中和流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的生成

本方法的总体目标是提供一种用于阐明中和性单克隆抗体表位的可操作实验方案。该方法有助于回答免疫学与病毒学领域中的关键科学问题，从而明确宿主与病毒之间的相互作用，推动治疗手段与诊断工具的开发，进而为疫苗设计提供支持。该技术的主要优势在于仅需基础的组织培养与分子生物学技术即可完成，无需特殊仪器或设备。

本实验操作由来自彼得·帕列塞实验室的医学博士兼博士研究生 Mark Bailey 演示。首先根据文本方案中所述，通过血凝抑制（HI）和中和活性对抗体进行表征。对于具有 HI 活性的中和抗体，需进一步分析：将目标抗体用一倍浓度的 PBS 缓冲液配制，每份体积为 100 微升，按浓度递增的顺序制备四个稀释度。

接下来，在400微升体积的1倍PBS中制备浓度为每毫升一百万空斑形成单位的病毒原液。然后，将100微升浓度为每毫升一百万空斑形成单位的病毒液与100微升各抗体稀释液或100微升1倍PBS混合。将样品置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育1小时。

短暂涡旋混匀后，将每种混合物各取 200 微升注入无特定病原体的鸡胚中。随后，将鸡胚在 37 摄氏度、无二氧化碳条件下孵育 40 至 44 小时。孵育结束后，通过将感染病毒的鸡胚置于 4 摄氏度环境中至少 6 小时，以处死鸡胚。

接下来，按照之前所述方法收集卵黄囊液。最后，按照文中所述血凝抑制（HI）实验方案确认逃逸突变株。为了获得针对无HI活性的中和抗体的逃逸突变株，必须在抗体浓度逐步增加的条件下对病毒进行连续传代。

将 MDCK 细胞以每孔一百万个细胞的密度接种于六孔板中。将细胞置于含 5% 二氧化碳的 37°C 培养箱中孵育至少 4 小时。同时，将病毒原液稀释至每毫升含一百万个空斑形成单位。

在250 µL体积的1× MEM中，加入经TPCK处理的胰蛋白酶，配制浓度为0.02 毫克/毫升的单次抗体稀释液。后续所有传代均使用较高浓度的抗体。将250 µL稀释病毒液与250 µL稀释抗体液混合，或以250 µL 1× MEM作为无抗体对照。

将病毒抗体混合物在含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育30分钟。细胞孵育结束后，用玻璃巴斯德吸管吸除培养基，并用1毫升1×PBS洗涤细胞单层。随后，向各孔中加入500微升混合物，在含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育1小时。

一小时后，向各孔中补充两毫升含 TPCK 处理的胰蛋白酶的一倍 MEM。在感染后 48 小时，于显微镜下观察细胞是否出现细胞病变效应（CPE），或进行血凝试验以检测病毒增殖。若在添加抗体的培养体系中观察到 CPE 生长，则收集上清液至多个冻存管中。

用传代次数标记试管，并于负80摄氏度保存。保留100微升上清液，用于感染新的MDCK单层细胞，加入2毫升含TPCK胰蛋白酶和抗体的一倍MEM培养基。每次传代时需设置无抗体对照组。

逐步提高每次传代中抗体的浓度，直至即使抗体终浓度达到每毫升0.6毫克时，病毒仍能维持可检测的生长活性。将每次传代的上清液分装至多个冻存管中，冻存于-80摄氏度。继续按照文中的实验方案进行逃逸突变株的分离与分析。

从接种候选H7N9流感病毒疫苗的个体中分离出疫苗诱导的抗体，用于产生逃逸突变体。逃逸突变体定位结果显示，许多抗体识别病毒HA上不同位置的关键残基。以红色标示的每个残基代表单克隆抗体高效结合所必需的关键氨基酸位置，而大多数血凝抑制（HI）阳性抗体的逃逸突变残基位于先前报道的H7HA抗原位点附近。产生逃逸突变体的HI阴性抗体在茎区发生点突变。

一旦掌握，该技术可用于阐明针对其他病原体的保护性结构决定因素。该技术不仅可用于生成单克隆抗体的逃逸变异体，还可用于抗病毒化合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过体外生成逃逸变异体来阐明单克隆抗体的结合表位。

进行此操作时，务必注意在处理病毒时保持谨慎，并使用适当的个人防护设备。