Name: 用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 了解无标记免疫沉淀质谱工作流程，用于大规模分析核蛋白相互作用。该方法结合亚细胞分级分离与质谱技术，可无偏倚地鉴定内源性蛋白相互作用伙伴，特别适用于低丰度或剂量敏感蛋白的研究。

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本工作获得了唐氏综合征琳达·克里尼克研究所向 W.M.O. 提供的大挑战基金以及 DARPA 合作协议 13-34-RTA-FP-007 的资助。我们感谢 Jesse Kurland 和 Kira Cozzolino 在阅读和评阅手稿方面所做的贡献。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的蛋白质组学工作流程为鉴定目标蛋白的高置信度相互作用蛋白提供了一种有效方法。该方法通过亚细胞组分分离降低样品复杂性，并通过稳健的样品制备、离线样品纯化以及对液相色谱-质谱（LC-MS）系统的严格质量控制，重点提高相互作用伙伴的鉴定能力。文中描述的下游数据分析方法可对与诱饵蛋白共纯化的蛋白质进行简便的统计学评估。然而，由于存在大量实验变量（如实验规模、细胞系、抗体选择），每个实验在数据可视化和富集分析方面都需要采用不同的阈值和考量因素。
在进行免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验时，首要的设计考虑是选择用于共纯化目标蛋白及其相互作用伙伴的抗体。尽管在过去几十年中，可用于人类蛋白质组研究的商业化抗体已大幅增加，但仍有许多蛋白缺乏可用的试剂。此外，某些虽已通过如Western blot检测等应用验证的抗体，可能无法在免疫共沉淀实验中有效且特异性地富集目标蛋白。在开展大规模相互作用蛋白质组学实验之前，建议先从一个90%汇合度的10 cm培养皿（或等量细胞）中进行一次免疫共沉淀，并通过Western blot检测目标蛋白的存在。如果存在多个可用于免疫共沉淀的抗体，建议选择识别蛋白不同区域表位的多个抗体。抗体与诱饵蛋白的结合可能会遮蔽其与潜在相互作用伙伴结合所必需的界面；因此，选择针对诱饵蛋白不同表位的抗体，有助于提高基于质谱实验所鉴定出的相互作用图谱的覆盖范围。
第二个主要考虑因素在于选择适当的对照，以区分高置信度相互作用与低置信度或非特异性相互作用，后者可能在与诱饵蛋白共纯化时被错误识别。对于免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验而言，最严格的对照是从该诱饵蛋白的CRISPR敲除（KO）细胞系中进行免疫沉淀。此类对照能够识别并过滤掉那些直接与抗体结合而非与诱饵蛋白结合的非特异性蛋白。当无法为每个诱饵蛋白构建CRISPR敲除细胞系时，可使用与诱饵抗体同种型匹配的IgG-磁珠对照。在使用包含多种物种来源抗体的实验中，仅使用磁珠对照可能是合适的，但这会增加将假阳性结果误判为高置信度互作蛋白的可能性。
在免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验中，细胞系的选择取决于多个关键因素。蛋白质的表达水平和亚细胞定位在很大程度上依赖于细胞类型。尽管大多数基因在常用细胞系中的RNA表达水平已有估算数据，但蛋白质表达水平与RNA表达水平的相关性较差，必须通过实验手段加以确定25。应避免使用诱饵蛋白拷贝数极低的细胞系，以防止因可能需要大幅扩大细胞培养规模而带来的困难。然而需要注意的是，样品制备方法可针对极低丰度蛋白的检测进行优化。滤膜辅助样品制备（FASP）方法虽然稳健，但可能导致样品中超过50%的肽段损失。单管固相增强样品制备（SP3）是一种高效的质谱分析样品制备方法，可最大限度减少样品损失26。SP3方法所实现的更高回收率，在本实验流程中可作为检测限附近蛋白质定量的一种有效替代方案。
该蛋白质组学工作流程已应用于多种核内诱饵蛋白，包括激酶、E3泛素连接酶以及多亚基复合物中的支架蛋白成员。在抗体试剂经过适当验证的前提下，成功实施此工作流程将能够检测到目标蛋白的高置信度核内蛋白质相互作用伙伴。

人类蛋白质组通过形成稳定的多亚基复合物和瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用，展现出广泛的结构和生化多样性。因此，在研究中为了揭示分子机制，通常需要鉴定目标蛋白质的相互作用伙伴。近年来亲和纯化方案的进步以及高分辨率快速扫描质谱仪器的出现，使得仅通过一次无偏倚实验即可轻松绘制出蛋白质相互作用图谱。
蛋白质相互作用实验方案通常采用带有亲和标签的融合构建体的异源表达系统，以鉴定蛋白质相互作用，而无需依赖能够识别目标蛋白的高质量抗体1,2。然而，基于表位标签的方法存在若干缺点。表位标签可能产生物理性相互作用，导致非特异性共纯化蛋白被检测到3。此外，将这些表位标签融合至蛋白的N端或C端可能阻碍天然的蛋白质-蛋白质相互作用，或干扰蛋白折叠，从而诱导非生理性的构象4。再者，异源表达系统通常使诱饵蛋白在超生理浓度下过表达，可能导致虚假蛋白质相互作用的鉴定，尤其对于剂量敏感型基因而言更为显著5。为避免上述问题，可在具备识别天然蛋白的高质量抗体的前提下，对内源性诱饵蛋白及其相互作用的猎物蛋白进行免疫共沉淀。
本文提供了一种相互作用蛋白质组学的工作流程，以CMGC蛋白激酶DYRK1A为例，用于检测内源性蛋白的细胞核相互作用组。DYRK1A的拷贝数、活性水平或表达水平的紊乱可导致人类严重的智力障碍，并在小鼠中引起胚胎致死性6,7,8,9。DYRK1A表现出动态的时空调控特性10，以及区室化的蛋白质相互作用11,12，因此需要能够检测在不同亚细胞区室中特异存在的低丰度相互作用蛋白的技术方法。
本方案采用人源HeLa细胞的细胞质与核质组分分离、免疫沉淀、质谱样品制备，以及生物信息学分析流程的概述，用于评估数据质量并可视化结果，同时提供R语言脚本用于数据分析与可视化图1). 本工作流程中使用的蛋白质组学软件包均可免费下载，或可通过网络界面访问。有关软件和计算方法的更多详细信息，可通过提供的链接获取深入的教程和操作指南。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，0.1% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 低吸附微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>丙酮（HPLC级）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k 滤膜柱</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>氯乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>透析袋封口夹</td><td>Caroline Biological Supply Company</td><td>684239</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47724</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>887845</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HeLa QC 胰蛋白酶消化液</td><td>Pierce</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1692630</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>KONTES Dounce 匀浆器 7 ml</td><td>VWR</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 大间隙研杵</td><td>VWR</td><td>KT885301-0007</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酰内肽酶 C</td><td>VWR</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>微囊藻毒素</td><td>enzo life sciences</td><td>ALX-350-012-C100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>p84 抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BSA 蛋白消化液，质谱级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88341</td><td>LCMS 质控</td></tr><tr><td>Pierce C18 离心柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-89873</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 胰蛋白酶，质谱级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td>用于质谱样品制备</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0780-01</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>石英毛细管喷针头</td><td>Pico TIP</td><td>FS360-20-10</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 小间隙研杵</td><td>VWR</td><td>KT885302-0007</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 8 kDa 24 mm 透析袋</td><td>Thomas Scientific</td><td>3787K17</td><td></td></tr><tr><td>TC 培养皿 150，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td>贴壁细胞用组织培养皿</td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82080</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters ACQUITY UPLC M-Class 反相色谱柱 1.7&amp;micro;m 球形杂化颗粒（1.7 &amp;micro;m，75 &amp;micro;m x 250 mm）</td><td>Waters</td><td>186007484</td><td>纳流 C18 色谱柱</td></tr></tbody></table>

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

免疫亲和纯化质谱法（IP-MS）已成为一种强大的定量方法，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。本文介绍了一种完整的相互作用蛋白质组学工作流程，旨在从细胞核中鉴定低丰度的蛋白质-蛋白质相互作用，该流程也可应用于其他亚细胞区室。该工作流程包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、样品制备、离线纯化、单次无标记质谱分析以及下游的计算分析和数据可视化。我们的方案经过优化，可通过从分级分离的亚细胞区室中对内源性蛋白质进行免疫沉淀，检测那些在全细胞裂解液中难以鉴定的区室化、低丰度相互作用（例如细胞核中的转录因子相互作用）。本文所述的样品制备流程提供了详细的HeLa细胞核提取物制备、内源性诱饵蛋白的免疫亲和纯化以及定量质谱分析的操作说明。我们还讨论了在基于质谱的相互作用谱型分析实验中进行大规模免疫沉淀的方法学考量，并提供了评估数据质量的指南，以区分真实的蛋白质相互作用与非特异性结合。本文以研究CMGC激酶DYRK1A的细胞核相互作用组为例展示了该方法的应用，DYRK1A是一种在细胞核内相互作用尚不明确的低丰度蛋白激酶。

在免疫共沉淀-质谱（IP-MS）实验中，所鉴定出的蛋白质质量大部分来源于非特异性结合蛋白。因此，IP-MS实验的关键挑战之一在于区分高置信度相互作用蛋白与非特异性结合蛋白。为展示评估数据质量所使用的关键参数，本研究利用仅含磁珠的对照组，对5 mg HeLa细胞核提取物进行了三份重复的免疫共沉淀实验。确保IP-MS实验可靠性的首个内部检验标准是：诱饵蛋白是否在对照组基础上，以其变化倍数（fold-change）和SAINT概率均被鉴定为富集程度最高的蛋白之一。在本例中，诱饵蛋白DYRK1A在对照组之上的富集蛋白中排名前三图 2A,B). 在一项利用四种独立抗体对DYRK1A进行的核相互作用组研究中，采用FC-A阈值 &gt;3.00 和 SAINT 概率截断值 &gt;0.7 提供了一个严格的阈值，用于鉴定新发现的和先前已验证的相互作用蛋白22在应用于本实验时，高置信度互作蛋白与 &gt;95%的共纯化蛋白被鉴定为非特异性图2A,B). 同时应用倍数变化富集阈值和概率阈值，可通过要求蛋白质鉴定结果在生物学重复样本中 consistently 高度富集，从而提高筛选的严格性。
除了统计学评分外，CRAPome 分析流程还将先前报道的相互作用映射到诱饵-猎物数据上23尽管这种映射对于区分高置信度和低置信度相互作用具有参考价值，但先前报道的相互作用在FC-A和SAINT概率评分中可能得分较低，这可能表明特定诱饵蛋白的许多已知相互作用仅存在于特定的细胞类型、生物学环境或细胞器中。以DYRK1A数据集为例，iREF互作蛋白的FC-A值低至0.45，表明相对于对照组的富集程度极低（图2C). 为避免假阳性结果的膨胀，统计学阈值的设定应优先考虑严格性，而非减少假阴性。需要注意的是，这些相互作用的检测与蛋白质丰度无关。图 2C). 在HeLa细胞中，每种iREF相互作用的计算绝对拷贝数与通过IP-MS检测到的相互作用伙伴的检测水平无相关性24.
Cytoscape 是一种用于可视化多层相互作用数据的有效工具19在本实验所述的DYRK1A免疫沉淀实验中，联合使用FC-A &gt; 3.0 和 SAINT &gt; 0.9 将高置信度互作蛋白的列表缩减至六种蛋白（图2D). 然而，当应用 FC-A 截断值时 &gt; 在分离的3.0中，向网络中额外添加了八种蛋白质。这些新增的蛋白质互作分子与网络中已有的互作分子具有较高的连接性，提示它们可能参与相似的复合物或发挥类似的功能作用。为此，来自STRING-DB的蛋白质-蛋白质相互作用证据以蓝色虚线形式整合入该网络中20尽管这种单诱饵、三重复实验仅提供了DYRK1A完整相互作用网络的有限样本，但通过使用额外的诱饵、增加重复次数以及整合大型公共数据集，可进一步扩展高置信度相互作用网络。因此，统计学阈值将针对每个独立实验而有所不同，需进行充分评估。
<img alt="核提取物实验流程示意图；免疫沉淀、质谱分析、数据分析、蛋白质研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：亚细胞免疫沉淀-质谱（IP-MS）的代表性蛋白质组学工作流程。细胞在4 L圆底烧瓶或15 cm组织培养皿中培养，并同时收获用于亚细胞分级分离。细胞被分离为胞质组分、核组分和核沉淀物，使用一种或多种识别相同目标蛋白的抗体，从1−10 mg核裂解物中进行免疫沉淀。在单次进样质谱分析之前，进行滤膜辅助样品制备（FASP）和离线样品纯化。后续的计算分析流程用于将原始数据处理为可解释的相互作用数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用DYRK1A进行蛋白质相互作用分析；蛋白质数据的图表、散点图和网络图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：单诱饵单抗体IP-MS实验的代表性数据。（A）使用针对激酶DYRK1A的单一抗体进行优化实验（n = 3）后，通过CRAPome分析流程获得的FC-A和SAINT概率输出结果。以仅珠子对照组作为比较。红色实线表示设定的阈值：FC-A > 3.00 且 SAINT > 0.7。（B）MaxQuant输出的蛋白质丰度估计值（iBAQ）与DYRK1A免疫沉淀组相对于对照组的蛋白质丰度log2比值的关系图，颜色根据对无标记强度进行经验贝叶斯分析所得的校正p值范围标注。（C）在iRef数据库中列为相互作用蛋白的蛋白质的FC-A值与其估计拷贝数的关系23,24。（D）DYRK1A相互作用蛋白的Cytoscape网络可视化图。蓝色节点：FC-A > 3.00 且 SAINT > 0.7；橙色节点：FC-A > 3.00；黑色边线：在IP-MS实验中鉴定出的相互作用蛋白；蓝色虚线边：猎物蛋白之间的SAINT相互作用（置信度 > 0.150）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">蛋白酶抑制剂（PI）混合物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Metabisulfite</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>0.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">磷酸酶抑制剂（PhI）混合物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin LR</td>
			<td>1 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">亚细胞分级缓冲液：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">缓冲液 A pH 7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">缓冲液 B pH 7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">缓冲液 C pH 7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">免疫沉淀缓冲液：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">IP 缓冲液 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">IP 缓冲液 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">SDS 烷基化缓冲液 pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">* 使用 HPLC 级 H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：缓冲液组成
补充编码文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。

免疫亲和纯化质谱法（IP-MS）已成为一种强大的定量方法，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用。

该蛋白质组学工作流程能够无偏倚地鉴定并绘制内源性蛋白质-蛋白质相互作用，且具有亚细胞分辨率。在研究对剂量敏感、丰度较低或具有多种亚细胞定位的诱饵蛋白时，该技术尤为有利。只要存在合适的亲和试剂，该方法即可用于绘制内源性蛋白质相互作用图谱。这对于数千种功能未知的蛋白质尤为重要，其中许多蛋白质已被发现与人类疾病相关。该方法可适用于任何可进行亚细胞分级分离的细胞系或组织。只要有合适的亲和试剂，任何蛋白质均可作为靶标进行研究。亲和纯化实验的常见结果往往是无结果。使用高质量的试剂、全程收集质量控制数据以及尽量减少样品操作都至关重要。务必确认你拥有有效的样品。首先，在含有蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂的冰冷缓冲液A（1X体积）中解冻制备好的细胞沉淀，持续15分钟。将含有细胞沉淀的离心管置于4°C的旋转摇床（nutator）上，助溶30分钟。然后将离心管放入离心机，在2,000 × g、4°C条件下离心10分钟，以收集沉淀。弃去上清液，用5倍于压紧细胞体积的缓冲液A重悬细胞，在冰上孵育20分钟。接着，在2,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，再次收集沉淀。弃去缓冲液，用含有蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂的2倍原始压紧细胞体积的缓冲液A重悬细胞。用松散的A型研杵上下研磨约七次。将裂解液在2,000 × g、4 °C条件下离心10分钟。小心将上清液转移至新管中，并用液氮速冻。将裂解液于-80 °C保存。用相当于沉淀体积0.9倍的含蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂的缓冲液B重悬沉淀，并在4°C下于旋转摇床中孵育5分钟。为裂解细胞核，使用B型研杵上下研磨20次。将核裂解物在4°C下置于旋转摇床上混合30分钟，使其均匀。然后在4°C下以21,000 × g离心30分钟。用移液器吸除上清液，并作为可溶性核蛋白提取物保存。为对可溶性核提取物进行透析，首先剪取适当长度的宽度为24毫米、截留分子量为8千道尔顿的透析管。夹紧透析管一端，将核浆样品加入透析管中。加入裂解液后，夹紧另一端并浸入含有蛋白酶抑制剂的缓冲液C的洁净玻璃容器中。在4°C下透析三小时。随后，将透析后的核提取物核浆转移至离心管中，在4°C条件下以21,000 × g离心30分钟。取三份20微升的核提取物，分别转移至新的微量离心管中，用于通过蛋白质印迹法验证分步分离效果。使用尖端已被剪切的移液器吸头，在微量离心管中为每个重复样品制备蛋白A/G磁珠混合物，将12.5微升蛋白A Sepharose与12.5微升蛋白G Sepharose混合。用300微升免疫沉淀缓冲液I将蛋白A/G磁珠混合物洗涤两次，于4°C、1,500 × g条件下离心1分钟，弃去上清液。接下来，准备抗体蛋白A/G磁珠。为将抗体与磁珠结合，向离心管中加入300微升IP缓冲液I和10微克目标抗体。将磁珠-抗体混合物置于4摄氏度的旋转摇床中孵育过夜。现在将核裂解液分装至低吸附的微量离心管中，每份加入相当于1毫克蛋白质的体积。在16,000 × g离心30分钟，将上清液转移至新管中。每毫克核裂解液加入1微升浓度为250单位/微升的苯甲酸酶，在4°C下于旋转仪上孵育10至15分钟。为准备用于预清除裂解液的磁珠，将12.5微升蛋白A和蛋白G磁珠分别加入1.5毫升低吸附离心管中。用含蛋白酶抑制剂的IP洗涤缓冲液I洗涤两次。弃去上清液，向磁珠中加入1毫克预先制备的核裂解液。在4°C条件下，于旋转摇床（nutator）上孵育一小时。将预清除的裂解液在4°C、1,500 × g 条件下离心一分钟。随后用含有蛋白酶抑制剂的IP缓冲液I洗涤抗体蛋白A或G磁珠两次。在4°C、1,500 × g条件下离心1分钟后，倾去上清缓冲液。将预清除的核裂解液转移至抗体蛋白A或G磁珠中，在4°C下于旋转摇床中孵育4小时。孵育结束后，在4°C条件下以1,500 × g离心1分钟。将上清液转移至预先标记为“流穿液”的离心管中，每个重复样本分别收集。用含蛋白酶抑制剂的1毫升IP缓冲液II洗涤抗体蛋白A或G磁珠4次。然后用一毫升含有蛋白酶抑制剂的IP缓冲液I洗涤磁珠两次。最后一次洗涤后，确保完全去除所有缓冲液。将磁珠与20微升pH为2.75的0.1摩尔甘氨酸溶液在旋转仪上孵育30分钟，以洗脱结合的蛋白。然后在750 × g、4 °C条件下离心1分钟，用移液器吸除上清液。用洗脱缓冲液再次重复此孵育步骤一次。蛋白沉淀制备完成后，加入30 µL SDS烷基化缓冲液重悬。将样品置于95摄氏度的金属浴中孵育5分钟，随后在室温下冷却15分钟。向每个样品中加入300毫升UA溶液和30微升100毫摩尔TCEP。将溶液上样至30K离心过滤器中。在室温下以21,000 × g离心10分钟后，保留滤过液，以防过滤器出现问题。根据文稿要求清洗过滤器后，加入3 µL浓度为1 µg/µL的溶菌酶C，该溶菌酶C重悬于0.1摩尔Tris（pH 8.5）中。用 0.1 摩尔 Tris（pH 8.5）将滤芯填充至 100 微升刻度线处。在 37 摄氏度下于旋转摇床中孵育 1 小时进行消化。随后，加入 1 微升浓度为 1 微克/微升的质谱级胰蛋白酶。轻轻混匀，将胰蛋白酶与样品在37摄氏度下于旋转摇床上孵育过夜。次日早晨，以21,000 × g离心20分钟，多次重复此步骤，以将肽段从滤膜中洗脱至洁净的低吸附微量离心管中。使用C18离心柱对肽段进行脱盐后，将冻干的肽段重新溶解于7微升含0.1%三氟乙酸（TFA）和5%乙腈的溶液中。将样品超声处理三分钟，以确保肽段已充分重悬，然后在14,000 × g离心10分钟。取样品的15%至30%上样至液相色谱-质谱系统进行分析。本研究中，使用仅含磁珠的对照，从五毫克HeLa细胞核提取物中进行了三次重复的免疫沉淀分析。诱饵蛋白DYRK1A在富集蛋白中排名前三，高于对照组，表明所进行的IP-MS实验结果可靠。高置信度互作蛋白与共纯化蛋白之间表现出明显分离，超过95%的共纯化蛋白被鉴定为非特异性结合蛋白。以DYRK1A数据集为例，IREF相互作用伴侣的FC-A值低至0.45，表明相对于对照组富集程度极低。因此，许多先前报道的相互作用在此数据集中因低于FC-A三倍的阈值而成为假阴性结果。每个IREF相互作用计算出的绝对拷贝数与通过IP-MS检测到的相互作用伴侣的检测水平之间未显示出相关性。联合使用FC-A大于三倍且SAINT评分大于0.9的筛选条件，将高置信度互作蛋白的列表缩减至六个蛋白。然而，当单独应用FC-A截断值大于三的条件时，网络中额外增加了八种蛋白质。本方案最关键的步骤是选择用于免疫沉淀的抗体试剂。建议在完成此工作流程之前，通过Western印迹或考马斯亮蓝染色验证抗体的选择性。通过已鉴定的相互作用蛋白进行免疫共沉淀（co-IP）和蛋白质印迹（western blotting），可以获得蛋白-蛋白相互作用的支持性证据。尽管更为复杂，蛋白质化学交联技术却能够揭示相互作用蛋白的结合区域。利用该方法，我的研究团队发现了DYRK1A的新功能，这是一种对哺乳动物大脑发育至关重要的蛋白激酶，且与阿尔茨海默病的神经病理学相关。

label-free-immunoprecipitation-mass-spectrometry-workflow-for-large

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

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利用 HaloTag 技术发现蛋白质相互作用并表征蛋白质功能

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