Name: 中和流感病毒单克隆抗体逃逸变种的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解如何通过血凝抑制试验和连续传代培养产生甲型流感病毒血凝素靶向单克隆抗体的逃逸变种，从而阐明抗体结合的关键表位残基。该方法适用于其他病毒糖蛋白研究。

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本项目部分资金来自美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院、国家过敏与传染病研究所的联邦基金，资助编号为CEIRS合同HHSN272201400008C（F.K.）；NIH U19AI109946-01（F.K.）；以及P01AI097092-04S1（P.E.L.）。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管通过逃逸突变体鉴定出的大多数残基是准确的，但该方法的一个主要局限在于，逃逸突变体中的点突变未必位于抗体分子结合区域之内，而该区域通常由结构分析确定。这是因为特定残基的突变可能引起远离突变位点的构象变化，类似于变构效应。另一个局限是，该方法仅适用于中和抗体；对于缺乏中和活性的抗体则无法应用 体外 选择性压力不会导致逃逸突变体的产生。然而，通过使用一组由先前已表征的中和抗体诱导产生的逃逸变异体，可以克服这一局限性。Tan 等 利用H7N9病毒中和性单克隆抗体的一个逃逸突变体，来定位非中和性抗体的表位7.
尽管如此，通过产生逃逸突变体来解析抗体的表位，为晶体学和冷冻电子显微镜提供了一种可行的替代方案，而这两种方法均需要大量设备投入。其他替代方法包括利用丙氨酸扫描或肽段扫描/截短突变体来确定单克隆抗体的最小结合区域。丙氨酸扫描突变可能需要在筛选过程中构建大量突变体，工作量较大。29，而肽段扫描仅限于线性表位30本方案中所述方法无需特殊设备或技术，实际上利用了现有的 体外 为生成目标抗体逃逸变异体而改良的中和实验。
需要多次传代以产生逃逸突变株的实验方案（例如，茎部特异性抗体）的效果在很大程度上取决于第0代中抗体的起始浓度。为稳妥起见，建议从比抗体半数最大抑制浓度低一个对数或半个对数的浓度开始，以确保病毒能够有效增殖。研究者可以推测，在低免疫压力下产生的高滴度病毒培养物，其病毒群体将具有较大的遗传变异。通过在后续传代中逐步提高抗体浓度，可筛选出逃逸突变株。如果出现病毒增殖减少的情况，可在下一次传代中增加病毒上清液的用量，同时保持与前一次传代相同的抗体浓度。
多数通用流感疫苗的目标是诱导针对血凝素（HA）茎区的强效抗体反应。对茎区特异性抗体逃逸变异体的分析，对于明确流感病毒适应性与免疫压力之间关系具有重要意义。有趣的是，由茎区特异性单克隆抗体诱导产生的逃逸突变病毒均表现出减毒特性 体内 在小鼠LD中50 研究4这些研究为基于茎部的疫苗接种平台提供了有力证据。此外，本方案还可用于鉴定针对其他抗病毒化合物（如小分子抑制剂）的逃逸突变体。最后，该方法不仅限于流感病毒表面糖蛋白，还可更广泛地应用于确定其他病毒糖蛋白的表位。

与其他RNA病毒类似，甲型流感病毒具有易出错的聚合酶，可在每轮复制过程中产生大量抗原变异体1,2,3。甲型流感病毒可通过抗原漂移机制惊人地适应并逃逸人体免疫应答，该过程由表面糖蛋白上的突变累积引起，导致抗体结合能力丧失。病毒表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原漂移使得每年必须重新配制并接种流感疫苗。
抗原特异性抗体分离与制备技术的进步，已成功获得大量疫苗诱导的单克隆抗体（mAb）4,5,6,7,8。反过来，对广泛中和甲型流感病毒的单克隆抗体表位进行表征，极大地推动了多种通用流感疫苗候选物的研发9,10,11,12,13,14。阐明单克隆抗体的抗原足迹，有助于揭示中和作用的结构决定因素，并为疫苗设计提供科学依据。然而，通过X射线晶体学或冷冻电子显微镜对大量单克隆抗体进行结构表征以绘制病毒抗原上的表位图谱，对于实验室而言既不现实，也不具备成本效益15,16,17,18。
X射线晶体学或冷冻电子显微镜技术需要昂贵的设备、专门的技术，且可能耗费大量时间才能获得数据。一种替代且更快速的方法是利用易错的RNA依赖性RNA聚合酶快速产生多样化的病毒群体，从而生成逃逸突变体，以确定单克隆抗体（mAbs）的表位19,20,21,22,23。逃逸变异体的生成无需任何特殊设备或技术，仅使用常规实验室试剂和设备即可完成。
本文介绍一种方法，可用于绘制识别流感病毒HA的单克隆抗体（mAb）结合所必需的关键残基图谱。

<table><tbody><tr><td>带盖 Falcon 96 孔透明平底 TC 处理培养微孔板</td><td>Corning, Inc.</td><td>353072</td><td>用于微量中和试验的检测板</td></tr><tr><td>Falcon 96 孔透明 V 型底板</td><td>Corning, Inc.</td><td>353263</td><td>用于血凝抑制试验的检测板</td></tr><tr><td>1X 最小必需培养基（MEM）</td><td>Gibco</td><td>11095080</td><td>感染用培养基</td></tr><tr><td>甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）处理的胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>将不成熟的 HA&lt;sub&gt;0&lt;/sub&gt; 切割为 HA&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt; 和 HA&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>生物素化抗 NP 一抗（IAV）</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>识别甲型流感病毒 NP 蛋白的抗体</td></tr><tr><td>生物素化抗 NP 一抗（IBV）</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td><td>识别乙型流感病毒 NP 蛋白的抗体</td></tr><tr><td>链霉亲和素-HRP 抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>用作生物素化抗 NP 抗体的二抗</td></tr><tr><td>HRP 底物（SIGMAFAST-OPD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>水溶性邻苯二胺二盐酸盐 HRP 底物</td></tr><tr><td>96 孔 V 型底板</td><td>Nunc</td><td>249662</td><td>用于血凝试验的检测板</td></tr><tr><td>鸡红细胞</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7201403</td><td>用于评估流感病毒的凝集能力</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td><td>逆转录酶</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>扩增 PCR 产物的分离</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>抗人 IgG（H+L）Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>人源抗体的荧光二抗</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>鼠源抗体的荧光二抗</td></tr><tr><td>6 孔聚苯乙烯微孔板</td><td>Corning, Inc.</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 长期储存冻存管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>病毒培养上清液的冷冻保存</td></tr><tr><td>重配株 A/California/04/09 (H1)</td><td>Palese 实验室</td><td></td><td>表达 A/California/04/09 (H1N1) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒</td></tr><tr><td>重配株 A/Shanghai/1/13 (H7)</td><td>Palese 实验室</td><td></td><td>表达 A/Shanghai/1/13 (H7N9) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液（35%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>基于硅胶膜的 DNA 片段纯化</td></tr></tbody></table>

中和流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的生成

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

流感病毒具有显著的适应性和逃避免疫应答的能力。其中一种方式是通过病毒表面糖蛋白发生抗原性改变。逃逸突变株的产生是阐明病毒如何逃避免疫识别以及鉴定抗体结合所必需的关键残基的有力方法。本文介绍了一种利用靶向病毒血凝素（HA）的人源或鼠源单克隆抗体（mAbs）来生成甲型流感病毒逃逸突变株的实验方案。通过应用本技术，我们先前已鉴定了针对新型禽源H7N9 HA头部或茎部的抗体结合所必需的关键残基。该方案可轻松适用于其他病毒系统。对逃逸突变株的分析对于模拟抗原漂移、确定赋予耐药性和病毒适应性的单核苷酸多态性（SNPs），以及疫苗和/或治疗药物的设计具有重要意义。

我们此前已使用该方法的多种变体，以产生针对季节性流感病毒疫苗、H7N9疫苗或连续DNA/重组HA蛋白疫苗所诱导的人源和鼠源单克隆抗体（mAb）的逃逸突变株4,5,6,7。如上所述，首先通过血凝抑制（HI）和微量中和实验对抗体进行表征，以指导我们选择后续采用的具体实验方案4,5。抗体07-5D03、07-5F01、07-5G01、07-4B03、07-4E02和07-4D05被发现对禽源H7N9病毒（A/Shanghai/1/2013）具有HI活性和中和活性（表1），因此采用方案1（步骤2.1）。对于具有中和活性但缺乏HI活性的单克隆抗体，例如41-5E04、045-051310-2B06、042-100809-2F04和S6-B01（表1），则采用方案2（步骤2.2）来生成逃逸突变株。逃逸突变体定位分析显示，许多抗体识别病毒HA蛋白不同位置上的关键残基4,5（图4）。尽管大多数HI阳性抗体的逃逸突变残基位于H7 HA已报道的抗原位点附近，而HI阴性抗体产生的逃逸突变体则在HA茎区出现点突变4,5。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>HI 活性</td>
			<td>NEUT 活性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 抗体HI及中和活性表 从接种实验性H7N9疫苗的个体中分离出的十种H7特异性单克隆抗体表现出不同特性 体外 抗病毒活性5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">上游引物 (5' 至 3')</td>
			<td colspan="4">下游引物 (5' 至 3')</td>
			<td colspan="2">PCR扩增条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ºC 反应 60 分钟，94 ºC 预变性 2 分钟；5 个循环：94 ºC 变性 20 秒，50 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；随后 40 个循环：94 ºC 变性 20 秒，58 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；最后 68 ºC 延伸 10 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ºC 反应 60 分钟，55 ºC 反应 30 分钟，94 ºC 预变性 2 分钟；5 个循环：94 ºC 变性 20 秒，40 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；随后 40 个循环：94 ºC 变性 20 秒，58 ºC 退火 30 秒，68 ºC 延伸 3 分 30 秒；最后 68 ºC 延伸 10 分钟</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：通用流感病毒引物。 用于扩增甲型27和乙型28流感病毒HA片段的引物对及其相应的热循环仪反应条件。
<img alt="血凝抑制试验；抗体滴定；微量板示意图；稀释系列结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：血凝抑制（HI）试验。（A）使用96孔V型底板对两种小鼠H1特异性单克隆抗体7B2（靶向头部）和6F12（靶向茎部）进行HI试验的设置示意图；（B）HI试验结果示例23。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="微量中和试验示意图，显示抗体 4D05、CR9114 的 3 倍稀释及病毒分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：微量中和试验。 建立微量中和试验的示意图，用于检测两种人源单克隆抗体 4D055 和 CR911417 的活性。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血凝素抑制抗体示意图；病毒-抗体相互作用，连续传代显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：逃逸突变体的产生。 所建议的方法取决于抗体所表现出的血凝素抑制（HI）活性和微量中和活性。针对（A）中和性HI阳性抗体的逃逸突变体可能只需在鸡胚中传代一次，而针对（B）中和性HI阴性抗体的逃逸突变体则可能需要在细胞培养中进行多次传代，并逐步增加抗体用量。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="突出显示氨基酸变化的蛋白质结构突变示意图，附带三维分子模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：利用逃逸突变体构建的新型禽流感H7N9血凝素（HA）表位图示例。 从接种H7N9流感病毒候选疫苗的个体中分离出疫苗诱导的抗体，并用于生成逃逸突变体。每个以红色标示的残基代表对单克隆抗体（mAb）高效结合至关重要的氨基酸位点。数据改编自Dunand-Henry et al., 20154。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

我们描述了一种方法，用于鉴定人源或鼠源单克隆抗体结合甲型流感病毒血凝素所必需的关键残基。该方案可适用于其他病毒表面糖蛋白及其相应的中和抗体。

流感病毒表现出极强的适应能力和逃避免疫宿主反应的能力。其中一种方式是通过表面抗原发生改变……

本方法的总体目标是提供一种用于阐明中和性单克隆抗体表位的可操作实验方案。该方法有助于回答免疫学与病毒学领域中的关键科学问题，从而明确宿主与病毒之间的相互作用，推动治疗手段与诊断工具的开发，进而为疫苗设计提供支持。该技术的主要优势在于仅需基础的组织培养与分子生物学技术即可完成，无需特殊仪器或设备。本实验操作由来自彼得·帕列塞实验室的医学博士兼博士研究生 Mark Bailey 演示。首先根据文本方案中所述，通过血凝抑制（HI）和中和活性对抗体进行表征。对于具有 HI 活性的中和抗体，需进一步分析：将目标抗体用一倍浓度的 PBS 缓冲液配制，每份体积为 100 微升，按浓度递增的顺序制备四个稀释度。接下来，在400微升体积的1倍PBS中制备浓度为每毫升一百万空斑形成单位的病毒原液。然后，将100微升浓度为每毫升一百万空斑形成单位的病毒液与100微升各抗体稀释液或100微升1倍PBS混合。将样品置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育1小时。短暂涡旋混匀后，将每种混合物各取 200 微升注入无特定病原体的鸡胚中。随后，将鸡胚在 37 摄氏度、无二氧化碳条件下孵育 40 至 44 小时。孵育结束后，通过将感染病毒的鸡胚置于 4 摄氏度环境中至少 6 小时，以处死鸡胚。接下来，按照之前所述方法收集卵黄囊液。最后，按照文中所述血凝抑制（HI）实验方案确认逃逸突变株。为了获得针对无HI活性的中和抗体的逃逸突变株，必须在抗体浓度逐步增加的条件下对病毒进行连续传代。将 MDCK 细胞以每孔一百万个细胞的密度接种于六孔板中。将细胞置于含 5% 二氧化碳的 37°C 培养箱中孵育至少 4 小时。同时，将病毒原液稀释至每毫升含一百万个空斑形成单位。在250 µL体积的1× MEM中，加入经TPCK处理的胰蛋白酶，配制浓度为0.02 毫克/毫升的单次抗体稀释液。后续所有传代均使用较高浓度的抗体。将250 µL稀释病毒液与250 µL稀释抗体液混合，或以250 µL 1× MEM作为无抗体对照。将病毒抗体混合物在含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育30分钟。细胞孵育结束后，用玻璃巴斯德吸管吸除培养基，并用1毫升1×PBS洗涤细胞单层。随后，向各孔中加入500微升混合物，在含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育1小时。一小时后，向各孔中补充两毫升含 TPCK 处理的胰蛋白酶的一倍 MEM。在感染后 48 小时，于显微镜下观察细胞是否出现细胞病变效应（CPE），或进行血凝试验以检测病毒增殖。若在添加抗体的培养体系中观察到 CPE 生长，则收集上清液至多个冻存管中。用传代次数标记试管，并于负80摄氏度保存。保留100微升上清液，用于感染新的MDCK单层细胞，加入2毫升含TPCK胰蛋白酶和抗体的一倍MEM培养基。每次传代时需设置无抗体对照组。逐步提高每次传代中抗体的浓度，直至即使抗体终浓度达到每毫升0.6毫克时，病毒仍能维持可检测的生长活性。将每次传代的上清液分装至多个冻存管中，冻存于-80摄氏度。继续按照文中的实验方案进行逃逸突变株的分离与分析。从接种候选H7N9流感病毒疫苗的个体中分离出疫苗诱导的抗体，用于产生逃逸突变体。逃逸突变体定位结果显示，许多抗体识别病毒HA上不同位置的关键残基。以红色标示的每个残基代表单克隆抗体高效结合所必需的关键氨基酸位置，而大多数血凝抑制（HI）阳性抗体的逃逸突变残基位于先前报道的H7HA抗原位点附近。产生逃逸突变体的HI阴性抗体在茎区发生点突变。一旦掌握，该技术可用于阐明针对其他病原体的保护性结构决定因素。该技术不仅可用于生成单克隆抗体的逃逸变异体，还可用于抗病毒化合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过体外生成逃逸变异体来阐明单克隆抗体的结合表位。进行此操作时，务必注意在处理病毒时保持谨慎，并使用适当的个人防护设备。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

中和流感病毒单克隆抗体逃逸变种的产生

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过...

生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

该视频展示了一种构建耐冷重组流感病毒的方法。该方法包括将双向质粒转染至人源细胞，随后在较低温度下孵育，以获得适用于疫苗生产的病毒，这些病毒在较高温度条件下复制能力降低。...

生成用于疫苗的重组减毒流感病毒

从克隆的cDNA中拯救重组沙粒病毒，这一方法被称为反向遗传学，可使研究人员探究特定病毒基因产物及其不同结构域和残基在沙粒病毒生物学多个方面所起的作用。同样，将反向遗传学技术应用于经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疫苗开发的细胞系（Vero）中，为研制有效且安全的疫苗以对抗人类致病性沙粒病毒提供了新的可能性。...

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本文介绍了一种在昆虫细胞中表达正确折叠且具有功能的新型中国H7N9病毒表面抗原的方法。该技术可适用于表达任何病毒或细胞表面蛋白的胞外结构域。...

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利用杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体

定量微量中和试验的优化

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。...

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a...

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

一种改进的高通量呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验

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利用高致病性H5N1和禽源H7N9病毒包膜糖蛋白制备高滴度感染性流感假病毒颗粒

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Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株及中和抗体快速定量中的应用

了解如何通过血凝抑制试验和连续传代培养产生甲型流感病毒血凝素靶向单克隆抗体的逃逸变种，从而阐明抗体结合的关键表位残基。该方法适用于其他病毒糖蛋白研究。

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