Name: 生物灵感软机器人与合并微电极 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习利用水凝胶制造电控生物启发软体机器人的方法，通过集成柔性微电极实现实时刺激与精确调控。该技术为心脏再生和细胞构建物的局部电刺激研究提供了新平台。

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本论文由美国国立卫生研究院（R01AR074234、R21EB026824、R01 AR073822-01）、布里格姆研究所 Stepping Strong 创新奖以及美国心脏协会创新项目奖（19IPLOI34660079）资助。

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获布里格姆妇女医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. GelMA 的合成
<ol>
	<li>使用磁力搅拌器在 50 °C 下将 10 g 明胶溶解于 100 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中。</li>
	<li>在 50 °C 下持续搅拌明胶预聚物溶液，缓慢加入 8 mL 甲基丙烯酸酐，反应 2 小时。用预热至 50 °C 的 DPBS 稀释反应后的明胶溶液。</li>
	<li>将稀释后的溶液转移至透析膜（截留分子量 = 12–14 kDa）中，并置于去离子水（DI 水）中。在 40 °C 下透析约 1 周。</li>
	<li>使用无菌滤器（孔径 = 0.22 µm）过滤透析后的 GelMA 预聚物溶液，将 25 或 30 mL 溶液转移至 50 mL 离心管中，并于 -80 °C 保存 2 天。</li>
	<li>将冷冻的 GelMA 预聚物溶液使用冷冻干燥机冻干 5 天。</li>
</ol>
2. 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）预聚物溶液的制备
<ol>
	<li>将200 mg（总溶液的20%）PEGDA（分子量 = 1,000）与5 mg（总溶液的0.5%）2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮（光引发剂，PI）溶解于1 mL DPBS中。</li>
	<li>将预聚物溶液在80 °C下孵育5分钟。</li>
</ol>
3. GelMA包被的CNT分散储备液的制备
<ol>
	<li>将80 mg的GelMA（用作生物表面活性剂）溶解于4 mL DPBS中，然后向GelMA预聚物溶液中加入20 mg羧基功能化的多壁碳纳米管（MWCNTs）。</li>
	<li>对含有MWCNTs的GelMA预聚物溶液进行1小时的超声处理（0.66 Hz，100 瓦）。 
	注意：超声过程中，需将溶液浸入约15 °C的水浴中，以防止因温度升高导致溶剂蒸发。</li>
</ol>
4. 含5% GelMA预聚物的1 mg/mL CNT溶液的制备
<ol>
	<li>在 80 °C 下，将 50 mg GelMA 和 5 mg（总溶液的 0.5%）PI 溶于 0.8 mL DPBS 中，持续 10 分钟。</li>
	<li>加入 0.2 mL 预先制备的 CNT 储存液（步骤 3）。涡旋混匀，并在 80 °C 下孵育溶液 10 分钟。</li>
</ol>
5. 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（TMSPMA）包被玻片的制备
<ol>
	<li>用纯乙醇清洗载玻片（厚度 = 1 mm，尺寸 = 5.08 cm x 7.62 cm）。</li>
	<li>将清洗后的载玻片垂直叠放在250 mL烧杯中，用移液器在载玻片上均匀滴加3 mL TMSPMA。用铝箔覆盖烧杯，防止TMSPMA挥发。</li>
	<li>将载玻片置于80 ˚C烘箱中孵育1天。</li>
	<li>将涂覆后的载玻片浸入纯乙醇中清洗，然后干燥。</li>
	<li>将涂覆后的载玻片用铝箔包裹，于室温（RT）保存。 
	注意：尽量避免接触TMSPMA涂层载玻片的表面。</li>
</ol>
6. 柔性金微电极的制备
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计软件设计遮蔽掩模（补充文件 3）。</li>
	<li>制备并采购遮蔽掩模。</li>
	<li>用丙酮清洗载玻片（厚度 = 1 mm，尺寸 = 3 cm × 4 cm），并用压缩空气枪吹干。</li>
	<li>使用双面胶带将遮蔽掩模固定在玻璃基底上，然后将其放入电子束蒸发仪中，等待腔室压力降至至少 10-6 Torr。 
	注意：将两段胶带手动粘贴在支架上，间距应足够容纳玻璃片，同时又足够大以覆盖整个图案区域。此步骤耗时约 45–60 分钟。</li>
	<li>通过电子束蒸发仪沉积一层 200 nm 厚的金（Au）薄膜（例如，使用 Denton EE-4 设备，真空度 = 10-6 Torr，功率 = 2.6%，沉积速率 = 2 Å/s），然后使用划片机切割制备的微电极（电极尺寸 = 7.38 mm × 8.9 mm × 200 nm）。</li>
</ol>
7. 金微电极集成的微图案化多层水凝胶支架的制备
注意：该步骤的最终结果是形成一种复合膜，其中底部为微图案化的 PEGDA 水凝胶层，顶部为微图案化的 CNT-GelMA 水凝胶层，而金微电极位于两层之间。这种结构设计可提高电极的柔韧性，并降低断裂风险。
<ol>
	<li>设计并制备两块光掩模，用于制作微图案化的 PEGDA（1st 光掩模）和 CNT-GelMA 水凝胶（2nd 光刻掩模）层。参见 补充文件 2–3可以使用CAD软件进行设计。 
	注意：参见 图2B，E.</li>
	<li>在经 TMSPMA 涂层处理的玻璃上放置由单层商用隐形胶带（厚度：50 μm）制成的 50 μm 间隔层。在 TMSPMA 涂层玻璃上加入 15 μL 的 20% PEGDA 预聚物溶液，然后覆盖金微电极。将用于载玻片的第一张光掩膜（微图案化 PEGDA）置于金微电极上方，并将整个装置置于紫外光下（200 W 汞蒸气短弧灯，配备 320–390 nm 滤光片），在 800 mW 强度、8 cm 距离下照射 110 秒。 
	注意：参见 图1A.</li>
	<li>加入DPBS，5–10分钟后小心地将微图案化PEGDA水凝胶连同金微电极从非涂层玻璃基底上剥离，并用玻璃载玻片承载，从而获得带有微图案化PEGDA水凝胶及金微电极的玻璃载玻片。 
	注意：参见 图1B由于TMSPMA涂层的存在，将结构从未涂层的玻璃基底转移至TMSPMA涂层基底。此步骤中需小心分离，因为金微电极容易断裂。图3).</li>
	<li>在培养皿底部放置由两层商用透明胶带（厚度为50 μm）堆叠制成的100 μm间隔物。在间隔物之间滴加20 μL CNT-GelMA预聚物溶液，然后将7.3步骤中获得的载玻片翻转并用胶带固定在培养皿上。</li>
	<li>将设备翻转至底部朝上，并放置好 2nd 置于载玻片上方的光掩模。在800 mW强度、8 cm距离下，用紫外光照射200秒。 
	注意：参见 图1C第二步掩模的对准非常重要。</li>
	<li>用DPBS和含10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基洗涤所得支架。</li>
	<li>在37 °C培养箱中过夜，然后接种细胞。</li>
</ol>
8. 新生大鼠心肌细胞的分离与培养
<ol>
	<li>根据研究所动物护理委员会批准的方案，分离2日龄Sprague-Dawley大鼠的心脏8。</li>
	<li>将心脏组织置于含有0.05%不含EDTA的胰蛋白酶的HBSS溶液中，在4°C冰箱内过夜（约16小时）并置于摇床上振荡。</li>
	<li>用移液枪收集心脏组织，尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后将其转移至50 mL离心管中，加入10 mL预热的心脏培养基（含10% FBS、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺）。</li>
	<li>在37 °C水浴中缓慢摇动（约60 rpm）7分钟。用10 mL移液器小心吸去管内培养基，保留心脏组织于管中。</li>
	<li>加入7 mL含0.1% II型胶原酶的HBSS溶液，在37 °C水浴中摇动10分钟。</li>
	<li>用10 mL移液器轻柔吹打10次以分散心脏组织，然后用1 mL移液器吸除管内液体。</li>
	<li>加入10 mL含0.1% II型胶原酶的HBSS溶液，在37 °C水浴中快速摇动（约120–180 rpm）10分钟，随后检查心脏组织是否已充分消化。</li>
	<li>先用10 mL移液器吹打混匀，再用1 mL移液器继续吹打，以彻底分散残留的心脏组织块。</li>
	<li>当溶液呈现均一状态时，将70 µm细胞筛置于新的50 mL离心管上，逐次以1 mL为单位将溶液经筛网过滤转移。</li>
	<li>将心肌细胞悬液在37 °C条件下以180 × g离心5分钟。 
	注意：若仍有未完全溶解的心脏组织或黏性物质，请重复步骤8.7–8.9。</li>
	<li>小心吸除细胞沉淀上方所有液体，并用2 mL心脏培养基重悬细胞。</li>
	<li>沿管壁缓慢加入2 mL心脏培养基，轻轻吹打使细胞重悬，避免损伤细胞。</li>
	<li>将重悬的细胞逐滴加入含有预热心脏培养基的T175培养瓶中，放入37 °C培养箱孵育1小时，使心脏成纤维细胞贴附于瓶底。 
	注意：在此预贴壁步骤中，心脏成纤维细胞会贴壁，而心肌细胞则保留在悬浮液中。</li>
	<li>收集含有心肌细胞的培养基，转移至50 mL离心管中。</li>
	<li>进行细胞计数后，在37 °C条件下以260 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬后，逐滴接种至第7步制备的柔性机器人表面。将浓度为1.95 × 106 个细胞/mL的心肌细胞悬液按特定体积均匀滴加至装置整个表面。</li>
	<li>将样品置于37 °C培养箱中孵育。接种后第1天和第2天，更换为含2% FBS和1% L-谷氨酰胺的5 mL细胞培养基。每次培养基颜色发生变化时均需及时更换。</li>
</ol>
9. 用于取向分析的细胞染色
<ol>
	<li>在室温下用 DPBS 洗涤 5 分钟，去除培养基。</li>
	<li>在室温下使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 20 分钟，然后在室温下用 DPBS 洗涤 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用含 0.1% Triton 的 DPBS 孵育细胞 1 小时，再于室温下用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在室温下用含 10% 正常山羊血清的 DPBS 孵育细胞 1 小时。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，用含 10% 正常山羊血清的 DPBS 中的初级抗体（肌节性 α-actinin 和连接蛋白-43）孵育细胞约 14–16 小时。</li>
	<li>在室温下用 DPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟；然后在室温下用含 10% 正常山羊血清的 DPBS 中的二抗孵育细胞 1 小时。</li>
	<li>在室温下用 DPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟；随后在室温下用去离子水中稀释 1:1,000 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行复染 10 分钟，再于室温下用 DPBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>使用倒置激光扫描共聚焦显微镜采集荧光图像。</li>
</ol>
10. 执行器测试与行为评估
<ol>
	<li>软体机器人上心肌细胞的自发搏动
	<ol>
		<li>将仿生驱动器在 37 °C 下孵育 5 天，并在第 1 天和第 2 天以及必要时（即培养基变黄时）更换培养基。使用倒置光学显微镜每天拍摄图像（5x 和/或 10x）。当收缩活动开始时（通常在第 3 天左右），使用显微镜实时窗口的视频采集软件以每秒 20 帧的速度录制 30 秒的细胞运动（5x 和/或 10x）。</li>
		<li>第 5 天，用盖玻片轻轻从边缘抬起，使膜脱离。 
		注意：如果细胞表现出强烈的搏动行为，由于收缩的机械作用，膜会自行脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整体电刺激
	<ol>
		<li>使用间距为 3 cm 的 PDMS 作为支架，在盛有心肌细胞培养基的 6 cm 培养皿中固定两根带有铂（Pt）导线的碳棒电极。然后将软体机器人小心转移至培养皿中。</li>
		<li>施加脉宽为 50 ms、直流偏置值为 0 V、峰值电压幅度在 0.5 至 6 V 之间的方波信号。频率分别设置为 0.5、1.0 和 2.0 Hz，占空比分别为 2.5%、5% 和 10%。使用 commercially available 相机记录宏观尺度的收缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用金微电极进行电刺激
	<ol>
		<li>在制备集成金微电极的多层水凝胶支架后，通过外部方形接口使用银浆将两根铜导线连接至金电极。</li>
		<li>用在 80 °C 预固化 5 分钟的 PDMS 薄层覆盖银浆。然后将样品置于 45 °C 的加热板上加热 5 小时，以使 PDMS 完全交联。</li>
		<li>接种心肌细胞后，在铜导线上施加直流偏置值为 1 V、峰值电压幅度在 1.5 至 5 V 之间、频率分别为 0.5、1.0 和 2.0 Hz 的方波电刺激。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+jellyfish+with+biomimetic+propulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 792-797 (2012).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototactic+guidance+of+a+tissue-engineered+soft-robotic+ray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray.</a> Science. 353 (6295), 158-162 (2016).</li>
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<li>Alapan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+erythocyte-based+bacterial+microswimmers+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Robotics%22%5BJournal%5D)">Soft erythocyte-based bacterial microswimmers for cargo delivery.</a> Science Robotics. 3 (17), 4423(2018).</li>
<li>Magdanz, V., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Sperm-Flagella+Driven+Micro-Bio-Robot%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Development of a Sperm-Flagella Driven Micro-Bio-Robot.</a> Advanced Materials. 25 (45), 6581-6588 (2013).</li>
<li>Rus, D., Tolley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+fabrication+and+control+of+soft+robots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design, fabrication and control of soft robots.</a> Nature. 521 (7553), 467-475 (2015).</li>
<li>Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+muscle-based+actuators+for+self-stabilizing+swimming+biorobots%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots.</a> Lab Chip. 16 (18), 3473-3484 (2016).</li>
<li>Shin, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+Carbon+Nanotube%E2%80%93Based+Flexible+Gel+Substrates+for+Engineering+Biohybrid+Tissue+Actuators%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Aligned Carbon Nanotube–Based Flexible Gel Substrates for Engineering Biohybrid Tissue Actuators.</a> Advanced Functional Materials. 25 (28), 4486-4495 (2015).</li>
<li>Shin, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-nanotube-embedded+hydrogel+sheets+for+engineering+cardiac+constructs+and+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon-nanotube-embedded hydrogel sheets for engineering cardiac constructs and bioactuators.</a> ACS Nano. 7 (3), 2369-2380 (2013).</li>
<li>Shin, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+Driven+Microengineered+Bioinspired+Soft+Robots%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electrically Driven Microengineered Bioinspired Soft Robots.</a> Advanced Materials. 30 (10), 1704189(2018).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulating+cardiac+muscle+by+light%3A+cardiac+optogenetics+by+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (5), 753-760 (2011).</li>
<li>Shin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+Nanotube+Reinforced+Hybrid+Microgels+as+Scaffold+Materials+for+Cell+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon Nanotube Reinforced Hybrid Microgels as Scaffold Materials for Cell Encapsulation.</a> ACS Nano. , (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通过该方法，我们成功制备了一种类似蝠鲼的仿生软体机器人，其具有多层结构支架，并在支架上集成了由嵌入式金微电极控制的自驱动心肌组织。由于采用了由PEGDA和CNT–GelMA水凝胶构成的两种不同微图案化水凝胶层，该仿生支架表现出良好的机械稳定性以及理想的心肌细胞排列与成熟效果。其中，PEGDA图案层模拟了鳐鱼骨骼结构中的软骨关节，为整个机器人本体提供机械支撑。具体而言，该层在心肌组织收缩与舒张过程中维持了机械稳定性，同时因其能够在收缩后释放膜张力，从而促进高效搏动。此外，微电极的纳米级厚度（200 nm）及其蛇形结构使其具备足够的柔韧性，不会阻碍或影响心肌组织的收缩行为（图2）。为了在不造成任何断裂的情况下将微电极轻松转移至水凝胶表面，金微电极在玻璃基底上制备时未使用钛等常见的粘附层，从而实现了易于剥离的弱粘附特性。与此同时，CNT-GelMA层为心肌细胞的附着与定向排列提供了支持，其图案方向与PEGDA水凝胶层的图案方向相互垂直（图3）。在细胞成熟后，顶层的心肌细胞为整个支架提供了自驱动能力。通过对外置的金质柔性微电极...

现代最先进的软体机器人能够模拟多种生物体的层级结构和肌肉动力学特性，例如水母1,2、蝠鲼2、章鱼3、细菌4和精子5。模仿自然系统的动力学行为与结构架构，可在能量效率和结构效率方面实现更优的性能表现6。这本质上与天然组织的柔软特性相关（例如，杨氏模量介于104−109 Pa之间的皮肤或肌肉组织），相较于传统的工程化驱动器（例如，杨氏模量通常在109−1012 Pa之间），天然组织具有更高的自由度以及更优异的变形能力和适应性6。特别是基于心肌组织的软驱动器，由于具备自驱动能力，并且相较于机械驱动的机器人系统，还具有自我修复和再生的潜力，因而表现出更优越的能量效率7。然而，软体机器人的制造面临挑战，原因在于需要将具有不同物理、生物和机械特性的多种组分集成于单一系统之中。例如，人工合成系统需要与活体生物系统整合，不仅要为其提供结构支撑，还需影响并调控其驱动行为。此外，许多微加工方法依赖于严苛或具有细胞毒性的工艺和化学试剂，这会降低任何活体组分的存活率和功能活性。因此，亟需开发新的方法以增强软体机器人的功能性，并实现对其行为的有效控制与调节。
为了成功整合具有高活性的生物组分，基于水凝胶的支架是构建软体机器人本体的优良材料。水凝胶的物理和力学性能易于调控，可为肌肉组织等活体组分构建适宜的微环境8,9。此外，水凝胶还可兼容多种微加工技术，从而高保真地构建出具有层级结构的复杂构型1,2,10。柔性电子器件可被集成到软体机器人中，通过电刺激来控制其行为。例如，已有研究利用光遗传学技术改造具有电活性的细胞（如心肌细胞），这些细胞可在光照下产生电生理响应，并据此开发出一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的光控软体机器水母，可在体外模拟鱼类的波动式运动2。尽管光遗传学技术展现出优异的可控性，但本研究采用的是电刺激这一传统且常规的刺激方法。这是因为通过柔性微电极进行电刺激相比光遗传学技术更为简便，后者需要复杂的构建流程11。柔性电子器件的使用不仅可实现长期刺激和标准化、简化的制备工艺，还可调控其生物相容性以及物理和力学性能12,13。
本文介绍一种创新方法，用于制造一种受生物启发的软体机器人，该机器人由工程化心肌组织的搏动驱动，并通过嵌入的柔性金微电极进行电刺激控制。该软体机器人的设计模仿了 sting ray（黄貂鱼）的肌肉和软骨结构。相较于其他游泳物种，黄貂鱼具有相对易于模仿的结构和运动方式。肌肉部分通过在导电水凝胶微图案上接种心肌细胞而在体外重建。如先前研究所述，在 GelMA 水凝胶中引入导电纳米颗粒（如 CNT）不仅可改善心肌组织的电耦合性能，还能诱导形成优良的体外组织架构与排列8,9。随后，利用机械强度高的 PEGDA 水凝胶图案模拟软骨关节，作为整个系统的力学支撑基底。具有蛇形结构的柔性金微电极被嵌入 PEGDA 图案中，以实现对心肌组织的局部电刺激。

<table><tbody><tr><td>250 mL 烧杯</td><td>PYREX</td><td>1000-250CNEa</td><td></td></tr><tr><td>2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Millipore</td><td>M6514</td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg; 水浴锅</td><td>VWR</td><td>W6M</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>80&amp;deg; 培养箱</td><td>VWR</td><td>1370GM</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>抗连接蛋白43/GJAI抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>兔多克隆</td></tr><tr><td>抗肌节 &amp;alpha;α-辅肌动蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>小鼠单克隆</td></tr><tr><td>台式冻干机</td><td>Labconco</td><td>77500-00 K</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Sterilgard</td><td>A/B3</td><td></td></tr><tr><td>碳棒电极</td><td>SGL Carbon 集团</td><td>6971105</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II型，粉末状</td><td>Gibco</td><td>17-101-015</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>羧基功能化的碳纳米管</td><td>NanoLab</td><td>PD30L5-20-COOH</td><td></td></tr><tr><td>切片锯机</td><td>乔尔乔技术</td><td>DAD-321</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Gibco</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>电子束蒸发仪</td><td>CHA</td><td>57367</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10-437-028</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>B型，300勃鲁姆，源自猪皮</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48382-180</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁和酚红的HBSS</td><td>Gibco</td><td>14-175-079</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>磁力加热板</td><td>康宁</td><td>PC-420</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276695</td><td>含 2,000 ppm 对甲酚 A 作为抑制剂</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 175 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>Olicscope</td><td>Siglent</td><td>SDS1052DL+</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PDMS SYLGARD 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>微型微孔掩膜公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂丝</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA43014BU</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇二甲基丙烯酸酯</td><td>Polysciences 公司</td><td>15178-100</td><td></td></tr><tr><td>再生纤维素透析管</td><td>Fisherbrand</td><td>21-152-14</td><td></td></tr><tr><td>银环氧胶粘剂</td><td>MG Chemicals</td><td>8330S</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统</td><td>Millipore</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td></td></tr><tr><td>紫外固化系统</td><td>OmniCure</td><td>S2000</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>科学产业</td><td>SI-0246A</td><td></td></tr><tr><td>波形发生器</td><td>安捷伦</td><td>33500B</td><td></td></tr><tr><td>用铝箔包裹</td><td>雷诺兹</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

仿生柔性机器人集成微电极

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

利用工程化肌肉组织和生物材料模拟生物体的仿生软体机器人系统正在革新当前的生物机器人研究范式，尤其在生物医学研究领域具有重要意义。对于软体机器人系统而言，重现类似生命体的驱动动力学行为至关重要。然而，对驱动行为进行精确控制和调节仍是现代软体机器人系统面临的主要挑战之一。本方法介绍了一种低成本、高度可扩展且易于使用的制备工艺，用于构建一种可通过电信号控制、具有类生命运动行为的软体机器人，该机器人由微图案化水凝胶支架上心肌组织的收缩实现激活与控制，其结构形似蝠鲼。通过采用软光刻技术，可成功将多种组分整合至该软体机器人系统中，包括嵌入碳纳米管的明胶甲基丙烯酰胺（CNT-GelMA）、聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、柔性金（Au）微电极以及心肌组织的微图案化水凝胶支架。其中，水凝胶的排列方式与微图案设计旨在模拟蝠鲼的肌肉与软骨结构。具有电导性的CNT-GelMA水凝胶作为细胞支架，可促进心肌细胞的成熟并改善其收缩行为，而机械强度较高的PEGDA水凝胶则为整个软体机器人提供类似软骨的结构支撑。为克服传统金属微电极刚性且易碎的缺点，我们设计了蛇形结构，使其具备高柔韧性，避免干扰心肌细胞的搏动动力学。集成的柔性Au微电极可在整个软体机器人中传递电刺激，从而更便捷地调控心肌组织的收缩行为。

开发集成金微电极的仿生软体机器人的步骤流程图 
软体机器人设计的目标是构建一种能够以最小复杂性实现游动运动的膜结构。该结构必须能够在长时间内反复承受强烈弯曲（约1 Hz），并在实现强力拍打的同时保持其形状。通过使用光掩模选择性地对聚合物进行光交联，我们制备了一种分层结构的支架，该支架由微图案化PEGDA水凝胶层、柔性金微电极层以及微图案化CNT–GelMA水凝胶层组成。本方案中所述软体机器人的制备过程示意图及实际图像如图1所示。简而言之，集成金微电极的仿生软体机器人的制备主要包括三个步骤：首先，通过使用第一张光掩模进行紫外光交联，获得带有集成金微电极的微图案化PEGDA水凝胶（图1A, B）；其次，通过使用第二张光掩模进行紫外光交联，构建由金微电极、微图案化CNT-GelMA和PEGDA水凝胶组成的多层结构（图1C）；最后，将心肌细胞接种于所制备的三层结...

采用软光刻技术，利用机械强度高且具有导电性的水凝胶制备一种仿生支架。微图案化水凝胶可实现心肌细胞的定向排列，从而产生特定方向的收缩作用。支架中还集成了柔性微电极，以实现对自搏动心肌组织的电学调控。

受生物启发的软体机器人系统，通过工程化肌肉组织和生物材料模拟生物体，正在革新当前的生物机器人技术……

我们提出了一种新型电控仿生驱动器的制备方法，该方法不仅能够克服现有生物杂合驱动器的局限性，还可显著提升基于细胞的驱动器性能。利用这种低成本且易于操作的技术，可实现对仿生软体机器人驱动行为的控制与调节，从而实现实时刺激。该新方法有望进一步拓展应用于无线供能的可植入柔性电子器件，以促进心脏再生。该方法还可作为研究细胞潜伏结构局部电刺激的新型平台。首先，将80毫克GelMA溶解于4毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。然后加入20毫克羧基功能化的多壁碳纳米管，并在660毫赫兹和100瓦条件下超声处理该溶液1小时。为了制备微图案化的 PEGDA，将一层厚度为 50 微米的商用透明胶带贴在经 TMSPMA 涂覆的玻片上，在涂覆面滴加 15 微升 20% PEGDA 预聚物溶液，然后覆盖上金微电极。将第一块光掩模置于玻片上方，将整个装置暴露于 200 瓦、强度为 800 毫瓦、距离为 8 厘米的紫外光下照射 110 秒。紫外照射结束后，将玻片放入杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。在间隔物之间加入20微升碳纳米管GelMA预聚物溶液液滴。5到10分钟后，小心地将微图案化PEGDA水凝胶和金微电极从未涂层的玻璃基底上剥离，并将载玻片倒置放置在间隔物上。用胶带将载玻片固定在培养皿上，然后将整个装置倒置。将第二块光刻掩模放置在玻璃载片上，并按照演示方法用紫外光照射200秒。照射结束后，用新鲜的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）清洗支架一次，再用添加了10%胎牛血清的细胞培养基清洗一次。然后将支架放入新的培养皿中的新鲜培养基内，置于37摄氏度培养箱中过夜。根据标准方案从两天龄新生大鼠心脏中分离心肌细胞后，将细胞重悬于浓度为1.95 × 10⁶ 个细胞/毫升的心脏培养基中，并以液滴形式接种至制备好的软体机器人表面。当装置的整个表面被细胞覆盖后，在37°C下培养样品5天，并在接种后的第1天和第2天，用5毫升新鲜细胞培养基（添加2%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺）更换培养上清液。为评估心肌细胞在软体机器人上的自发搏动，自培养第3天起，将机器人置于倒置光学显微镜载物台上，使用5X或10X物镜及视频采集软件，以每秒20帧的速度连续成像心肌细胞活动30秒。第五天，使用盖玻片轻轻抬起膜的边缘。使用间距为三厘米的PDMS作为支架，将两个带铂丝的碳棒电极固定在盛有心肌培养基的六厘米培养皿中，并小心地将软体机器人转移至该培养皿内。随后施加方波刺激，脉冲宽度为50毫秒，直流偏移值为零伏，峰值电压幅度介于0.5至6伏之间。使用金微电极进行电刺激时，在制备多层结构后，通过外部的方形端口，用银浆将两根铜导线连接至金电极，并用一层在80摄氏度下预固化5分钟的PDMS覆盖银浆。随后将样品置于45摄氏度的加热板上5小时，以实现PDMS的充分交联。在将心肌细胞接种到连接导线的软体机器人上后，通过铜导线施加方波电刺激，直流偏置电压为1 V，峰值电压幅度在1.5至5 V之间，频率分别为0.5 Hz、1 Hz和2 Hz。这些软体机器人通过仿生模拟两种不同水生动物——海星和蝠鲼的运动模式而设计。根据图案间距的不同，接种心肌细胞的碳纳米管 GelMA 层表现出不同的搏动行为。为了防止心肌细胞在动态搏动过程中导致软体机器人发生不可逆的完全卷曲，将 PEGDA 水凝胶支撑层的图案间距优化为 300 微米。从收缩记录获得的这些帧中，可以清楚地观察到，当翅膀在中间有力闭合时，尾部通过伸直来平衡结构，而形似魔鬼鱼的驱动器则按预期弯曲翅膀。部分膜在收缩时表现出旋转运动，这是由于微图案化的碳纳米管 GelMA 和 PEGDA 水凝胶排列不齐所致。通过 F-肌动蛋白 DAPI 共聚焦成像，也可观察到微图案化 PEGDA 和碳纳米管 GelMA 图案上的心肌组织。通过共聚焦显微镜，可以在图案化区域观察到部分单轴排列的肌节结构以及相互连接的肌节结构，同时在直接位于微电极上方的心肌组织中也能观察到良好互联的肌节结构。通过连接至金电极的外部碳电极或铜线施加不同频率的电刺激时，其激发阈值电压有所不同。采用光掩模对 PEGDA 和 GelMA 进行紫外光交联及微图案化处理，对于获得高质量、包含多层覆盖结构的金微电极至关重要。生物打印可用于制造微图案化水凝胶和柔性电极。我们利用生物打印技术快速、低成本且高通量地获得了几何结构明确的软体机器人。通过将柔性电子器件直接集成到基于水凝胶的支架中，该方法有望推动软体机器人的无线电刺激技术的发展。碳纳米管和有机溶剂应始终在通风橱内操作，因为碳纳米管纤维可能进入肺部，增加患癌风险。

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科研

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生物灵感软机器人与合并微电极

DNA折纸是一种通过编程DNA分子的自组装来制造精确纳米级结构的强有力方法。本文描述了如何利用DNA折纸技术设计一种能够感知生物信号并响应性地发生形状变化，进而实现特定效应的纳米机器人。...

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在本项分为两部分的研究中，利用高柔性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）悬臂和活体肌肉细胞（心肌细胞）研制出一种生物驱动器，并对其进行了表征。该生物驱动器结合由改性PDMS材料制成的基底，构建出一种能够自我稳定的游动生物机器人。...

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利用机器人显微注射技术在脑切片中对单个神经干细胞和神经元进行操作

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自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

学习利用水凝胶制造电控生物启发软体机器人的方法，通过集成柔性微电极实现实时刺激与精确调控。该技术为心脏再生和细胞构建物的局部电刺激研究提供了新平台。

仿生柔性机器人集成微电极

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