Name: 触发细胞应激和死亡使用传统的紫外线激光共聚焦显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习使用405纳米紫外激光共聚焦显微镜对斑马鱼单个细胞进行精准消融的技术，研究神经元死亡后小胶质细胞的清除反应及神经退行性疾病的动态机制。

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本工作由澳大利亚运动神经元病研究所和治愈运动神经元病基金会 [GIA 1638]、斯诺基金会以及麦考瑞大学 [MQRDG 9201401462] 提供资助。成像实验在麦考瑞大学生物医学科学系的显微成像中心完成。谨向运动神经元病研究中心其他成员致谢，感谢他们对本方法及斑马鱼品系开发所做出的贡献。

注意：动物实验的设计、实施和报告必须遵循现行指南15。此类工作必须事先获得当地动物福利机构的批准（在本例中为麦考瑞大学动物伦理委员会）。
1. 准备受精卵斑马鱼以进行固定和紫外细胞消融
<ol>
	<li>生成斑马鱼（Danio rerio) 表达荧光蛋白。
	<ol>
		<li>为了在斑马鱼中表达目的荧光蛋白，需将质粒注射到斑马鱼卵的单细胞期（具体方法见其他文献）16）或使用荧光转基因品系。为标记多种细胞类型，可通过杂交与研究问题相关的已建立的转基因品系，构建复合转基因斑马鱼品系。在傍晚时将一条雄性斑马鱼和一条雌性斑马鱼分别置于假底配对交配缸的两侧，次日清晨光照开始时移除隔板（具体操作参见其他文献）。17将斑马鱼置于28 °C条件下培养，并根据 established protocols 进行操作17,18.</li>
		<li>通过塑料茶漏筛滤含有胚胎的养殖水，收集成功产卵后的胚胎。用系统水冲洗卵子，然后将其转移至培养皿中的卵水内。</li>
		<li>在光学显微镜下观察以确定是否受精。将已受精的卵置于培养皿中，并于28 °C恒温培养箱中保存。18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：通过显微注射标记特定细胞群体。 
	注意：这是一种替代方法，可在无需建立稳定转基因品系的情况下实现蛋白质的表达与可视化。当目标蛋白具有毒性，从而阻碍稳定转基因品系的构建时，该方法尤为有利。
	<ol>
		<li>将质粒构建体注射至斑马鱼胚胎的单细胞期，具体操作如其他文献所述19,20,21. 
		注意：该方法会导致目的蛋白的嵌合表达。目的蛋白由选定的启动子驱动表达（例如，islet122, -3mnx123,24，met25，或 mpeg126两侧带有 Tol2 反向重复序列20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将鱼饲养至所需大小。
	<ol>
		<li>将鱼饲养至受精后3至5天，置于荧光体视显微镜下观察。筛选具有适当荧光蛋白表达的个体，挑选荧光标记明亮的鱼。将符合要求的幼鱼转移至另一培养皿中，用卵水保存，以备后续包埋（置于28 °C培养箱中储存）。 
		可选：可在受精后24小时（hpf）将胚胎置于0.2 mM 1-苯基-2-硫脲（PTU）林格溶液中，以抑制色素形成。使用PTU时需格外小心，因其具有毒性，可能产生不良的生理、遗传或形态学影响。</li>
		<li>对于处于早期发育阶段的研究（&#60; 2 dpf时，使用尖头镊子手动去除胚胎的卵膜。对于大量胚胎，可通过在卵水中加入蛋白酶（2 mg/mL）并在28 °C下孵育10分钟，以酶法去除卵膜。</li>
		<li>定期将胚胎通过塑料巴斯德吸管，以促进去绒毛膜。当大多数胚胎已从绒毛膜中脱出后，用卵水多次洗涤以终止该过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于斑马鱼包埋的琼脂糖溶液。
	<ol>
		<li>通过将4 g/L MS222（三卡因储备液，pH 7.0）逐滴加入含有卵水的培养皿中，配制麻醉溶液。推荐起始剂量为50 mg/L（图1A).</li>
		<li>在卵水中配制低熔点琼脂糖（0.8 - 1.5%）储备液，并分装至1.5 mL微量离心管中。取一份分装液置于预热的加热金属块（38 - 40 °C）中，使其平衡至设定温度（约30 min）。 图1B).</li>
		<li>可选：对于长期成像（&#62; 4 h），在35 mm玻璃底培养皿内制备一小圈琼脂糖，并使其凝固（补充图1). 
		注意：此额外步骤可有效避免在较长时间内整个琼脂糖液滴与斑马鱼发生移动。
		<ol>
			<li>为此，将约 300 µL 琼脂糖置于玻璃底培养皿的内圈，制备成中间带有小开口的环形（类似甜甜圈形状），以便放置斑马鱼（步骤 1.5.3； 补充图1).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将斑马鱼固定在琼脂糖中以进行显微镜观察。
	<ol>
		<li>选择1至3条预筛选的鱼进行消融，并用移液管将鱼苗转移至含有麻醉液的培养皿中以进行麻醉（步骤1.4.1）； 图1C；约5分钟。 
		注意：当鱼类表现出鳃盖运动微弱、心率降低，且不再出现触尾逃避反应（TEER；即用刷子轻触其尾部后不再游走）时，表明已进入麻醉状态。为确保对鱼类的伦理对待，并防止其在转移至琼脂糖或暴露于荧光光照时发生抽搐，需确认其已达到适当的麻醉深度。</li>
		<li>在确认麻醉成功后，使用可调式移液器（配以剪断的200 µL吸头，设定体积约为30 µL）吸取一条幼虫，使其沉降至吸头底部。通过将含有幼虫的液滴释放至预热的琼脂糖中（步骤1.4.2），转移幼虫至琼脂糖内（尽量减少随幼虫进入琼脂糖的卵水体积）； 图1D).</li>
		<li>吸取周围带有琼脂糖的鱼，迅速将其转移到预先准备好的35 mm玻璃底培养皿中。</li>
		<li>使用解剖显微镜和标准画笔（长柄平头刷，1号）将动物置于琼脂糖侧面（头部朝左），使其身体和尾部保持平直图1E若同时处理多条鱼，应将所有鱼在培养皿中排列整齐，以便后续使用共聚焦显微镜时能够快速定位。 
		注意：迅速完成定位和对齐操作（该步骤可能需要一些练习，因为琼脂糖在接触较低温度后会立即开始凝固）。</li>
		<li>将琼脂糖包埋的鱼放置10 - 15分钟，直至琼脂糖完全凝固。小心向35 mm培养皿中补充约2 mL含有三卡因的卵水图1F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 设置共聚焦显微镜和成像参数
<ol>
	<li>将含有幼虫的培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，使用明场对准动物脊髓的背侧。在适当的放大倍数（40倍）和荧光设置下观察样本，以观察目标结构例如， 标记神经元的荧光强度或小胶质细胞的运动）以确认所有成像参数均符合后续消融实验的要求（图2我们通常使用40倍物镜进行延时研究。</li>
	<li>可选：若需进行持续数小时的延时研究，建议在消融前记录一个或几个时间点，以确定细胞及其环境未受干扰时的生理反应例如， 小胶质细胞运动以建立基线速度和迁移率。</li>
	<li>确定用于紫外激光消融的目标结构的厚度。
	<ol>
		<li>使用 z 轴驱动器，确认目标结构的顶部和底部位置例如， 通过手动上下调节焦距来定位细胞胞体（the cell soma）。记录将要消融的z平面例如， 细胞的中心 
		注意：根据经验，该方法在靶向脊髓神经元时效果最佳，这些神经元应具有明亮的标记（高信噪比，便于消融后进行活体延时成像观察）； 例如， 图4并通过消融细胞胞体的中部来实现。细胞核荧光有助于确保靶向准确和消融效率高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 对斑马鱼脊髓中的单个细胞进行靶向激光消融
注意：本消融与可视化方法使用了共聚焦显微镜（Leica SP5）。利用405 nm激光二极管进行细胞特异性消融的操作步骤，依据软件（Leica Application Suite，v2.7.3.9723）进行详细设定。然而，任何配备405 nm激光器以及FRAP（光漂白后荧光恢复）或漂白模块的传统共聚焦显微镜均可实现相同的细胞操作，但具体设置、参数和名称可能略有不同。
<ol>
	<li>通过点击软件菜单顶部的下拉菜单来启动 FRAP 向导图 3A, 1 和 2）。观察一个包含不同步骤的新窗口，该窗口可用于设置激光消融的具体参数（图3B, 3).</li>
	<li>通过选择格式、扫描速度来确定消融方法的图像参数图3B, 4）以及平均化（图3B, 5图像分辨率为 1,024 × 1,024，扫描速度为 400 Hz，线平均数为 4 时最为适用。 
	注意：通常无需更改光谱检测参数（如激发或发射参数），因为这些参数已在之前的采集过程中确定。
	<ol>
		<li>如果尚未选择消融的 z 平面（如步骤 2.4 所述），请按下 &#34;活体&#34; 按下按钮，并调节焦距直至待消融的荧光结构或目标z平面清晰对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置完常规图像参数后，访问 &#34;漂白剂&#34; 步骤 (图3C, 6）以控制特定的消融组件。 
	注意：激光强度的组合（图3C, 8），扫描速度，以及在步骤 3.2 中设定的平均次数（图3B, 4 和 5)，以及将在步骤 3.5 中设置的重复次数（图3E, 12），将决定紫外激光在感兴趣区域（ROI）的总体停留时间，从而影响漂白效率。
	<ol>
		<li>启动405 nm激光，用于漂白程序（图3C, 8). 
		注意：在我们的实验设置中，上述参数下使用405 nm激光器时，激光强度在60%–80%之间可获得最佳效果。需注意，该激光功率输出与仪器相关，不同共聚焦系统之间的数值会有所差异。</li>
		<li>使用 &#34;放大&#34; 选项 (图3C, 7）通过减小扫描范围以增加驻留时间，从而最大化所选 ROI 的漂白强度。或者，使用 &#34;漂白点&#34; 此过程可选用的软件选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个或多个感兴趣区域（ROI）图3D, 10) 在图像采集窗口中使用任意绘图工具进行消融图3D, 9使用圆形绘制工具，以约 4 - 8 µm 的直径靶向轴突起始段。 
	注意：消融区域可根据应用需求从单个像素调整至更大范围。</li>
	<li>在确定感兴趣区域（ROI）后，选择 &#34;时间过程&#34; 按钮（图 3E, 11）并确认将对 ROI 进行扫描/消融的循环次数（图3E, 12）。选择 &#34;预漂白&#34; 和 &#34;漂白后&#34; 根据需要设置帧数，以便在漂白过程之前和之后立即概览整个图像。</li>
	<li>在确定所有必要的消融参数后，按下 &#34;运行实验&#34; (图3E, 13）并监测消融效率。 
	注意：在我们的FRAP实验设置中，将在FRAP循环前后各采集一张图像，使用适当的激光激发例如， 488 nm 激发用于表达 EGFP 的细胞）。这些消融前和消融后的图像可快速判断感兴趣区域（ROI）的漂白效果以及所选消融参数的有效性。</li>
	<li>通过调节激光强度重复该过程（图3C, 8），扫描速度与平均次数（图3B, 4 和 5）以及重复（图3E, 12若在完成FRAP循环后，所选ROI仍显示高荧光强度，则需如此处理。</li>
</ol>
4. 执行后续操作，包括斑马鱼的&#34;抢救&#34;或处理
<ol>
	<li>若实验为终点实验，使用过量的三卡因对动物实施安乐死。移除卵水，并替换为麻醉剂储存溶液，作用10分钟。为确认动物已死亡，需在显微镜下检查心脏是否停止跳动。</li>
	<li>可选步骤：若实验非终点实验，使用精细镊子和毛刷小心将鱼从琼脂糖中取出。将鱼放入新鲜的卵水中，并在观察下恢复15分钟。若其恢复正常游动行为，则将鱼放回培养箱中。</li>
	<li>按照机构批准的转基因生物废弃物处理流程处置转基因动物。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

激光消融方法
激光辅助消融技术能够精确定位单个或少量细胞。将该技术与高分辨率显微镜及斑马鱼等动物模型中的遗传操作相结合，可使研究人员系统地研究单个细胞的命运及其在损伤后的相互作用。
本文所述的紫外（405 nm）激光消融方案概述了如何以剂量依赖的方式选择性地对单个细胞施加应激或杀死，同时不损伤邻近的神经元、胶质细胞和轴突。我们已在细胞培养实验中成功应用了该方法，并在此描述了在斑马鱼脊髓中的详细操作流程。我们展示了该方法在斑马鱼脊髓中的应用实例：通过选择性地对细胞网络中的单个神经元施加应激（图5，A 和 B），或立即且不可逆地杀死单个神经元（图5，C 和 D）。
过去，需要使用专门的激光系统，例如脉冲氮激光或双光子激光系统，才能诱导组织损伤和运动神经切断10,11,12,13。这些激光系统已成功用于造成细胞损伤，例如动脉和静脉中的血栓形成6、急性肾损伤7、心脏损伤8，以及研究脑损伤后钙波和小胶质细胞的反应9。此外，Soustelle 及其同事使用常规共聚焦显微镜系统（351 nm 和 364 nm 紫外激光）在 Drosophila 中诱导上皮细胞和胶质细胞的损伤14。
斑马鱼模型在理解肌萎缩侧索硬化症（及其他人类疾病）中的相关性
斑马鱼是一种广泛使用的模式生物，尤其适用于发育研究28,29,30。尽管存在某些局限性，斑马鱼在模拟人类疾病以及揭示致病分子机制方面具有巨大潜力。目前，斑马鱼模型已广泛应用于运动神经元病（MND）的研究，并取得了重要的分子层面的发现31,32,33,34。转基因斑马鱼品系可在较短时间内建立（4–5个月），并可实现对特定细胞类型的特异性追踪，这些特点使其成为现有肌萎缩侧索硬化症（ALS）动物模型的重要补充。斑马鱼胚胎/幼鱼具有光学透明性，提供了独特的实验优势，能够在脑或脊髓中实现单细胞水平的长期活体成像，而这一点在啮齿类动物模型（或人类）中难以实现。结合单细胞消融等分子技术，该系统为在活体（in vivo）条件下研究精确的分子机制提供了独特的实验平台。
可使用紫外激光消融技术选择性地靶向运动神经元
斑马鱼的脊髓神经元在出生后10小时内开始发育，并在约48小时后基本形成35,36。这种快速发育使得在短时间内以高通量方式可视化这些神经元成为可能。运动神经元是连接大脑与肌肉的关键环节，在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中，运动皮层（上运动神经元）、脑干以及脊髓（下运动神经元）中的运动神经元均会受累。这些神经元的丧失不可避免地导致肌肉萎缩和无力。斑马鱼脊髓中的运动神经元可通过其独特的轴突投射特征以及使用运动神经元特异性启动子（如-3MNX1）进行识别。针对这些具有投射特性的神经元胞体进行观察，揭示了随着时间推移沿轴突投射方向发生的顺行性变性（图4 和 视频1）。对脊髓运动神经元的单细胞分辨率成像进一步证实，在激光消融后会出现磷脂酰丝氨酸的易位及随之而来的Annexin V标记（参见参考文献27中的图4和补充视频3）。尽管我们在采用紫外激光消融方法后观察到死亡神经元中Annexin V的激活，但仍无法确定在此加速过程中触发的细胞死亡级联反应是否完全等同于神经退行性疾病或正常细胞稳态过程中发生的神经元死亡。
尽管这种消融方法具有高度的可重复性和特异性，但不同的包埋策略也可能影响紫外消融的效率。根据我们的经验，最有效的方法是尽量减少包埋斑马鱼的琼脂糖层厚度。较厚的包埋介质若再叠加一层卵水，可能会因光束路径上的衰减和散射效应，降低细胞最终接收到的紫外光能量。
未来，通过杂交不同的转基因鱼系，将能够观察其他受影响细胞（如胶质细胞）对激光诱导的细胞损伤所作出的即时和短期（最长12小时）反应。例如，星形胶质细胞以及非细胞自主性毒性在肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病中的作用已成为研究热点，并被广泛认为与散发性和家族性ALS的致病机制密切相关37,38。然而，胶质细胞毒性及其对运动神经元选择性损伤的机制仍不清楚。我们及他人近期已利用该方法研究了小胶质细胞对死亡神经元的吞噬过程，并实现了对神经元残余物清除过程的可视化观察27,39,40。
将消融技术与高分辨率显微镜及神经炎症标记物相结合，将使研究人员在未来能够进一步深入理解单细胞功能及细胞间的相互关联系统。在活体（in vivo）环境中对这些过程进行表征，不仅在发育研究中至关重要，也在包括运动神经元病（MND）在内的神经退行性疾病模型中具有重要意义，因为在这些疾病中，细胞间的相互作用可能受到损害3,41。

荧光显微镜长期以来被用于研究转基因在斑马鱼中枢神经系统（CNS）中的作用，特别是其对发育过程的影响1。高分辨率显微镜技术使得研究人员能够详细描绘大脑发育、肌肉生成以及其他多种发育事件中所涉及的细胞过程2。然而，对单个细胞死亡过程的研究更具挑战性，主要原因是标准成像过程中难以实现选择性细胞死亡的诱导。然而，单细胞分辨率成像与高度靶向的消融技术相结合，使得研究人员能够探究细胞对压力和损伤的即时反应，以及随之发生的细胞间相互作用。理解这些过程至关重要，尤其是在运动神经元病（MND）等神经退行性疾病中，已有研究表明神经元-胶质细胞相互作用参与了疾病的进展3。
运动神经元病（MND），即肌萎缩侧索硬化症（ALS），是一种破坏性的神经退行性疾病，会影响脑干、运动皮层和脊髓中的运动神经元。这些神经元的丧失会导致肌肉萎缩，患者通常在确诊后3至5年内死亡4。脊髓中的运动神经元与肌纤维相连，在介导肌肉收缩中发挥关键作用。这种神经与肌肉之间通信的失效或运动神经元的死亡会逐渐导致肌肉无力，影响患者的吞咽、行走、说话和呼吸能力。在活体动物中观察运动神经元的死亡过程及其短期后果，为深入理解正常细胞稳态及疾病状态下动态生物学过程提供了极佳的机会。
斑马鱼已成为研究神经退行性疾病的理想模型系统1。这得益于该模式生物所具备的多种优势，例如体外受精、发育周期短、可直接光学观察神经系统，以及易于进行转基因操作。此外，斑马鱼易于构建复合转基因品系，从而实现对不同类型细胞的多重标记策略。通过遗传消融技术可特异性清除特定类型的细胞，但这种方法引起的干扰范围较广，难以精确靶向单个细胞5。相比之下，激光辅助技术能够提供精确的时间和空间控制，已被应用于多种动物模型。尽管大多数研究采用专用设备，如脉冲激光器6,7,8,9,10,11,12或双光子系统13，但近年来也有研究团队利用常规共聚焦显微镜中的紫外激光实现类似操作14。
本文所述技术结合了高分辨率共聚焦显微镜与紫外激光介导的方法，可在选定的运动神经元中以剂量依赖的方式诱导细胞应激或死亡。该方法依赖于常用的405 nm激光器，已在细胞培养和活体动物中成功验证，能够对细胞间相互作用进行详细表征，例如神经元死亡后的小胶质细胞清除过程。

<table><tbody><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher-Scientific</td><td></td><td>用含三卡因（0.02%）的胚胎水以0.8 - 1.5%浓度溶解</td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0.02%</td></tr><tr><td>标准壁带纤维素的硼硅酸盐毛细玻璃管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>GC100F-10（短）&lt;br/&gt; GC100F-15（长）</td><td>拉制至电阻为2 - 7 M&amp;Omega;</td></tr><tr><td>胚胎水&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>在10 L去离子水中加入0.6 g Instant Ocean海盐和4 mL浓度为1 mg/mL的亚甲蓝溶液</td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Select BioProducts</td><td>数字式金属块加热器（SBD110_）</td><td></td></tr><tr><td>显微注射装置</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>在体视显微镜（Leica）下手动进行显微注射，使用装样玻璃针头和Picospritzer II（General Valve corporation）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>在Leica M165FC体视解剖显微镜（Leica）上进行明场透射照明显微观察</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>35 mm玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

使用常规紫外激光共聚焦显微镜诱导细胞应激与死亡

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

利用标准的共聚焦显微镜装置，可通过紫外光消融方法选择性地诱导细胞损伤，并实时观察中枢神经系统中的单个细胞反应及细胞间相互作用。以往研究损伤后的细胞特异性反应通常需要复杂的装置，或将细胞或动物转移至不同且非生理性的环境中，从而干扰了对即时和短期反应的分析。例如，药物介导的细胞消融方法往往缺乏研究单细胞反应和即时细胞间相互作用所必需的特异性。同样，尽管高功率脉冲激光消融技术具有良好的控制性和组织穿透能力，但其需要专用设备，可能使细胞反应的实时可视化变得复杂。本文所述的优化紫外激光消融方法，允许研究人员使用配备405 nm激光器的常规共聚焦显微镜，以剂量和时间依赖的方式对单个细胞进行损伤或杀伤。该方法已应用于斑马鱼脊髓中密集细胞网络内单个神经元的选择性消融。该技术揭示了被消融神经元的剂量依赖性反应，导致细胞体在数分钟至数小时内发生碎裂，并沿轴突出现顺行性退变。该方法使研究人员能够研究单个死亡细胞的命运，更重要的是，可观察消融位点周围细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）的即时反应。

本文所述方法利用商用共聚焦显微镜的FRAP模块，实现对斑马鱼脊髓中运动神经元的消融。通过使用在特定启动子（如-3mnx1, islet1，或 met被使用. 由运动神经元启动子（例如 -3mnx1 或 met) 可实现对细胞体、主轴突以及延伸至肌肉的周围分支的高分辨率成像（图4 和 视频 1).
在3至5日龄鱼类的脊髓中，神经元已成功被消融，总体停留时间为60至80秒，激光功率约为70%，并采用步骤3中所述的一般设置。成功的消融表现为荧光在消融后立即消失且不再恢复（图5，C和D）。使用其他激光谱线（如488 nm激光谱线）进行消融尝试时，未能实现永久性荧光衰减，荧光在短时间内即恢复。重要的是，该技术在紫外消融的神经元中表现出凋亡性细胞死亡的典型特征，例如存在Annexin V、胞体退化的典型形态学改变以及消融神经元的轴突出泡现象27。
通过使用光转换荧光蛋白Kaede（经紫外光照射后，其发射光由绿色转变为红色）的实验，验证了该方法的特异性。在实验中，单个靶向神经元被成功转换（图5，A 和 B），且数小时内未见细胞破坏迹象。若使用较高的激光功率，则会导致靶向神经元完全消亡（无光转换或荧光信号重现），同时在消融位点附近（约20 µm范围内）的细胞发生光转换但未死亡（图5，C 和 D）。
这种激光诱导消融技术的一个重要优势在于其剂量依赖性。为了以不同强度靶向细胞，可通过调节激光功率（图3C，8）、扫描速度和线平均（图3B，4 和 5）、待消融区域的大小（图3D，10）以及重复次数（图3E，12）来进行多层级的精细调控。值得注意的是，该方法也可用于对单个细胞施加细胞应激，而非直接诱导细胞死亡。例如，精细调节在评估神经元死亡过程中的细胞活动时具有重要价值。使用较低紫外激光强度消融具有长轴突投射的运动神经元时，可观察到典型的“出泡”现象（细胞囊泡的形成与断裂），该现象始于被靶向的胞体，并随时间沿轴突延伸（40–90 分钟；图4；视频1中为此消融过程的三维重建影片）。因此，通过调节不同的激光消融参数，进而调控所诱导的细胞应激程度及死亡的时间进程，研究人员可获得高度的实验灵活性。
<img alt="斑马鱼麻醉过程示意图；准备、转移、在琼脂糖中包埋以供研究。" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：斑马鱼活体成像的包埋。（A-F） 活体成像包埋步骤：（A） 将三卡因加入养鱼用水中，起始剂量为 50 mg/L，用于麻醉斑马鱼。（B） 配制低熔点琼脂糖（0.8 - 1.5%），并加热至 38 - 40 °C。（C） 使用转移移液器将筛选并选定的斑马鱼转移至含有三卡因溶液的培养皿中。待麻醉成功后（鳃盖运动微弱、心率下降、无触碰反应），将一条鱼转移至预热的琼脂糖中（D）。尽量减少随鱼带入琼脂糖中的养鱼用水量，以防止后续稀释。（E） 将含有斑马鱼的一滴琼脂糖（约 30 - 50 µL）转移至玻璃底 35 mm 培养皿上。此操作应在解剖显微镜下进行，并使用毛刷轻轻调整斑马鱼至所需方向。静置 10 - 15 分钟，待琼脂糖凝固后，向培养皿中加入约 2 mL 三卡因溶液（F）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜：神经组织中的神经元标记，绿色和红色标记物，显微图像。" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：3 天龄斑马鱼脊髓中神经元和小胶质细胞的可视化。 在表达 (A) GFP 阳性神经元（islet1:GFP）和 (B) mCherry 阳性小胶质细胞（mpeg1:GAL4, UAS:mCherry）的 3 天龄转基因斑马鱼脊髓中，对小胶质细胞和神经元进行可视化。(C) 神经元与小胶质细胞通道图像与明场图像的合并图。(C) 中的示意图插图展示了鱼体的方向及所显示区域的轮廓。比例尺 = 30 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜装置；示意图显示颜色调整和样品图像；蛋白质可视化。" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：UV 激光消融过程中的步骤（如方案第 3 步所述）。在共聚焦软件（Leica Application Suite）中控制 FRAP 软件模块的步骤。(A) 启动 FRAP 模块以执行 UV 激光消融。(B) 设置用于消融的 z 平面以及其他 FRAP 参数，如格式、扫描速度和累加次数，这些参数将决定激光的停留时间。(C) 控制激光强度以及“放大”选项，以最大化漂白效率。(D) 选择一个或多个将被消融的感兴趣区域（ROI）。(E) 设置漂白的时间进程，以确定漂白循环次数以及激光在 ROI 上的总停留时间。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="cmet: GFP生长锥成像，延时图；204分钟内的神经元发育分析" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：紫外线消融神经元的顺行性变性。 对紫外线消融的脊髓神经元发生神经变性的延时成像。（A-F）单个脊髓神经元（met:GAL4,UAS:EGFP；A；圆圈）经紫外线照射后，其胞体随时间逐渐缩小并变圆（A-C），随后出现轴突断裂（C-F；箭头）。轴突变性起始于胞体（消融部位），并沿顺行方向向轴突远端发展，直至胞体荧光完全消失，整个轴突呈现“出芽样”膨大形态（D-F）。比例尺 = 20 µm。该消融过程的三维延时视频见视频1。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼视网膜中光转化过程示意图，s1020t：Kaede蛋白，荧光显微镜。" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：利用光可转换荧光蛋白（Kaede）在运动神经元中验证单细胞紫外照射效果。通过神经元中光可转换荧光蛋白Kaede的激活，验证单细胞紫外照射的效果。（A-D） 标记了Kaede的神经元接受紫外照射。（A） 使用30%激光功率照射10秒，仅使单个神经元（圆圈所示）发生光转化（Kaede由绿色变为红色）（B）。值得注意的是，转化后的细胞可存活数小时，且未出现起泡或变圆等明显退化迹象。使用更高激光功率（95%持续10秒）消融单个神经元 （C；圆圈所示），导致该神经元立即消失（D），并在其周围约20 µm半径范围内少数邻近神经元中引发Kaede的光转化。比例尺 = 20 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元的荧光显微镜图像，突出显示细胞结构和神经连接。" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：图 4 中所示经紫外激光消融神经元的三维表面重建（Imaris）。 
该视频对图 4 中所示神经元进行延时成像，并使用可视化软件（Imaris, Bitplane）进行表面重建。视频展示了消融后胞体的收缩过程，随后轴突从近端向细胞远端发生顺行性断裂。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/Neuron_ablation-3D_rendered.mov" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图1：用于长时间成像的可选琼脂糖模具。 
为避免在长时间采集过程中斑马鱼和琼脂糖发生移动，可在玻璃底35 mm培养皿中央的边缘处制备一个环形（类似甜甜圈形状）的琼脂糖结构（A）。让琼脂糖凝固约10分钟，然后将斑马鱼转移至内圈，并加入一滴琼脂糖（B）。尽量减少包埋时使用的琼脂糖用量（在调整斑马鱼方向后，将多余的琼脂糖刷至外侧）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

对单个细胞进行靶向操作以引发定向应激或死亡，一直以来较难实现。本文介绍一种基于标准共聚焦紫外激光的单细胞分辨率消融方法，可在细胞培养体系及活体动物中选择性地对单个细胞施加应激并诱导其死亡。

使用标准的共聚焦显微镜装置，可采用紫外消融法选择性地诱导细胞损伤，并观察单个细胞的响应及……

该细胞消融方法的总体目标是在细胞培养或活体动物中选择性地损伤或杀死单个细胞。该方法使研究人员能够研究单个死亡细胞的命运，以及小胶质细胞和星形胶质细胞等细胞对消融位点周围环境的反应。该技术的主要优势在于能够精确定位单个细胞，且仅需配备405纳米激光器的常规共聚焦显微镜即可实现。我们采用斑马鱼作为研究运动神经元疾病或额颞叶痴呆等神经退行性疾病的模型系统。通过观察运动神经元的死亡过程及其后续影响，能够更好地理解疾病中涉及的动态过程。我们以剂量依赖的方式诱导细胞应激，从而对细胞间的相互作用进行详细表征。例如，神经元死亡后的小胶质细胞清除过程。尽管该方法可为活体生物的疾病机制提供见解，但也可类似地应用于培养的分离细胞。根据文本方案建立用于交配的雄性和雌性转基因品系后，使用塑料茶筛过滤鱼缸水，以在成功产卵后收集胚胎。然后用卵水冲洗卵，并将卵转移至培养皿中的卵水中。在光学显微镜下观察胚胎，以确定是否受精。随后将受精卵在28摄氏度条件下进行孵育。当胚胎发育至受精后2至5天（DPF）时，将其置于荧光体视显微镜下，筛选出具有适当荧光蛋白表达的胚胎。随后将荧光标记清晰的鱼分离至含有卵水的新培养皿中，以备后续包埋。进行斑马鱼琼脂糖包埋前，通过向含有卵水的培养皿中逐滴加入4克/升的MS 222，配制麻醉溶液。配制低熔点琼脂糖和卵水的储备液，并分装至1.5毫升微量离心管中。取一份分装样品置于38至40摄氏度的加热金属块中，使其温度平衡。对于超过四小时的成像实验，用移液器将约300微升琼脂糖沿玻璃底培养皿内壁呈环形加入，制备成中心带有小开口的环形（类似甜甜圈形状）结构。为了将斑马鱼幼鱼包埋在琼脂糖中用于显微镜观察，首先根据文本方案麻醉幼鱼，然后使用可调移液器吸取一条幼鱼，并让其沉降至吸头底部。将幼鱼以最小体积的液体滴入预热的琼脂糖中。接着用移液器吸取含有幼鱼的琼脂糖，并迅速将其注入预先准备好的玻璃底35毫米培养皿中。在解剖显微镜下，使用普通的画笔将动物或多个动物在琼脂糖中侧向摆放，使其身体和尾部保持平坦。让包埋的鱼类静置10至15分钟，直至琼脂糖完全凝固。然后，加入约2毫升含三卡因的卵水，小心地补满35毫米的培养皿。将含有固定幼虫的培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，使用明场照明和40倍放大倍数，对准动物脊髓的背侧。切换至适当的荧光设置，观察目标结构，以确认所有成像参数均符合后续消融实验的要求。为确定紫外激光消融所需结构的厚度，使用Z轴驱动功能，通过手动上下调节焦距，验证目标结构的顶部和底部边界。手动记录将要消融的Z平面，例如细胞的中心。要进行激光消融，请点击软件菜单顶部的下拉菜单，启动FRAP向导。在新窗口中，通过选择格式、扫描速度和平均次数来确定消融操作的图像参数。如果尚未选择消融的Z平面，请按下“Live”按钮并调节焦距，使待消融的荧光结构或目标Z平面清晰对焦。设置好基本图像参数后，进入“Bleach”步骤以控制具体的消融组件。然后通过激活 405 纳米激光器来启动漂白程序。接下来，使用“放大”选项缩小扫描范围，从而提高所选 ROI 的漂白强度，并最大化驻留时间。在图像采集窗口中使用任意绘图工具选择一个或多个 ROI 进行消融。例如，使用约四到八微米的圆形绘制工具靶向轴突起始段。确定 ROI 后，选择“时间过程”按钮，并确认 ROI 将被扫描和消融的循环次数。根据需要选择光漂白前和光漂白后的帧，以便在光漂白过程之前和之后立即查看整个图像的概览。这些设置使研究人员能够进行多层面的优化。通过调节激光功率、扫描速度、线平均、感兴趣区域大小和重复次数，该技术提供了高度的灵活性，可对单个细胞施加应力或诱导其死亡。在确定所有必要的消融参数后，点击“运行实验”并监测消融效率。有关更多细节，请参阅文本方案。在本实验中，对转基因斑马鱼脊髓中表达GFP的运动神经元进行了紫外激光消融。由运动神经元启动子（如3 MINX one、IO one或MET）驱动的GFP表达，可实现对细胞体、主轴突以及延伸至肌肉的周围分支的高分辨率成像。当消融后荧光立即消失且永不恢复时，表明脊髓中神经元的成功消融。该方法的特异性已在此得到证实：通过使用光转化荧光蛋白 Kaede，单个靶向神经元在紫外光照射后其发射光从绿色转变为红色。为以不同强度靶向细胞，可通过调节激光功率、扫描速度、线平均次数、待消融 ROI 的大小以及重复次数，实现多层级的精细调控。如图所示，使用较低紫外激光强度在胞体处消融后，具有长轴突投射的运动神经元表现出特征性的出泡现象，该现象随时间从胞体沿轴突持续延伸。在进行此操作时，需注意每台共聚焦显微镜系统的配置均具有独特性，各仪器的激光输出功率具有特异性且可能存在差异。在完成操作后，可在被消融的神经元中观察到典型的凋亡性细胞死亡特征。可以重复检测到凋亡标志物（如 XN 5）或形态学变化（如胞体退变或外部出泡）。还可进行额外测试，以回答更多问题，例如脊髓中单个或多个神经元消融如何影响游泳表现。通过杂交不同的转基因斑马鱼品系，研究人员可以探究其他细胞对激光诱导细胞破坏的反应。这些方法为在体内研究肌萎缩侧索硬化症（MND）等疾病的精确分子机制提供了独特的实验平台。观看本视频后，您应能够充分掌握如何准备斑马鱼以进行共聚焦显微镜观察，以及如何执行单细胞紫外激光消融操作。

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