Name: 在穿孔的包装系统二氧化氯的控释，延长贮藏寿命，提高葡萄番茄的安全 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解控释二氧化氯技术在葡萄番茄保鲜中的应用方法，通过穿孔包装系统延长贮藏寿命并抑制大肠杆菌与链格孢菌。该技术为采后农产品保鲜提供创新解决方案。

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1. 密闭腔室顶空中气态ClO2 的测量
<ol>
	<li>准备材料：ClO2 释放袋（含 0.5 g ClO2 悬浊液（有效成分 9.5%），封装于特定聚合物薄膜中以控制释放速率（总表面积为 6 cm2）；具体成分属商业机密）、玻璃密闭舱（19.14 L）以及带可开关气体进出口的盖子。</li>
	<li>使用双面胶将 ClO2 释放袋固定在盖子上。</li>
	<li>用凡士林密封盖子，关闭密闭舱。</li>
	<li>将 ClO2 气体检测仪的进气口和出气口连接至密闭舱。 
	注意：该系统为气体循环系统，测量过程中无气体损失。</li>
	<li>开启进气和出气气流，分别在孵育 0、1、2、3、4、24、26、28 和 48 小时后测定密闭舱内的 ClO2 浓度。</li>
	<li>使用温湿度数据记录仪监测密闭舱内的温度和相对湿度（RH）。</li>
</ol>
2. 果实准备与贮藏
<ol>
	<li>从当地零售商处获取 15 kg 新鲜的葡萄番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme），确保果实健康且无可见缺陷。</li>
	<li>接种液的制备
	<ol>
		<li>使用来自柑橘果实表面的 E. coli（野生型）和 A. alternata 菌株进行接种27。</li>
		<li>将 E. coli 接种于 E. coli 琼脂（ECA）培养基中，在 35 °C 下培养 1 天27，然后将菌体转接到新的平板上继续培养 1 天。用接种环取 ECA 平板上的菌落，在 Levine 伊红美蓝（EMB）琼脂平板上划线，于 35 °C 培养 24 小时以确认菌种；呈现反光性金属绿色的菌落为 E. coli 阳性。</li>
		<li>将 A. alternata 接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，在 25 °C 下培养至孢子出现。</li>
		<li>将 E. coli 菌体从琼脂平板上刮下，悬浮于 50 mL 无菌蒸馏水中，通过与 McFarland 浊度标准比对，使菌液浓度达到约 9 log CFU/mL。随后加入含 0.1% Tween-20 的 1,950 mL 无菌水，最终配制成总量为 2 L 的接种液。</li>
		<li>通过在 EC 琼脂平板上进行稀释涂布法验证细胞浓度。将 A. alternata 的孢子从培养基上刮下，悬浮于含 0.1% Tween-20 的 2 L 无菌蒸馏水中。 
		注：最终 E. coli 的接种量为 7.5 log CFU/g，A. alternata 的接种量为 5.5 log CFU/g。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 7 kg 番茄放入一个 10 L 的不锈钢盘中，并用可高压灭菌袋完全覆盖。将袋和盘置于生物安全柜中。使用喷雾瓶从上方将接种液（2 L）均匀喷洒到果实表面，同时用手套轻轻搅拌果实以确保覆盖均匀。
	<ol>
		<li>5 分钟后，将番茄单层放置于灭菌过的垫纸上，静置风干 2 小时。将约 200 g 果实分别装入 24 个 1 磅（约 1.14 L）带孔托盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心折叠受污染的铝箔，放入不锈钢盘中。脱下手套并放入盘中。将可高压灭菌袋包裹后，对所有受污染物品在 121 °C 下高压灭菌 25 分钟。</li>
	<li>将 ClO2 缓释袋固定在 12 个托盒的盖子内侧，其余 12 个托盒作为对照组。称量每个完整的托盒重量。将果实于 20 °C 下贮存 14 天。</li>
	<li>在第 3、7、10 和 14 天取样。每天每处理组取 3 个托盒作为 3 个重复样本。</li>
</ol>
3. 蛤壳中ClO2浓度的监测
<ol>
	<li>将二氧化氯（ClO2）气体检测仪的进气管和出气管插入蛤壳式培养皿的中央，两管末端相距2 cm，在第3、7、10和14天进行ClO2浓度测定。</li>
</ol>
4. 微生物种群及果实品质特性的测定
<ol>
	<li>将每个重复组的5个果实（约60 g）与99 mL无菌磷酸钾缓冲液（0.01 M，pH 7.2）一同置于无菌采样袋中，在旋转摇床上以100 rpm振荡1小时。
	<ol>
		<li>使用螺旋接种仪将缓冲液洗脱物进行连续稀释（1倍、10倍和100倍），每种稀释度各取50 µL，分别接种于ECA培养基（用于E. coli）和PDA培养基（用于A. alternata）。</li>
		<li>ECA平板在35 °C下培养24小时，PDA平板在25 °C下培养3天。使用光学菌落计数仪读取微生物菌落数量。使用后，对所有接触过污染果实的设备进行消毒处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商的操作规程，使用果实硬度测试仪测定果实硬度。每次使用前校准仪器。每个重复组测定20个果实，结果以将果实压缩1 mm所需的压强（牛顿，N）表示，并换算为N·m−1。</li>
	<li>在贮藏开始时及贮藏期间，称量装有果实的整个密封盒的重量，并与初始重量比较，计算失重率。</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>所有实验均需设置三个重复。采用方差分析（ANOVA）对数据进行分析。通过邓肯氏多重极差检验（Duncan's multiple range test）确定均值间的差异显著性；显著性水平定义为 p &#60;0.05。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

二氧化氯是一种理想的杀菌剂，可用于防止食物腐败。然而，高浓度的二氧化氯不稳定且无法运输，通常需要昂贵的现场发生装置或效率较低的双组分粉末混合方式。本研究探讨了一种稳定、即用型二氧化氯制剂在减少食物腐败和食源性疾病发生率方面的应用。与目前使用的其他二氧化氯应用技术相比，商用 ClO₂ 制剂具有更高的稳定性和使用便捷性。2 此处使用的试剂成本效益高、保质期长，且无需大型发生器或预先混合。然而，由于ClO₂具有强氧化性2，ClO的气体释放特性2 难以测量，因此很少有相关报道。在之前的一项研究中，采用滴定法来测量释放速率28然而，该方法准确性较低且操作更为复杂。一些研究评估了ClO₂的浓度2 通过将其溶于水，然后采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）进行检测29然而，这种GC-MS仪器结构复杂且价格昂贵30. 在我们的研究中，一种 ClO2 使用气体检测仪测量 ClO 的浓度2</s...

富含新鲜水果和蔬菜的饮食可能有助于降低多种疾病的风险，包括冠心病和某些类型的癌症1。然而，一些食源性微生物病原体，如Escherichia coli、Salmonella enterica和Listeria monocytogenes，与食用新鲜水果和蔬菜相关，可能导致消费者因摄入受污染的农产品而患病甚至死亡2。例如，E. coli O157:H7的暴发曾与葡萄、番茄和草莓有关3,4，甲型肝炎的暴发则与新鲜蓝莓有关5。此外，微生物污染还可能通过采后腐烂造成大量产品损失6。Alternaria alternata是一种重要的植物致病真菌，已知可在超过380种植物宿主中引起叶斑病及其他病害7。研究表明，该真菌可导致番茄发生Alternaria黑斑病8、茎溃疡病以及叶枯病9。因此，需要一种安全有效的采后去污染处理方法，以同时控制食源性病原体并防止新鲜农产品的采后腐烂。
低残留和无残留技术是替代性消毒剂的新趋势。多种采后杀菌剂已被用于减少腐败微生物并预防食源性疾病。臭氧作为一种强效抗菌剂，已被证明可保持草莓和蓝莓的品质与新鲜度10,11。然而，臭氧可能导致果实表层组织氧化，从而引起变色以及风味品质下降12。氯已被用于新鲜农产品（如蓝莓和苹果）的消毒13。尽管氯具有良好的杀菌效果，但它可能与含氮化合物或氨发生反应，产生致癌副产物14，尤其是在用于新鲜水果消毒时尤为明显15。
二氧化氯（ClO2）是一种替代性消毒剂，已获中国和美国批准用于果蔬采后处理16。ClO2 是一种水溶性氧化剂，其氧化能力是游离氯的 2.5 倍17。ClO2 在低浓度和短接触时间下即具有高效性18。在用于消毒的浓度下，ClO2 毒性低、腐蚀性小，被公认为是在多种环境中使用最有效的杀菌和杀真菌剂之一19,20,21。
大量研究结果表明，ClO2 能够控制食源性病原体和采后腐烂16。例如，ClO2气体已被用于灭活L. monocytogenes、Salmonella和E. coli O157:H7，并防止蓝莓和草莓腐败22,23。ClO2气体在降低微生物污染风险的同时，还能保持新鲜水果的品质，并在控制草莓采后腐烂方面表现出有效性24。然而，该气体在高浓度下不稳定，且难以运输，传统上需要在现场使用昂贵的发生器或效率较低的双组分粉末混合方式。
然而，一种新型二氧化氯（ClO2）产品已显示出在控制食品腐败微生物和病原体方面具有显著效果，该产品采用即用型、可控释放的剂型（即无需使用发生器或预先混合原料），在初步实验中表现优异25。这种ClO2形式安全、成本低、无腐蚀性、易于运输，并可实现可控释放，且对环境无不良影响。先前的研究表明，将这种缓释型ClO2粉末包裹在过滤材料中并置于蛤壳式包装内，可显著减少新鲜蓝莓和草莓的腐烂，降低果实失水，并在采后贮藏期间维持果实硬度25,26。最近，一种可控释放的ClO2小包已被开发出来，其通过将ClO2浆料密封于半透性聚合物薄膜中制成。本研究的目的包括：1）监测ClO2气体在密闭容器和打孔蛤壳包装中的释放特性；2）研究在容器中使用可控释放ClO2小包对葡萄番茄上食源性病原菌及果实腐烂的影响；3）评估可控释放ClO2对葡萄番茄贮藏品质的影响。

<table><tbody><tr><td>Curoxin&lt;sup&gt;&amp;#174;&lt;/sup&gt; 二氧化氯袋</td><td>Worrell Water Technologies</td><td></td><td>浆状物，有效成分含量 9.5%，密封于半透性聚合物薄膜中</td></tr><tr><td>葡萄番茄</td><td>Santa Sweets, Inc</td><td></td><td>Santa Sweets Authentic&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ClO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体检测仪</td><td>Analytical Technology, Inc., Collegeville, PA</td><td></td><td>PortaSens II&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带孔蛤壳式包装盒</td><td>Packaging Plus LLC, Yakima, WA</td><td></td><td>OSU #1，1 磅</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>来自果实表面的野生型（WT）</td></tr><tr><td>Alternaria alternata</td><td></td><td></td><td>来自果实表面</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 琼脂&amp;nbsp;</td><td>EC 肉汤，Oxoid，英国</td><td></td><td>含 1.5% 琼脂的 EC 肉汤</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂&amp;nbsp;</td><td>BD Difco，Sparks，MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>莱文氏伊红美蓝琼脂</td><td>BD Difco，Sparks，MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>触发式喷雾瓶&amp;nbsp;</td><td>Impact Products, LLC.，Toledo，OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灭菌采样袋&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific，New Brunswick，NJ</td><td></td><td>Innova 2100</td></tr><tr><td>IUL Instruments Neutec Eddy jet 螺旋接种仪</td><td>Neutec Group Inc.，Farmingdale，NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ 微型光学平板读数仪&amp;nbsp;</td><td>Synoptics, Ltd.，Cambridge，英国</td><td></td><td>ProtoCOL</td></tr><tr><td>果实硬度测试仪&amp;nbsp;</td><td>Bioworks Inc，Wamego，KS</td><td></td><td>FirmTech 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tinytag 温度和相对湿度数据记录仪</td><td>Gemini Data Loggers，West Sussex，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McFarland 浊度标准液</td><td>Fisherbrand，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过穿孔包装系统中二氧化氯的可控释放延长葡萄番茄的贮藏期并提高其安全性

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

一种可控释放的二氧化氯（ClO₂）气体发生系统2) 袋是通过将ClO的浆料形式密封而制备的2 进入半透性聚合物薄膜；在有无水果的容器中监测该小袋的释放特性。将小袋固定在装有葡萄番茄的带孔周转箱内侧，并在20 °C下储存14天期间评估其对微生物种群、硬度和失重的影响。3天内，ClO2 蛤壳中的浓度达到3.5 ppm，并在第10天前保持恒定，之后至第14天降至2 ppm。ClO2 袋泡显示出强效的抗菌活性，可减少 大肠杆菌 通过3.08 log CFU/g降低种群数量 Alternaria alternata 种群在储存14天后减少了2.85 log CFU/g。ClO2 处理还减少了番茄的软化和重量损失，延长了番茄的整体货架期。我们的结果表明，ClO2 处理有助于在不损害番茄品质的前提下延长其贮藏期并提高微生物安全性。

在最初的几个小时内，ClO2 的释放呈现线性模式。在前4小时内，浓度约增加2.38 ppm/h。孵育24小时后，释放速度减缓，ClO2 浓度达到25.4 ppm。然而，孵育24小时后，浓度趋于稳定（图1）。
顶空气体中的 ClO2 双壳容器中带葡萄番茄的浓度在第3天至第10天期间约为4 ppm，10天后储存浓度开始下降，第14天时约为2 ppm（图2）。初始种群的 E. coli 和 A. alternata 在果实中 接种后分别为 4.3 和 3.4 log CFU/g（图3）。采用 ClO 处理2 袋状结构减少了种群数量 E. coli 和 A. alternata 分别在...

本文介绍了一种新型缓释二氧化氯（ClO2）产品的应用方案，该产品可减少腐败并延长新鲜水果的保质期。将缓释型ClO2产品添加至标准商用葡萄番茄包装中，并针对大肠杆菌（Escherichia coli）和链格孢菌（Alternaria alternata）进行测试。

一种缓释二氧化氯（ClO₂）小袋通过将二氧化氯（ClO₂）浆料封装于半透性聚合物膜中制备而成；其释放特性……

本实验的总体目标是利用一种新型的二氧化氯缓释产品，降低食源性疾病和食物腐败的风险，并延长新鲜水果的保质期。该方法有助于解答农产品采后保鲜领域中关于新鲜果蔬贮藏保存的关键问题。该技术的主要优势在于，在整个包装农产品的贮存和操作过程中，均可对二氧化氯的释放剂量和处理时间进行控制。尽管该方法可用于研究抗菌剂在农产品保鲜中的可控释放，也可应用于其他系统，如水体消毒和除臭。在开始实验前，使用双面胶将二氧化氯袋固定在玻璃腔室的盖子上，并用凡士林密封腔室。将二氧化氯气体检测仪的进气口和出气口连接至腔室，并开启进气和出气的气体流。然后，在指定时间点测定密闭室内的二氧化氯浓度，并使用温湿度数据记录仪监测温度和相对湿度。接着，通过解冻冻存的大肠杆菌菌种来复苏细菌，并将菌液涂布于大肠杆菌琼脂平板上，在35°C条件下培养24小时。次日，将菌体转接到新的平板上，再次于35°C条件下培养24小时。然后，将单个菌落划线接种至 Levine 伊红美蓝琼脂平板上，在 35 摄氏度下再培养 24 小时。培养物若呈现反光的金属绿色，则为大肠杆菌阳性。用接种环刮取已鉴定的大肠杆菌菌落，将其转移至 50 毫升无菌蒸馏水中，直至菌液浓度估计达到与 McFarland 浊度标准相当的 9 log CFU/毫升；随后将该 50 毫升菌液倒入含有 0.1% Tween 20 的 1950 毫升无菌水中，最终获得 2 升的接种菌液总体积。对于链格孢菌（A.alternata），将真菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于25摄氏度培养至孢子出现，并按前述方法制备两升体积的接种物样品。接种物准备好后，将七公斤番茄放入一个10升的不锈钢托盘中，托盘需完全置于可高压灭菌的袋子内。将袋子和托盘移入安全罩中，使用喷雾器喷洒目标实验接种液，同时用手套轻轻搅拌果实。五分钟后，将番茄单层放置在灭菌的箔纸上，静置两小时。果实干燥后，取200克番茄分装至24个独立的一磅装带孔蛤壳容器中。仔细折叠被污染的箔纸，并将其与手套一同放入托盘，进行高压灭菌处理。现在，将二氧化氯袋固定在一半蛤壳盖子上，并称量每个完整的蛤壳。将所有蛤壳在20摄氏度条件下储存14天。随后在相应的实验时间点，将二氧化氯气体检测仪的进气管和出气管插入蛤壳中心位置，两管末端之间相距2厘米，然后获取二氧化氯浓度读数。为计算与初始重量相比的失重率，需称量带有果实的完整蛤蜊壳。为测定每个时间点果实表面存在的微生物种群数量，取每个重复组中的5个果实，加入99毫升无菌磷酸盐缓冲液，置于无菌采样袋中，在轨道摇床以100转/分钟的转速振荡1小时。振荡结束后，使用螺旋接种仪将缓冲液洗脱物的50微升连续稀释液接种至相应的琼脂平板上，进行相应孵育时间的培养，并使用光学平板读数仪测定微生物菌落计数。测定果实硬度时，按照制造商的说明使用果实硬度计分析每个重复组的20个果实，注意使用后对设备进行消毒，

controlled-release-chlorine-dioxide-perforated-packaging-system-to

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

在穿孔的包装系统二氧化氯的控释，延长贮藏寿命，提高葡萄番茄的安全

便携式化学灭菌器（Portable Chemical Sterilizer, PCS）是一项革命性的、无需外部能源、几乎无需用水的灭菌技术，专为陆军医疗单位设计。PCS 在现场、按需、在使用点（PoU）的塑料箱内，通过将干燥试剂与水混合生成二氧化氯。食品与环境友好型消毒喷雾器（Disinfectant-sprayer for Foods and ENvironmentally-friendly Sanitation, D-FENS）以及通用型环境友好型去污消毒剂（Disinfectant for ENvironmentally-friendly Decontamination, All-purpose, D-FEND...

便携式化学消毒器（PCS）、D-FENS 和 D-FEND ALL：面向军用的新型二氧化氯去污技术

来源： Hassan, J. A., 等 高通量鉴定抗性 Pseudomonas syringae pv. tomato 利用幼苗淹水法在番茄中进行检测。 J. Vis. Exp.

用于筛选番茄细菌抗性的幼苗淹水试验

本视频展示了一种用于构建聚合物气泡（polybubble）新型平台的方法，该平台可实现延迟爆裂释放。采用聚酯类聚合物形成具有核-壳结构的聚合物气泡，并可将小分子和抗原作为载荷物质。...

一种用于分子延迟爆发释放的新型递送平台的制备技术

Clostridium difficile 是一种专性厌氧的致病菌，可引起抗生素相关性腹泻（AAD）。本文介绍了分离、培养和保藏 C. difficile 营养细胞及芽孢的方法。这些技术需要使用厌氧室，且需定期维护，以确保为 C. difficile...

在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

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用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续13C和15N标记室的设计与操作

本文所述方案通过使用2-氯乙基膦酸（CEPA）便捷地研究细菌对乙烯的响应。乙烯的产生 原位 通过CEPA在水性细菌培养基中的分解，避免了对纯乙烯气体的需求。...

利用乙烯释放化合物2-氯乙基膦酸作为研究细菌乙烯反应的工具

本文描述了用于采后害虫控制的一氧化氮（NO）熏蒸处理方案。在注入NO之前，先用氮气（N2）冲洗熏蒸室，以建立超低氧环境。处理结束时，再次用N2冲洗熏蒸室，以稀释NO，随后将产品暴露于环境空气中，从而避免接触二氧化氮（NO2）。...

一氧化氮气体用于害虫防治的实验室熏蒸操作规程

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

番茄种子是研究植物繁殖过程中遗传学和发育生物学的重要模式材料。本方案适用于清除不同发育阶段的番茄种子，以观察更精细的胚胎结构。...

一种高效透明化方案用于研究番茄（Solanum lycopersicum L.）种子发育

本文描述了一种新型的直接植物输注装置，用于筛选分子对细菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）或其昆虫媒介（Diaphorina citri,...

用于植物分子递送的直接灌注装置

本方案描述了一种高效的甘蓝叶肉原生质体系统。通过测试多种缺氧处理条件，该系统表现出低氧响应基因的高水平激活，有助于研究植物对淹水胁迫耐受性的遗传与分子机制 十字花科...

开发一种用于研究缺氧耐受性的甘蓝原生质体系统 芸薹属

了解控释二氧化氯技术在葡萄番茄保鲜中的应用方法，通过穿孔包装系统延长贮藏寿命并抑制大肠杆菌与链格孢菌。该技术为采后农产品保鲜提供创新解决方案。

通过穿孔包装系统中二氧化氯的可控释放延长葡萄番茄的贮藏期并提高其安全性

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