从人尿源性细胞直接重编程获得的肌管中的外显子跳跃

我们建立了一种将人尿源性细胞直接重编程为成肌细胞的新方案。该体外模型使我们能够评估杜氏肌营养不良症患者来源的成肌细胞中的外显子跳跃现象。我们发现，3-脱氮-表氨霉素A盐酸盐（DZnep）作为一种组蛋白甲基转移酶抑制剂，可在短时间内显著促进尿源性细胞向成肌细胞的直接转化。

这种基于自体尿源性细胞（UDC）的新型疾病建模方法可能推动精准医学在多种肌肉疾病中的应用。首先，在室温下以400 × g离心整个尿液样本10分钟。接着，吸除上清液，保留1毫升于离心管中。

将沉淀物各自用剩余的一毫升尿液重悬。收集至一个50毫升离心管中，并向管中加入10毫升洗涤缓冲液。在室温下以200 × g离心10分钟。

吸除上清液，管中保留0.2毫升。用4.5毫升基础培养基重悬细胞沉淀。将细胞接种至经明胶包被的六孔板中的三个孔，每孔加入1.5毫升细胞悬液。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养。前 3 天每天添加 1.5 毫升基础培养基。第 4 天，更换为 1.5 毫升生长培养基，添加物按文稿中所述进行补充。

第4天后，每隔一天更换一次添加了补充物的生长培养基，直至胆管细胞（UDC）培养物汇合度达到80%至90%。随后吸除培养基，用PBS洗涤细胞，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞进行传代。

将细胞以每平方厘米3,000至5,000个细胞的密度接种于新的明胶包被的60毫米培养皿中。将UDCs以每平方厘米3,000至5,000个细胞的密度接种于明胶包被的60毫米培养皿中，并将培养皿放入培养箱中。接种后24小时，用解冻的逆转录病毒感染细胞，感染复数为200。

使用含有8微克/毫升六亚甲基溴化物的新鲜培养基。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养24小时。为了筛选MYOD1转导的细胞，将培养基更换为含有1微克/毫升嘌呤霉素的新鲜生长培养基。

每隔一天更换一次培养基，持续七至十天。将转导了 MYOD1 的 UDC 接种于胶原蛋白包被的多孔板中。细胞培养 24 小时后，将生长培养基更换为文中所述的分化培养基。

三天后，将分化培养基更换为不含 DZNep 的新鲜分化培养基，之后每三天更换一次培养基。为了将反义寡核苷酸转染至 MYOD1 转导的 UDCs 中，将 ASO 转染试剂与分化培养基混合，终浓度为 1 至 10 微摩尔。

将此混合液用于替换孔中的培养基。将培养板置于37°C、5%湿度条件下孵育。与ASO共同孵育72小时后，更换为不含ASO的新鲜分化培养基。

转染ASO后三至七天，移除分化培养基。用PBS洗涤UDC细胞一次，加入细胞裂解缓冲液。使用RNA提取试剂盒提取总RNA。

使用分光光度计测定RNA浓度。按照文中的描述，在PCR管中加入一步法RT-PCR所需的试剂。将PCR管放入热循环仪中，并运行程序。

进行微芯片电泳并计算外显子跳跃效率。尿源性细胞（UDCs）可无创且便捷地收集，并在原代培养一周内形成集落。在含DZNep的分化培养基中，转染MYOD1的UDCs能够高效地相互融合，形成多核肌管。

RT-PCR 明确检测到杜氏肌营养不良症患者来源的 MYOD1-UDC 中存在外显子跳跃。跳跃效率依赖于反义寡核苷酸（ASO）的剂量。Western 印迹也检测到剂量依赖性的外显子跳跃。

在ASO转染后一周，使用荧光显微镜测量抗肌萎缩蛋白的强度。与对照组相比，经ASO处理的MYOD1-UDC中观察到明显更强的荧光信号。我们可以对任何导致肌肉疾病的病理生理机制进行建模研究。