置均具有独特性，各仪器的激光输出功率具有特异性且可能存在差异。在完成操作后，可在被消融的神经元中观察到典型的凋亡性细胞死亡特征。

可以重复检测到凋亡标志物（如 XN 5）或形态学变化（如胞体退变或外部出泡）。还可进行额外测试，以回答更多问题，例如脊髓中单个或多个神经元消融如何影响游泳表现。通过杂交不同的转基因斑马鱼品系，研究人员可以探究其他细胞对激光诱导细胞破坏的反应。

这些方法为在体内研究肌萎缩侧索硬化症（MND）等疾病的精确分子机制提供了独特的实验平台。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备斑马鱼以进行共聚焦显微镜观察，以及如何执行单细胞紫外激光消融操作。