Name: 趋化梯度多细胞响应的三维分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学习使用PDMS三维培养装置分析趋化梯度下多细胞类器官响应的方法。该装置无需光刻技术即可构建，适用于研究细胞在三维微环境中的定向迁移行为及弱信号检测能力。

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本工作获得了对 AJE 的资助（NSF PD-11-7246、乳腺癌研究基金会（BCRF-17-048）以及 NCI U54 CA210173）和对 AL 的资助（U54CA209992）。

所有动物实验均按照约翰斯·霍普金斯大学医学院机构动物护理和使用委员会审查并批准的方案进行。
1. 中尺度流体装置的制备
<ol>
	<li>使用 3D CAD 软件设计用于 PDMS 装置的模具掩模。</li>
	<li>使用立体光刻设备和耐热树脂打印模具。 
	注意：此处描述的步骤由商业 3D 打印服务完成。</li>
	<li>按 10:1 的比例将 PDMS 单体溶液与固化剂充分混合。制备该装置需要 3 mL PDMS 混合物。总体积取决于需制备的模具数量。</li>
	<li>在真空干燥器中使用实验室自制真空装置或真空泵抽真空 1 小时，对混合物进行脱气处理。</li>
	<li>用胶带轻拍模具表面以去除灰尘，然后将 PDMS 混合物倒入模具中。若此过程中引入气泡，需在真空干燥器中重复脱气处理。可使用尖针刺破并去除卡在模具柱状结构之间的气泡。 
	注意：室温下的脱气过程应控制在 1 小时或更短时间内完成。</li>
	<li>在 80 °C 下加热 2 小时以固化 PDMS。随后让模具在室温下冷却。</li>
	<li>用刀片切割模具与 PDMS 之间的边界，然后小心地将 PDMS 从模具上剥离。</li>
	<li>修整 PDMS 部件以适配 22 mm × 22 mm 盖玻片，并在入口处打孔。 
	注意：此步骤可作为暂停点。</li>
	<li>使用低绒布和 70% 乙醇擦拭 PDMS 部件和 22 mm × 22 mm 盖玻片表面进行清洁，然后用胶带轻拍以去除较大的灰尘颗粒。</li>
	<li>通过高压灭菌（湿法 121 °C 持续 8 分钟，干法 15 分钟）或紫外光照射 1 小时，对 PDMS 部件和盖玻片进行灭菌处理。</li>
	<li>在组织培养罩内，用等离子体放电枪对 PDMS 部件和盖玻片的底面处理 5 分钟，随后将两者键合。 
	警告：此过程中应在底部放置聚苯乙烯泡沫等非导电材料，并移除所有导电材料。处理后需在 5 分钟内立即向装置中注入胶原蛋白，以增强胶原凝胶与玻璃盖玻片之间的结合。</li>
</ol>
2. 细胞制备：原代乳腺类器官分离
注意：乳腺类器官分离的详细步骤可参见之前的研究11。任何类型的单细胞或类器官均可根据其相应的分离/解离方案进行制备。
<ol>
	<li>用手术刀将小鼠乳腺组织切碎至组织松散，然后在含有0.1 g胰蛋白酶、0.1 g胶原酶、5 mL胎牛血清（FBS）、250 μL浓度为1 μg/mL的胰岛素和50 μL浓度为50 μg/mL的庆大霉素的50 mL DMEM/F12完全胶原酶/胰蛋白酶消化液中（每只小鼠10 mL），于37 °C振荡消化30分钟。</li>
	<li>将胶原酶/胰蛋白酶消化液在1,250 × g 条件下离心10分钟，吸除上清液。用10 mL DMEM/F12重悬细胞，再次在1,250 × g 条件下离心10分钟。吸除DMEM/F12后，将细胞沉淀重悬于4 mL DMEM/F12中，并加入40 μL DNase（2单位/μL）。</li>
	<li>手动轻轻振荡DNase溶液2–5分钟，然后在1,250 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>通过四次差速离心分离类器官与单细胞（瞬时离心至1,250 × g，在达到目标转速后3–4秒内停止离心）。每次瞬时离心后，吸除上清液，并将沉淀用10 mL DMEM/F12重悬。</li>
	<li>将最终获得的沉淀细胞重悬于适量含1%青霉素/链霉素和1%胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加剂的DMEM/F12生长培养基中，用于后续胶原蛋白凝胶的制备。</li>
</ol>
3. 胶原蛋白的制备与注射
注意：其他类型的细胞外基质凝胶可根据其各自的凝胶化方案进行制备。
<ol>
	<li>在冰上准备 I 型胶原溶液（3.78 mg/mL）、10 倍浓度 DMEM、1 N NaOH 溶液和正常生长培养基。 
	注意：操作完成前需始终保持在冰上。</li>
	<li>向预冷的微量离心管中加入 6 μL 1 N NaOH 溶液、200 μL 生长培养基和 50 μL 10x DMEM，充分混匀。</li>
	<li>向预混溶液中加入 425 μL 胶原蛋白，用移液器充分混匀。</li>
	<li>短暂离心（少于5秒）胶原混合物，以分离并去除混合物中的气泡。</li>
	<li>将中和后的胶原蛋白溶液置于冰上1小时，以诱导纤维形成。</li>
	<li>将50 μL细胞悬液加入胶原混合物中，充分混匀。 
	注意：最终胶原蛋白浓度为 2 mg/mL。</li>
	<li>使用200 μL移液器通过PDMS装置的入口注入溶液，直至整个腔室充满。若胶原混合物在柱状结构间隙中溢出，待凝胶完成后，用锋利的手术刀切除多余的胶原凝胶。</li>
	<li>将装置置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中2 孵育1小时以诱导凝胶形成。</li>
	<li>用培养基填充两侧的储液槽，并将装置置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育，直至进行共聚焦成像。</li>
</ol>
4. 三维成像与定量分析
<ol>
	<li>将活细胞成像培养室安装到共聚焦显微镜上，并将温度和CO2浓度分别预设为37 °C和5%。为提高湿度，可在培养室的储水槽中加水，必要时在室内放置湿巾。</li>
	<li>将PDMS装置放入培养室中，并向其中一个储液槽加入EGF，作为形成浓度梯度的“源”；另一个储液槽则作为“汇”，用于建立空间梯度分布的EGF环境。本研究中，在“汇”中加入2.5 nM的EGF，以形成0.5 nM/mm的浓度梯度。</li>
	<li>设置Z轴堆栈的范围，确保覆盖目标类器官的整个体积，然后开始成像。 
	注意：为避免光毒性，建议在共聚焦成像时使用较低的激光强度，或采用多光子成像技术。</li>
	<li>使用商业软件或自定义程序从2D图像堆栈重建3D图像。测量从类器官延伸出的分支长度和角度，或单个细胞的迁移情况。此处可通过ImageJ软件手动勾画类器官本体的轮廓，进行定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li>
<li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+emerging+paradigms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Stem+Cell+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li>
<li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720(2015).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry+%28Palo+Alto%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li>
<li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

PDMS模具的制备可采用商业3D打印服务完成，也可通过实验室内的高端3D打印机实现。在各种3D制造方法中，推荐使用立体光刻技术（stereolithography）以获得高分辨率的模具。由于PDMS在高温（80 °C）下固化，因此打印材料应具备足够的耐热性；若外包打印服务，需明确说明此要求。可与打印服务公司协商进行热后处理，以提高部件的耐热性能。打印服务及所用材料的具体信息详见材料表。
固化后的PDMS的力学性能取决于固化温度。如果PDMS混合物在烘箱中固化前于室温下放置过久，则即使完全固化后也会变得过于弹性。因此，室温下的脱气过程应控制在1小时或更短时间内完成。脱气是指循环施加真空，有助于去除PDMS内部的任何微小气泡。
胶原蛋白溶液的pH值不仅对凝胶形成至关重要，也影响细胞活性。如果在与细胞混合前未对胶原蛋白进行中和处理，细胞活性将显著降低。用于中和胶原蛋白混合液的1 N NaOH溶液体积取决于原始胶原蛋白溶液的pH值，理论上可进行计算。然而，建议逐步将NaOH溶液加入胶原蛋白溶液中，并使...

在生理环境中，细胞嵌入于细胞外基质（ECM）中，并暴露于多种生物分子。细胞与其周围微环境之间的相互作用调控着控制多种表型的细胞内过程，包括迁移、增殖、分化和存活1,2。人们对传统二维（2D）细胞培养中的细胞行为已有较多了解。然而，随着活体成像技术的发展以及将细胞嵌入三维（3D）水凝胶中进行实验的研究进展，人们已认识到在简化的2D体外培养系统与类似组织的3D环境之间，细胞行为存在重要差异。在3D基质中，细胞可与ECM纤维相互作用并感知其力学特性，而在2D体外系统中，凝胶的材料刚度并非一个完全独立的变量。维度差异会影响黏着斑的形成，从而导致细胞形态和行为的不同。此外，位于2D表面的细胞所接收到的信号刺激少于在3D环境中可向各个方向感知信号的细胞。
这些局限性增加了人们对三维系统的需求，这类系统能够体现活体组织的空间和化学复杂性，并能更准确地预测体内组织功能。此类系统已发展出多种形式，从作为自组装细胞微结构的类器官，到随机分散在细胞外基质（ECM）中的细胞3,4。近年来微加工技术的进步推动了多种三维培养系统的发展5,6,7,8,9，用于研究表型变化以及细胞对可溶性信号的响应；然而，技术障碍限制了这些系统在研究实验室中的广泛应用。在许多情况下，器件的制备过程需要光刻技术以及软光刻相关的背景知识。此外，为成功构建器件并实现其长期稳定的功能，必须精确控制多种因素。
本方法描述了如何构建一种三维PDMS装置，用于将细胞和多细胞类器官整合到具有明确定义的趋化因子梯度的三维微环境中，并分析上皮组织对EGF10的响应。我们的研究数据显示，类器官响应微弱EGF梯度的能力源于通过间隙连接实现的细胞间化学耦合。这表明类器官在更精确地检测微弱且具有噪声的空间梯度信号方面具有潜力。该装置的制备过程无需洁净室设施或光刻技术。然而，该三维PDMS装置包含了三维生理环境所需的关键因素。该方法将有助于研究三维条件下的细胞行为，并在不同类型细胞、趋化因子及细胞外基质组合方面具有广阔的研究前景。

<table><tbody><tr><td>22 mm × 22 mm 盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 I 型胶原蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40236</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 4.2</td><td>COMSOL Inc</td><td></td><td>用于模拟扩散动力学</td></tr><tr><td>10 倍浓度 DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4623</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF 蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td></td><td></td><td>用于测量分支长度和角度</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>GIBCO&amp;nbsp;</td><td>5750-060</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-X</td><td>GIBCO&amp;nbsp;</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>低尘擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>Kimtech wipe</td><td></td></tr><tr><td>模具材料</td><td>Proto labs</td><td>Accura SL5530&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>模具打印设备</td><td>Proto labs</td><td>立体光刻（Stereolithography）</td><td>最大尺寸：127 mm × 127 mm × 63.5 mm，层厚：0.0254 mm</td></tr><tr><td>模具打印服务</td><td>Proto labs</td><td>定制</td><td>https://www.protolabs.com/</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>VWR</td><td>16777-164P</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Solamere Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>184 SIL ELAST KIT&amp;nbsp;</td><td>PDMS 试剂盒</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr></tbody></table>

趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

二维细胞培养系统存在多种局限性，这促使人们关注三维细胞培养与分析平台，此类平台能更好地模拟活体组织的空间与化学复杂性，并再现体内组织的功能。近年来，微加工技术的进步推动了三维体外环境的发展，使细胞能够被整合到明确定义的细胞外基质（ECM）以及一组特定的可溶性或基质相关生物分子中。然而，技术障碍限制了这些平台在研究实验室中的广泛应用。本文介绍一种构建简单装置的方法，用于在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中进行细胞及多细胞类器官的三维培养与实验。我们以表皮生长因子（EGF）等生长因子梯度为例，展示了该平台在分析上皮细胞和类器官对梯度响应中的应用。在装置中，EGF梯度可稳定维持数天，诱导乳腺类器官形成定向分支。通过该分析，我们得出结论：细胞群体对梯度的集体感知能力比单个细胞更敏感。我们还描述了该装置的制备方法，该方法无需光刻设备或高级软光刻技术。该方法将有助于在发育过程及包括癌症在内的病理状态分析背景下研究三维细胞行为。

表皮生长因子（EGF）是乳腺中导管分支形态发生的关键调控因子，也是引导乳腺上皮细胞在侵袭性癌症生长过程中迁移的重要趋化因子。我们利用上述介观流体装置研究细胞对特定EGF浓度梯度的响应（图1A，B）10。该装置提供的培养区域宽5 mm、长10 mm、高1 mm。培养区域的两侧通过六边形柱状结构与开放的加样孔隔开，这些柱状结构可利用表面张力将液态细胞外基质（ECM）与细胞混合物限制在细胞培养区域内。需要注意的是，鉴于该三维培养体系的尺寸，若采用光刻技术制备相应尺寸的模具，将非常困难、成本高昂且耗时10。通过创新性地应用一种常规技术——立体光刻（stereolithography），我们快速且低成本地制备出了模具。此外，通过调整设计，还可实现在芯片内产生指数梯度（图1C，i）、多重线性梯度（...

我们描述了一种用于细胞和多细胞类器官三维培养及实验的装置构建方法。该装置可实现对细胞在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号响应的分析。类器官在检测微弱且含噪声的输入信号方面优于单个细胞。

二维细胞培养系统存在多种局限性，这促使人们关注三维细胞培养与分析平台，后者能更真实地模拟细胞所处的三维空间环境及……

与简化的二维体外培养相比，三维类组织环境更能体现活体组织的空间和化学复杂性，这使得人们对三维系统的研究兴趣日益增加。该制造过程无需特殊设备或光刻技术。然而，这种三维PDMS装置包含了应用于三维生理环境所必需的结构要素。在制备中等流体装置时，使用合适的三维计算机辅助设计软件设计聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置模具的掩膜，并采用立体光刻设备结合耐热树脂打印模具。模具制备完成后，每套模具按10:1的比例将3毫升PDMS单体溶液与固化剂粗略混合，并在真空干燥器中用真空泵脱气1小时。脱气结束后，使用一片胶带清除模具表面的任何灰尘，然后小心地将脱气后的PDMS溶液注入模具中。 接下来，将PDMS在80摄氏度下固化两小时，然后让模具在室温下冷却。当模具冷却至不烫手时，使用刀片切割模具与PDMS之间的边界，并小心地将PDMS从模具上剥离。将PDMS修剪至适合22毫米×22毫米的盖玻片大小，并在入口处打孔。使用低绒毛纸巾和70%乙醇擦拭装置和盖玻片，并用一块新的粘性胶带轻拍装置，以去除任何较大的灰尘颗粒。然后将PDMS装置和盖玻片在121摄氏度下进行高压灭菌，湿热8分钟，干燥15分钟，并在组织培养罩中用等离子电晕放电枪对PDMS部件和盖玻片的底面处理5分钟，随后将两者粘合。加载装置时，首先将目标细胞重悬于适量的生长培养基中，培养基中需添加1%青霉素-链霉素和1%胰岛素-转铁蛋白-硒-X。接下来，将50微升乳腺细胞悬液与425微升 freshly prepared 中和的胶原蛋白溶液混合，用移液器吸取200微升胶原细胞悬液。将悬液通过入口注入PDMS装置，直至整个腔室充满，随后将装置置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时，以诱导凝胶形成；之后在装置两侧的储液池中加入生长培养基，并将装置放回培养箱，直至进行共聚焦成像。进行3D成像与定量分析时，将活细胞成像培养室安装至共聚焦显微镜上，并将温度和二氧化碳浓度预设为37摄氏度和5%。 向成像 chamber 的储液槽中加入水以湿润 chamber，必要时将湿巾放入 chamber 内，并将 PDMS 装置放入 chamber 中。向其中一个储液槽中加入表皮生长因子（epidermal growth factor），作为梯度形成的因子来源，另一个储液槽则作为“汇”（sink），以建立空间梯度分布的表皮生长因子环境。随后设定 Z 轴堆栈（Z stack）的范围，覆盖目标类器官的体积，并开始成像。实验结束时，使用合适的图像分析程序测量类器官延伸出的分支长度和角度，或单个细胞的迁移情况。计算机模拟和体外实验均显示，在细胞培养区域内形成了稳定的线性表皮生长因子浓度梯度，该梯度在无需补充源端或汇端储液槽的情况下可持续约两天，表明表皮生长因子（一种分子量为6.4千道尔顿的蛋白质）能够在如本实验所制备的胶原凝胶中，于相对较短的时间内形成基于扩散的稳定浓度梯度。在空间均匀分布的2.5纳摩尔表皮生长因子存在条件下，乳腺类器官在三天内形成多个分支，且无明显方向性；而当表皮生长因子以线性梯度形式添加，浓度为每毫升0.5纳摩尔时，分支行为则表现出方向依赖性。然而，分支形成表现出显著的方向性偏好。值得注意的是，添加间隙连接抑制剂会抑制类器官对浓度梯度的响应能力。胶原溶液的pH值对于凝胶化过程和细胞活力至关重要。如果在混合前胶原蛋白未被中和，则细胞活力会较低。该方法可进一步拓展，以实现更真实的组织建模，并可在凝胶内支持由单个细胞形成血管网络。

3d-analysis-of-multi-cellular-responses-to-chemoattractant-gradients

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

趋化梯度多细胞响应的三维分析

本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

本文介绍了一种分析移植细胞（躯干神经嵴细胞）迁移的方法。该方法成本低廉、操作温和，能够区分趋化性与化学趋向性，以及源自原代躯干神经嵴细胞培养中细胞间相互作用等其他因素对迁移极性的影响。...

利用改良的齐格蒙德小室法分析躯干神经嵴细胞迁移

本视频展示了使用全芯片法进行中性粒细胞趋化实验。该方法通过免疫磁珠负向筛选直接从全血中分离中性粒细胞，随后在微流控芯片上进行趋化实验。...

一种基于微流控芯片的全血快速中性粒细胞趋化分析方法

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

三维流动腔装置是一种新型装置 体外...

一种用于研究趋化因子引导细胞在生理流体条件下循环并外渗的新型三维流动腔装置

细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。...

用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

视觉趋化性检测对于深入理解真核细胞如何调控趋化剂介导的定向细胞迁移至关重要。本文中，我们详细描述了以下两种方法：1）对多个趋化性实验进行实时、高分辨率的监测；2）同时可视化中性粒细胞样HL60细胞中的趋化剂浓度梯度以及信号事件的时空动态变化。...

成像中性粒细胞样HL60细胞中G蛋白偶联受体介导的趋化作用及其信号事件

本文详细介绍了通过在单个微流控芯片上整合全血中性粒细胞分离和趋化实验，进行快速中性粒细胞趋化功能检测的方法。...

一种全芯片式快速中性粒细胞趋化分析方法：直接从一滴血样中完成检测

本文描述了评估细胞对急性机械刺激反应的方法。在基于显微镜的检测中，我们通过短暂的剪切流刺激后，观察荧光标记的生物传感器的定位变化。此外，我们还通过生物化学方法检测多种目标蛋白在急性机械刺激下的激活情况。...

Dictyostelium discoideum 对急性机械刺激反应的评估

在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。...

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

学习使用PDMS三维培养装置分析趋化梯度下多细胞类器官响应的方法。该装置无需光刻技术即可构建，适用于研究细胞在三维微环境中的定向迁移行为及弱信号检测能力。

趋化因子梯度下多细胞反应的三维分析

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