Name: 使用χCRAC以高时间分辨率监测体内蛋白质-RNA相互作用动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解Kinetic CRAC方法用于活细胞中蛋白质-RNA相互作用的高时间分辨率研究。本方案涵盖酵母培养、紫外交联、细胞收获、蛋白质纯化及测序文库制备等关键步骤，适用于神经科学和细胞生物学研究。

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本工作获得了以下资助：惠康信托基金（S.G. 获资助号 091549，S.M. 获资助号 109093/Z/15/A）、惠康信托细胞生物学中心核心资助（092076）、英国医学研究理事会非临床高级研究员奖学金（S.G. 获资助号 MR/R008205/1）、欧洲分子生物学组织长期博士后奖学金（R.A.C. 获资助号 ALTF 1070-2017）以及丹麦独立研究基金（T.H.J.）。

<ol><li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>König, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+Identification+of+RNA-Binding+Protein+and+MicroRNA+Target+Sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Aktaş, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+Protein%E2%80%93RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+in+vivo+RNA-binding+site+analyses+reveal+a+role+of+Prp8+in+spliceosomal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).</li>
<li>Rosenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+CLIP%2C+dCLIP%2C+Pipeline+Identifies+Discrete+RNA+Footprints+on+Chromatin-Associated+Proteins+and+Reveals+that+CBX7+Targets+3%E2%80%B2+UTRs+to+Regulate+mRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression.</a> Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein%E2%80%93RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sCLIP%E2%80%94an+integrated+platform+to+study+RNA%E2%80%93protein+interactomes+in+biomedical+research%3A+identification+of+CSTF2tau+in+alternative+processing+of+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+noncoding+and+pathogen+RNA%E2%80%93protein+interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes.</a> RNA. 21 (1), 135-143 (2015).</li>
<li>Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+iCLIP+detects+persistent+SR+protein+binding+to+conserved%2C+retained+introns+in+chromatin%2C+nucleoplasm+and+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).</li>
<li>Sanford, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nuclear+and+Cytoplasmic+mRNA+Targets+for+the+Shuttling+Protein+SF2%2FASF%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF.</a> PLOS ONE. 3 (10), e3369(2008).</li>
<li>Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+PAR-CLIP+for+transcriptome-wide+identification+of+binding+sites+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins.</a> Methods. 118-119, 24-40 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+N6-Methyladenosine+%28m6A%29+Map+Using+Photo-Crosslinking-Assisted+m6A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).</li>
<li>Ke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+majority+of+m6A+residues+are+in+the+last+exons%2C+allowing+the+potential+for+3%E2%80%B2+UTR+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA%E2%80%93RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Hwang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cTag-PAPERCLIP+Reveals+Alternative+Polyadenylation+Promotes+Cell-Type+Specific+Protein+Diversity+and+Shifts+Araf+Isoforms+with+Microglia+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation.</a> Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).</li>
<li>Hwang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAPERCLIP+Identifies+MicroRNA+Targets+and+a+Role+of+CstF64%2F64tau+in+Promoting+Non-canonical+poly%28A%29+Site+Usage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage.</a> Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).</li>
<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Beckmann, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interactome+capture+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA interactome capture in yeast.</a> Methods. 118-119, 82-92 (2017).</li>
<li>Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+ribosome+synthesis+factors+regulate+pre-rRNA+folding+and+5.8S+rRNA+maturation+by+the+Rat1+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease.</a> The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).</li>
<li>Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Yeast+RNA+Polymerase+II+Termination%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination.</a> PLOS Genetics. 10 (10), e1004632(2014).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Kresnowati, M. T. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+transcriptome+meets+metabolome%3A+fast+cellular+responses+of+yeast+to+sudden+relief+of+glucose+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation.</a> Molecular Systems Biology. 2, 49(2006).</li>
<li>Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+transcription+and+mRNA+decay+to+gene+expression+dynamics+of+fission+yeast+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress.</a> RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).</li>
<li>van Nues, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+CRAC+uncovers+a+role+for+Nab3+in+determining+gene+expression+profiles+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress.</a> Nature Communications. 8 (1), 12(2017).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+transcription+by+RNA+polymerase+II+in+yeast%3A+Hasard+or+n%C3%A9cessit%C3%A9%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité?</a> Biochimie. 117, 28-36 (2015).</li>
<li>Lingaraju, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MTR4+helicase+recruits+nuclear+adaptors+of+the+human+RNA+exosome+using+distinct+arch-interacting+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Lubas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Profiling+Identifies+the+Human+Nuclear+Exosome+Targeting+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex.</a> Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).</li>
<li>Conrad, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex+associated+with+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II.</a> Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).</li>
<li>Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+Nrd1-Nab3+Transcription+Termination+Pathway+Acts+in+Opposition+to+Ras+Signaling+and+Mediates+Response+to+Nutrient+Depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).</li>
<li>Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CLIP+data+indicate+that+Nrd1-Nab3-dependent+transcription+termination+regulates+expression+of+hundreds+of+protein+coding+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast.</a> Genome Biology. 15 (1), R8(2014).</li>
<li>Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dealing+with+Pervasive+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dealing with Pervasive Transcription.</a> Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).</li>
<li>van Dijk, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XUTs+are+a+class+of+Xrn1-sensitive+antisense+regulatory+non-coding+RNA+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast.</a> Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).</li>
<li>Thiebaut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Futile+Cycle+of+Transcription+Initiation+and+Termination+Modulates+the+Response+to+Nucleotide+Shortage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae.</a> Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).</li>
<li>Merran, J., Corden, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+RNA-Binding+Protein+Nab3+Regulates+Genes+Involved+in+Nitrogen+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism.</a> Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).</li>
<li>Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA+Decay+Pathways+Aid+Rapid+Remodeling+of+Gene+Expression+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast.</a> Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).</li>
<li>Buchbender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+library+preparation+with+the+new+iCLIP2+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol.</a> Methods. , (2019).</li>
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A. Langford 和 W. Worboys 隶属于 UVO3 这家商业公司。他们未参与研究设计、数据收集与解释，也未参与决定是否将该工作提交发表。

χCRAC 方法结合新型交联和细胞收集装置具有巨大潜力，因其适用于多种模式生物，故应普遍受到RNA领域的关注。χCRAC可在多个研究领域中得到应用。例如，该方法可用于测量蛋白质逐级组装形成大型大分子复合物（如剪接体和核糖体）的过程，这一过程通常涉及蛋白质与RNA分子之间的动态相互作用。目前，我们已常规使用该方法监测细胞在经历多种应激条件时，RNA降解因子与其底物之间的相互作用。这使我们能够确定这些因子在适应性应答的哪个阶段最为活跃、它们结合的底物是什么，以及这些相互作用的动态变化情况。此类数据将有助于研究人员确定各个因子在适应环境变化过程中所起的相对作用。
χCRAC 利用双亲和纯化标签（HTF 或 HTP）在高严谨性和变性条件下纯化蛋白质。这可确保共纯化的 RNA 高度富集于与目标蛋白共价交联的 RNA。然而，依赖亲和标签存在缺点。例如，标签可能干扰蛋白功能，从而导致其 RNA 结合相互作用组的检测结果产生偏差。此外，对于某些模式生物，可能无法使用标签，因为尚无可用的遗传工具将 DNA 片段整合到基因组中或转化表达质粒。然而，可以简便地修改 χCRAC 方案的某些部分，使其与基于抗体纯化 RBP 的 CLIP 类方法兼容。事实上，本研究已证明，可以将基于 iCLIP 的纯化方法与我们的交联剂相结合。目前，我们正在开发 CLIP 方案，以研究人类 RNA 结合蛋白与新生 RNA 转录本之间的时间关联性。
在对一种新蛋白进行χCRAC实验时，必须优化紫外光照射条件，以诱导最大程度的交联。这一点非常重要&#160;，因为过高的紫外光照射剂量会降低纯化步骤中RNA的回收率。表达重组RBP的细胞分别接受了不同剂量的紫外光照射：100 mJ/cm2、250 mJ/cm2、500 mJ/cm2 和 1 J/cm2。随后捕获核糖核蛋白复合物（RNP），对RNA进行片段化并放射性标记。之后，通过SDS-PAGE分离RNP，并进行放射自显影，以确定哪种照射剂量产生最强信号（即实现最大程度的交联）。
当实验条件优化后，在进行χCRAC时建议开展若干对照实验。首先，可使用经紫外照射且未加标签的样品来监测纯化磁珠的背景结合情况。其次，在开展转移实验（shift experiment）过程中应用χCRAC时，可通过将细胞重新转移回原始培养基中进行第二组时间序列实验，以探究细胞过滤操作本身是否会引起RNA水平或蛋白质-RNA相互作用的变化。
如引言中所述，大量近期发表的论文提出了对CLIP实验方案的多种优化措施。这包括使用荧光标记的接头，通过红外扫描检测蛋白-RNA复合物10，以及对核酸纯化和片段大小选择等步骤进行优化，以提高最终文库的复杂性12,45。我们目前正在实施其中一些改进，以进一步完善χCRAC实验流程。本文所呈现的方案已包含对原始CRAC和χCRAC方案的多项改进，可提高数据的复杂性。例如，过去在SDS-PAGE凝胶上分离交联的放射性蛋白-RNA复合物后，需将其转移至硝酸纤维素膜上，并从印迹膜中回收交联的RNA。然而，核糖核蛋白（RNP）的转移及后续RNA提取效率往往很低，尤其是在处理RNA聚合酶亚基等较大的RNA结合蛋白时。这可能导致交联RNA的回收率显著降低。在当前的方案中，交联RNA直接从SDS-PAGE凝胶切片中提取，如图1所示，从而提高了交联RNA的回收效率。此外，在cDNA的PCR扩增后，最初使用3%的低熔点琼脂糖凝胶进行产物分离，并从中回收175–300 bp的PCR片段。然而，这类凝胶容易过载，导致DNA分离效果极差。改用预制TBE凝胶后，PCR产物的片段大小分离更加稳定，回收效果也更好。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA通常依赖RNA结合蛋白（RBP）来发挥其功能，这使得人们对这些分子之间的相互作用动态产生了极大兴趣。目前已在多种生物体中鉴定出许多RBP。然而，体内研究RBP与RNA的相互作用一直极具挑战性。研究此类相互作用的一个重大突破是CLIP技术的出现1。该方法利用紫外线（UV，254 nm）照射，在RBP与其直接结合的RNA之间诱导形成共价键（即零距离交联）。随后，在严格条件下通过免疫纯化目标RBP，以确保仅能鉴定到与蛋白共价交联的RNA。结合的RNA随后经RNase部分消化，再转化为cDNA文库用于测序。高严格性的纯化步骤至关重要，因为它显著提高了蛋白和RNA回收的特异性，这一特异性还可通过SDS-PAGE进一步纯化交联的核糖核蛋白（RNP）复合物而得到增强。CLIP及相关方法能够以单核苷酸分辨率揭示蛋白结合位点，因为在测序文库构建过程中，与RNA交联的氨基酸常常会终止逆转录酶反应，或导致该酶在交联位点引入突变1,2,3。
自原始CLIP方案问世以来，已衍生出多种改进方法。其中一项重要突破是HITS-CLIP（或称CLIP-seq）的发展，该方法将高通量测序与CLIP技术相结合3。此后，所有基于CLIP的方法均采用了这一测序策略。iCLIP在RNase介导的RNA片段化和接头连接技术方面进行了优化，有助于更精确地定位RBP结合位点4。PAR-CLIP则结合了4-硫代尿苷/尿嘧啶标记与365 nm波长的交联，使得通过分析T-C替换来定位交联位点成为可能5。CRAC、urea-iCLIP、dCLIP和uvCLAP引入了变性条件及双重亲和纯化步骤，进一步降低了亲和树脂上的非特异性结合，显著提高了目标蛋白捕获的特异性2,6,7,8,9。此外，CRAC、uvCLAP和dCLIP还引入了对目标RBP进行亲和标签标记的策略，从而避免了制备特异性抗体的需要。
为了加快CLIP方法的流程，还进行了多项优化。原始的CLIP实验方案采用对捕获的RNA进行放射性标记，以便在SDS-PAGE后可视化RBP-RNA复合物。然而，对于不具备放射性操作条件的实验室而言，使用放射性物质可能带来困难。irCLIP引入了荧光团偶联的接头，可通过红外成像实现检测10；而sCLIP则通过对捕获的RNA进行生物素标记，利用链霉亲和素偶联的HRP进行检测11。此外，eCLIP完全省去了RNA标记步骤，而是根据蛋白质已知的分子量直接切取目标蛋白条带12。在FAST-iCLIP中，也采用了基于链霉亲和素的纯化策略以加速文库构建：将生物素化的3’接头连接到RNA上，并用于逆转录和环化后的纯化步骤13。对iCLIP实验方案的其他改进也显著提高了文库的复杂度4。
最后，CLIP 技术已得到改进，可用于捕获来自不同细胞亚区室的 RNA 结合蛋白14,15，通过脉冲诱导光激活核糖核苷来可视化新转录的 RNA5,16,17，捕获甲基化 RNA18,19,20，研究 RNA-RNA 相互作用21,22，以及绘制 RNA 的 3’ 末端图谱23,24。
尽管基于CLIP的技术在帮助我们理解RNA结合蛋白（RBPs）与RNA之间的相互作用方面做出了重要贡献，但其应用受到紫外（UV）交联效率低下的限制。虽然单层培养的细胞通常相对容易进行交联，但在组织或悬浮细胞中实现有效交联则具有显著挑战性。组织可能需要多轮UV照射才能穿透至目标细胞层，而微生物细胞通常在含有芳香族、吸收UV的化合物的丰富培养基中生长25。事实上，对于此类样本，已有研究采用长达30分钟的UV照射时间，以实现RNA结合蛋白与其结合RNA之间足够的交联效率26,27,28。然而，这种长时间的UV照射会诱导细胞内的应激反应，例如UV引起的DNA损伤，这在某些应用中可能污染最终的实验数据。
大多数CLIP研究集中于在细胞中生成特定蛋白-RNA相互作用的单个&#34;快照&#34;。然而，蛋白-RNA相互作用本质上是动态的，尤其是在细胞受到环境变化影响时。这可能包括必需营养物质的突然减少或温度的快速变化。因此，为了真正理解RNA结合蛋白（RBP）在应激过程中的作用，最好进行时间分辨分析，因为这类分析能够捕获应激期间RBP靶标的完整谱系，并确定所选RBP在应激反应的哪个阶段具有活性。特别是酵母中的研究表明，适应的最初几分钟对于细胞存活至关重要，而细菌中RNA的半衰期可从几分钟到几秒不等29,30,31,32,33。因此，理想情况下，此类时间分辨分析应在高时间分辨率下进行。然而，较长的交联时间使得对早期适应性反应的研究尤为困难。
为了解决上述问题，我们近期开发了一种改进方法，能够在分钟级的时间尺度上实现细胞的交联与收集。我们的χCRAC方法可对RNA结合蛋白（RBP）与RNA相互作用的动态变化进行定量测量，其分辨率达到了前所未有的水平。该方法的关键在于开发了一种新型紫外（UV）照射装置32，可将溶液中酵母和细菌所需的交联时间缩短约10倍，从而近乎瞬时地“冻结”RBP-RNA相互作用。此外，为了在紫外照射后快速收集细胞，我们还开发了一种真空过滤装置，可在约30秒内收集0.5 L培养体积中处于指数生长期的酵母32。这些技术创新使得在分钟级分辨率下研究RBP-RNA动态成为可能。同时，我们还对原始CRAC实验流程2进行了多项优化，以提高其实用性。
我们最近利用χCRAC研究了酵母核内RNA结合蛋白Nab3在葡萄糖剥夺条件下的靶标组。在Saccharomyces cerevisiae中，Nab3可与RNA结合蛋白Nrd1及RNA解旋酶Sen1形成NNS复合物。NNS复合物结合于RNA聚合酶及新生转录本时，可触发转录终止34。该复合物主要参与清除隐蔽的非编码RNA转录本，但也被证明可调控蛋白编码基因的表达。研究显示，在施加胁迫仅一分钟后，Nab3即表现出对非编码和编码转录本的差异性靶向32。我们证明，Nab3介导的共转录终止导致逆转座子基因呈现非常短暂的脉冲样表达，而这种表达模式使用传统的基于CLIP的方法难以检测。此外，我们在UV交联仪中采用的短时间紫外照射显著提高了短寿命非编码RNA的回收率32。χCRAC有望成为解析RNA结合蛋白如何在即时时间尺度上塑造应激反应，以及其在整个应答生命周期中功能动态变化的关键工具。本文提供了χCRAC实验方案中所有步骤的详细概述。为便于说明，本方法被用于研究酵母Nrd1蛋白及其在葡萄糖剥夺条件下、多个时间点上的RNA靶标组，Nrd1参与转录终止和RNA降解过程35,36。最后，我们还证明，我们的紫外照射装置能够快速将RNA结合蛋白与HeLa细胞中的RNA交联，从而使得在贴壁细胞中开展高分辨率的时间分辨分析成为可能。

<table><tbody><tr><td>1,4-二硫苏糖醇</td><td>Merck</td><td>10708984001</td><td>哺乳动物细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>通用反应管</td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.344</td><td>用于放置层析柱及收集废液</td></tr><tr><td>32P-yATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG502Z-250</td><td>用于RNA 5'端的放射性标记</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>SDS-PAGE 凝胶</td></tr><tr><td>4X 上样缓冲液</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>蛋白质上样染料浓缩液</td></tr><tr><td>50 bp DNA 标准品</td><td>New England Biolabs</td><td>N3236</td><td>用于从扩增的cDNA文库中切取目标区域的参照标准</td></tr><tr><td>50% 聚乙二醇（PEG）</td><td>NEB</td><td>B100045</td><td>用于L5接头的连接反应</td></tr><tr><td>6% TBE 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>EC6265BOX</td><td>用于cDNA文库的分离与纯化</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>ACROS Organics</td><td>423245000</td><td>用于TCA沉淀蛋白的洗涤</td></tr><tr><td>抗FLAG磁珠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8823-1ML</td><td>用于纯化带有FLAG标签的RNA结合蛋白（RBPs）</td></tr><tr><td>ATP（100 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0441</td><td>用于将L5接头连接至捕获RNA的5'端</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Biomax MS 增感屏</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z363162-1EA</td><td>用于增强放射自显影信号</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1010219</td><td>RNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提</td></tr><tr><td>cOmplete 无EDTA蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>用于细胞裂解后抑制细胞内蛋白酶活性</td></tr><tr><td>Complete supplement mixture -TRP</td><td>Formedium</td><td>DCS0149</td><td>用于合成定义培养基的配制</td></tr><tr><td>Costar Spin-X 0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160</td><td>用于凝胶提取后分离切下的cDNA片段</td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>细胞裂解后用于DNA消化</td></tr><tr><td>dNTPs（10 mM）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4638956001</td><td>用于逆转录和PCR反应</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10041814</td><td>用于RNA纯化后的苯酚-氯仿抽提及DNA沉淀</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td>用于蛋白酶K缓冲液的配制</td></tr><tr><td>外切核酸酶I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td>用于PCR后引物的降解</td></tr><tr><td>玻璃微纤维滤膜</td><td>Whatman</td><td>1823-010</td><td>用于凝胶提取后分离切下的cDNA片段</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td>用于配制含葡萄糖的合成定义培养基</td></tr><tr><td>糖原（20 mg/mL）</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td>用于蛋白质、RNA和DNA的沉淀</td></tr><tr><td>GST-TEV</td><td>自制</td><td></td><td>构建及纯化方案可应要求提供</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10071503</td><td>用于免疫沉淀的变性条件及洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>IgG 磁珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>用于纯化带有蛋白A标签的RNA结合蛋白（RBPs）</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>用于从镍柱磁珠中洗脱捕获的蛋白质</td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td>RNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提</td></tr><tr><td>Luna Universal One-Step RT-qPCR 试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3005S</td><td>用于cDNA的qPCR检测，以确定所需PCR循环数</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fluka Analytical</td><td>63020-1L</td><td>用于多核苷酸激酶（PNK）缓冲液</td></tr><tr><td>膜滤器</td><td>Millipore</td><td>酵母用AAWP09000或细菌用HAWP09000</td><td>用于细胞的真空过滤</td></tr><tr><td>微量生物离心柱</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td>用于凝胶提取后收集洗脱液</td></tr><tr><td>Ni-NTA 磁珠</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>用于二次蛋白捕获</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Pfu 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>用于cDNA文库的扩增</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4682-400ML</td><td>RNA纯化后用于苯酚-氯仿抽提</td></tr><tr><td>Pierce 离心柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69725</td><td>用于柱上酶促反应</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td>凝胶提取后用于降解RNA结合蛋白</td></tr><tr><td>石英培养皿</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>用于贴壁细胞的交联。可通过 https://www.vari-x-link.com 以400英镑购买</td></tr><tr><td>放射自显影胶片</td><td>Amersham</td><td>28906843</td><td>用于放射自显影成像</td></tr><tr><td>RNAClean XP 磁珠</td><td>Beckmann</td><td>A63987</td><td>SPRI磁珠，用于RNA和cDNA的纯化</td></tr><tr><td>核糖核酸酶H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297</td><td>逆转录后用于RNA的降解</td></tr><tr><td>RNase-It</td><td>Agilent</td><td>400720</td><td>用于RNA消化</td></tr><tr><td>rRNasin</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>用于抑制酶促反应中可能存在的污染性RNase</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889-1KG</td><td>用于RNA纯化后的苯酚-氯仿抽提及DNA沉淀</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td>哺乳动物细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-1KG</td><td>用于蛋白酶K缓冲液</td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td>用于细胞裂解后抑制细胞内RNase活性</td></tr><tr><td>SuperScript IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>用于逆转录反应</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（PNK）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>用于RNA 5'端的放射性标记</td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td>用于将L5接头连接至RNA的5'端</td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶2，截短型K222Q突变体</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td>用于将App_PE接头连接至捕获RNA的3'端</td></tr><tr><td>TBE缓冲液（10X）</td><td>Invitrogen</td><td>15581-028</td><td>用于TBE凝胶电泳</td></tr><tr><td>TEV蛋白酶</td><td>自制</td><td></td><td>在FLAG标签捕获后用于洗脱捕获的蛋白质</td></tr><tr><td>热敏感碱性磷酸酶</td><td>Promega</td><td>M9910</td><td>用于RNA的5'和3'端去磷酸化</td></tr><tr><td>三氯乙酸（100%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699-100ML</td><td>用于沉淀RBP-RNA复合物</td></tr><tr><td>盐酸Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>哺乳动物细胞裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>Vari Filter</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>用于真空收集细胞的装置。可通过 https://www.vari-x-link.com 以100英镑购买</td></tr><tr><td>Vari-X-Linker</td><td>UVO3</td><td>N/A</td><td>用于细胞交联的交联仪。可通过 https://www.vari-x-link.com 以16,000英镑购买</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td>用于合成定义培养基的配制</td></tr><tr><td>氧化锆珠</td><td>Thistle</td><td>酵母用11079105Z或细菌用11079101Z</td><td>用于通过珠击法进行细胞裂解</td></tr></tbody></table>

使用&#967;crac技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-rna相互作用动态

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

RNA结合蛋白（RBPs）与其RNA底物之间的相互作用具有动态性和复杂性。在一条RNA的生命周期中，可被多种不同的RNA结合蛋白结合，从而调控其生成、稳定性、活性及降解过程。因此，人们已开展大量研究以揭示这两类分子之间相互作用的动态机制。其中一项重要突破源于“c罗斯-l印迹与 i免疫p交联免疫沉淀（CLIP）。该技术使得研究人员能够严格地鉴定特定RNA结合蛋白（RBP）所结合的RNA分子。简而言之，目标蛋白在体内通过紫外照射与RNA底物共价交联，随后在高严谨性条件下纯化，再将共价交联至蛋白的RNA转化为cDNA文库并进行测序。自该技术提出以来，已衍生出多种改进方法，以适应不同研究领域的需要。然而，紫外光交联的效率历来较低，导致需要较长的照射时间，从而无法实现对RBP-RNA相互作用的动态时间过程研究。为解决这一问题，我们近期设计并构建了性能显著提升的紫外照射与细胞收集装置。利用这些新工具，我们建立了一种可在活细胞中以高时间分辨率进行RBP-RNA相互作用动力学分析的实验方案：动力学 CR交联 A分析 cDNA（χCRAC）。我们近期利用该技术研究了酵母RNA结合蛋白（RBP）在营养胁迫适应中的作用。本文详细概述了χCRAC方法，并展示了利用Nrd1 RBP获得的最新研究结果。

为了验证χCRAC方法的有效性，对表达HTP标记Nrd1蛋白的酵母菌株进行了时间进程实验。方法工作原理的详细示意图见图1。与Nab3类似，Nrd1参与多种RNA转录本的核内RNA降解37。Corden实验室先前的研究表明，当细胞经历葡萄糖饥饿时，Nrd1与其RNA靶标的结合会发生显著变化28,38。因此，将处于指数生长期且在含葡萄糖培养基（SD-TRP）中培养的细胞转移至不含葡萄糖的相同培养基（S-TRP）中，并在不同时间点监测Nrd1-RNA相互作用的动态变化。在转移前以及转移后1、2、4、8、14和20分钟，分别取样并在Vari-X-linker反应室（图3A）中进行交联。用于细胞培养的培养基特意缺乏色氨酸，以减少该芳香族氨基酸对紫外光的吸收。需要注意的是，最好使用经过滤除菌的合成培养基，因为高压灭菌可能导致糖类发生焦糖化，从而降低交联效率。
图4A 显示了一项χCRAC实验中具有代表性的放射自显影图。请注意，在本示例中，样品并未混合在一起，而是各自单独上样于凝胶中。建议在初步实验测试中采用此方法，以验证在所有设定的时间点上目标蛋白均能有效交联至RNA。在预期分子量位置观察到一个特别强的信号，该信号对应于RNA结合蛋白（RBP）与非常短的放射性标记RNA结合形成的复合物，这些短RNA片段不适合用于测序。因此，选择收集该条带上方呈弥散分布的信号，该信号代表与较长RNA片段交联的蛋白复合物。切割片段的范围为蛋白条带上方约30 kDa的区域。图4B 显示了切除后得到的放射自显影图，其中与短RNA交联的蛋白仍保留在凝胶中，而原先弥散的信号部分已被成功切下。
逆转录完成后，必须通过 PCR 扩增 cDNA 文库。然而，必须避免文库的过度扩增，因为这可能导致聚合酶优先扩增某些序列，从而引入偏差，并产生 PCR 伪影。过度扩增的文库还会包含大量重复序列，浪费测序仪的读长。为了计算最终文库扩增所需的理想 PCR 循环数，取一份 cDNA 样品，使用 P5 和 BC 寡核苷酸通过 qPCR 进行扩增。以文库首次达到最大荧光信号的循环数作为 PCR 扩增循环数。图 4C 展示了一个典型 cDNA 文库的 qPCR 结果示例，其峰值循环数为 16。该数值随后被用于最终的 χCRAC PCR 扩增。为了处理测序数据，我们使用了本实验室先前开发的软件（pyCRAC）以及用于分析动力学 CRAC 数据的相应分析流程（Nues 等，2017；https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac，https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/）。这些开源软件工具可实现数据的解复用和修剪、去除 PCR 重复序列、识别具有统计学显著性的峰、将读段聚类为连续序列，并识别结合基序39。这些工具的具体操作细节可在其各自的网页上找到。
我们还开始开发用于哺乳动物细胞的χCRAC实验方案。大多数哺乳动物细胞系以单层形式培养，而我们交联仪中带有紫外透射袋的托盘并不适用于贴壁细胞的实验。为解决这一问题，我们设计了一个可使用户对1–2个含有贴壁细胞的培养皿（直径150 mm，深度25 mm）进行紫外照射的平台（图3B）。作为初步测试，我们通过交联并捕获稳定表达的GFP-RBM7蛋白（使用抗GFP抗体及基于传统CLIP的纯化方法），评估了该交联仪在哺乳动物细胞中的交联效率。如图5A所示，该交联仪在254 nm紫外照射条件下，能够以与广泛使用的紫外照射装置相当的效率，从单层培养的哺乳动物细胞中回收蛋白-RNA复合物。然而，常规细胞培养所用的塑料器皿通常无法透过254 nm紫外光，因此在我们的交联仪中，细胞仅能从上方的紫外灯阵列接收到照射。为克服这一限制，我们开发了一种可用于细胞培养和交联的紫外透射石英培养皿。使用该石英器皿后，仅需2秒紫外照射即可高效回收蛋白-RNA复合物（图5B）。当该方法与CLIP等适用于哺乳动物细胞的RBP捕获技术结合时，如此短的交联时间可用于时间序列实验，以获取RBP在应对基因毒性应激、快速耗竭蛋白因子时，或在转录同步化或细胞周期同步化过程中的时空RNA结合谱型。
图6展示了由χCRAC流程处理的Nrd1数据的多个示例。该图使用流程生成的bedgraph文件以及我们设计的Python GenomeBrowser软件包（https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/）制作，旨在简化生成具有出版质量的基因组浏览器图像。灰色矩形代表表达非编码RNA的基因组区域，例如隐秘不稳定转录本（CUTs）、稳定但未表征的转录本（SUTs）40和Xrn1敏感的不稳定转录本（XUTs）41。 图6中的数据显示，Nrd1结合了其中许多非编码RNA转录本，这与该蛋白参与此类转录本降解的观点一致42。图6A展示了IV号染色体上约15 kb的区域。在此区域，Nrd1对编码高亲和力葡萄糖转运蛋白HXT6和HXT7的转录本的结合显著增强，这两种蛋白在葡萄糖饥饿期间均会上调。NNS复合物介导的转录终止可能影响这些基因在葡萄糖饥饿期间的诱导动力学。图6B展示了Nrd1与Imd3转录本交联的一个例子，已知该转录本受Nab3调控43。在这种情况下，数据表明在葡萄糖饥饿期间其结合显著减少。先前的研究显示，在葡萄糖饥饿期间Nab3与Tye7转录本的结合减少44。与此观察结果一致，χCRAC数据表明Nrd1在葡萄糖饥饿期间结合减少，且Nrd1与Tye7的交联在应激8分钟后达到最低水平（图4C）。然而，这种效应似乎是短暂的，因为在葡萄糖饥饿14分钟后，Nrd1的结合恢复至初始水平。
<img alt="蛋白质-RNA 交联示意图，包含紫外照射、纯化、Nu-PAGE 和测序步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：χCRAC 实验流程的示意图。标记菌株培养至所需密度。RBP 表示 RNA 结合蛋白。随后，采集参考样本并用 254 nm 紫外光进行交联。剩余细胞通过过滤收集，然后迅速转移至诱导应激的培养基中。在本研究所描述的 χCRAC 实验中，分别在转移后 1、2、4、8、14 和 20 分钟采集样本并进行交联（1）。接着，利用高严谨性的两步亲和纯化方法纯化目标 RBP（2）。随后，将捕获的交联 RNA 进行部分 RNase 消化，在 5’ 端进行放射性标记，并连接接头（3）。5’ 接头包含独特的“读内”条形码序列，以便在测序后通过生物信息学方法区分各个样本。然后将 RBP-RNA 复合物洗脱、混合并共同沉淀（4），通过 SDS-PAGE 分离，并通过放射自显影进行可视化（5）。随后，从放射自显影图像中切割出虚线红框所示、位于主条带正上方且含有放射性信号的单一凝胶条带（5）。将凝胶条带用蛋白酶 K 处理，随后提取 RNA（6），将其反转录为 cDNA 并通过 PCR 扩增（7）。PCR 步骤引入了额外的条形码（P7 寡核苷酸引入的黄色模块），使得多个文库可被多重混合至同一泳道中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有泵系统、可变滤光片和流量控制的细胞处理紫外照射装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：交联与真空过滤。（A）交联仪。将细胞悬液倒入位于机器右上方的漏斗中（另见图 3A的放大图），并保留在中间托盘中的紫外透射袋内。该袋子两侧各有一个快门，直到用户指令机器开始照射步骤前，快门始终保持关闭状态。细胞由上下两个托盘中的紫外光源进行照射。仪器配备有254 nm和365 nm的紫外灯，其中后者适用于PAR-CLIP实验。仪器通过右上方的触摸屏面板操作，可控制紫外剂量或曝光时间。（B）交联完成后，细胞从机器左侧排出。通过真空抽吸回收细胞悬液，并排入玻璃烧瓶中，随后可将其倒入真空过滤装置以收集细胞。（C）真空过滤装置。该装置通过夹子开合，并在其中插入滤膜。为实现极短时间序列实验并避免因更换滤膜而延误时间，同时使用了四个过滤装置。（D）过滤后，培养基上清液被排入烧瓶中以便后续处理。在真空过滤装置下方安装有阀门，以便在移除滤膜时维持系统的真空状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样品照射的紫外照射室装置；包括进样口、培养托盘和培养皿托盘，适用于实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：悬浮细胞与贴壁细胞的交联比较。（A）配备用于悬浮细胞的Vari-X-linker反应室的交联仪。将细胞培养液倒入托盘右上方的样品入口（漏斗）中。（B）可承载塑料或石英培养皿的托盘，用于贴壁细胞或少量悬浮细胞的交联处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="放射自显影和qPCR分析；电泳结果；DNA定量；色谱图数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：文库制备。（A）Nrd1-HTP χCRAC实验中获得的放射自显影图示例。强而集中的信号代表与极短RNA交联的蛋白质，上方的弥散信号则代表与长度足以用于测序的RNA交联的蛋白质。（B）在凝胶切割后拍摄的放射自显影图中，如图所示切下弥散条带。（C）χCRAC cDNA文库的代表性qPCR结果。本示例中，cDNA扩增在第16个循环达到平台期，因此最终扩增采用16个循环。误差棒表示三次技术重复qPCR的标准化偏差。（D）6% TBE凝胶上cDNA文库的磷屏成像示例。（E）基于芯片毛细管电泳的cDNA长度与质量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在不同强度和时间的紫外照射下，RBM7-GFP的凝胶电泳及定量分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：高浓度RNase处理的iCLIP实验用于检测哺乳动物细胞中的交联效率。图中显示了GFP-RBM7 iCLIP实验的放射自显影结果，用于评估不同交联能量条件下RNP复合物回收的效率。采用与磁珠偶联的抗GFP抗体，对稳定表达GFP-RBM7的交联细胞进行免疫沉淀。免疫沉淀物经高浓度RNase I处理，以将结合的RNA剪切为短而均一的片段。通过32P标记结合SDS-PAGE对RNP进行检测，其在凝胶中呈现为一条清晰的条带，迁移位置接近未交联蛋白。定量分析结果表示将放射性标记的RBM7-RNA信号经抗GFP的Western blot信号归一化后的密度测定数据。(A) 常用的UVP交联仪与本研究使用的交联仪（Vari-X-linker；VxL）在不同交联时间下的比较。(B) 本研究交联仪在石英（左）和塑料（右）培养器皿上的交联时间过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="染色体IV、XII、XV上的基因表达分析；RNA-seq图谱显示了时间序列上的读段分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：基因组浏览器图谱示例，展示χCRAC技术揭示Nrd1对其靶标动态、时间依赖性结合的能力。 每个框图展示特定基因组区域的图谱。箭头指示基因所在的链（向左箭头 = 负链；向右箭头 = 正链）。各子图y轴上的t0、t1、t2等表示时间点（分钟）。罗马数字表示染色体编号，并标注了基因组坐标。(A) 在葡萄糖剥夺条件下，Nrd1结合两个高亲和力的葡萄糖转运蛋白基因HXT6和HXT7，这两个基因在此条件下均上调表达。(B) 观察到Nrd1结合Imd3——一个已被验证的Nab3靶标44，其结合强度随葡萄糖饥饿时间延长而降低。(C) Nrd1对Tye7的结合表现出动态且短暂的特征：在葡萄糖饥饿后结合减少，并在应激8分钟后达到最低点，随后在14分钟后恢复至基础水平。读段数据已归一化为“每百万读段”（RPM；y轴）。灰色框表示编码非编码RNA的区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

RNA结合蛋白（RBPs）与其RNA底物之间的相互作用具有动态性和复杂性。在单个RNA的生命周期中，其可被……

动力学CRAC可用于在前所未有的短时间尺度上研究RNA与RNA结合蛋白之间的时间关联。当与我们的交联剂结合使用时，动力学CRAC能够在数秒内对活细胞进行交联，从而减少紫外线损伤反应，并促进在分钟级分辨率下对胁迫响应的研究。动力学CRAC是一种非常冗长的实验流程，对新手用户而言可能具有挑战性。此外，RNA操作本身也存在诸多困难。为防止RNA降解，应过滤除菌所有溶液，并确保移液器和实验台面保持清洁。该方法的可视化演示至关重要，因为其中一些步骤并不十分直观，包括溶液中微生物的紫外交联与细胞收集，以及从凝胶中提取交联RNA的过程。对溶液中的微生物进行紫外交联时，需用酵母接种3.5升所需培养基，使初始OD 600为0.05，并在30摄氏度下以180 rpm持续振荡培养过夜。当细胞达到所需 OD 值后，立即将 500 毫升培养物倒入 Vari-X-linker 交联剂中，并用 250 毫焦的 254 纳米紫外线照射。交联完成后，使用真空过滤装置过滤细胞。将带有过滤后细胞的膜卷起，放入标记为 T0 的 50 毫升锥形管中。将剩余细胞分别过滤到六个不同的滤膜上，然后将滤膜放入三升预热的诱导应激的培养基中，用移液器剧烈吹打混合 50 秒。在预定的时间点继续以 500 毫升体积对细胞进行交联，并将样品储存在 -80 摄氏度条件下。为交联贴壁细胞，将含有细胞的石英培养皿转移至专用托盘中，用300毫焦的254纳米紫外线照射。立即将培养皿置于冰上。吸去培养皿中的培养基，加入10毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。用刮棒收集细胞，并转移至15毫升锥形管中。然后在4°C条件下，以300 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。用PBS洗涤细胞后，吸除PBS，并将细胞沉淀在干冰上速冻。根据需要将样品储存于-80°C。将离心机设置为 4 摄氏度，并为每个样品准备两排 1.5 毫升离心管用于洗脱。短暂离心带有镍珠的层析柱以去除空隙体积。然后将层析柱放入第一排洗脱管中，并向其中加入 200 微升洗脱缓冲液。两分钟后，迅速离心柱子并将其转移至第二排管中。然后重复之前所示的洗脱步骤。完成后，将所有洗脱液收集到一个5 mL的离心管中，并加入2 µL浓度为20 mg/mL的糖原。然后向样品中加入 100 µL 三氯乙酸，涡旋振荡 30 秒。用丙酮洗涤样品后，将其重悬于 30 µL 蛋白上样缓冲液中。接着，使用盖革计数器检测放射活性。将样品在 65 摄氏度加热 10 分钟，然后上样至厚度为 1 毫米的 4%～12% 预制 Bis-Tris 凝胶。在 MOPS 缓冲液中以 125 伏电压电泳 90 分钟。电泳结束后，用保鲜膜包裹凝胶，并用胶带将其固定于避光暗盒内侧。将凝胶暴露于自显影胶片后，通过剪去覆盖凝胶的保鲜膜来显影胶片，注意不要移动凝胶以免造成图像偏移。将胶片覆盖在凝胶上，切下目标条带。将凝胶切片放入一个2毫升离心管中，并用P1000移液器吸头将其碾碎。然后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K，在55摄氏度下剧烈振荡孵育样品。将cDNA上样至预制的6% TBE胶中，以100伏电压电泳1小时，并使用合适的DNA分子量标记物对短DNA片段进行定量。电泳结束后，将凝胶放入一个密封容器中，加入足量TBE缓冲液以浸没凝胶，再加入适量SYBR Safe染料。室温下染色15分钟。然后用新鲜的TBE缓冲液替换含SYBR的缓冲液，在轻微振荡条件下洗涤凝胶10分钟。倒掉 TBE 缓冲液，将凝胶放入透明文件夹中。将文件夹裁剪至合适大小，用成像仪对凝胶成像。切下 175 至 400 个碱基对之间的 DNA 片段，将凝胶块放入 1.5 毫升离心管中。用P1000移液枪枪头捣碎凝胶，并加入400微升水。然后在37摄氏度下振荡孵育一小时。将样品在干冰上冷冻10分钟。然后在 37 摄氏度下重复孵育。将两片玻璃微纤维滤膜插入置于离心管中的滤柱内。接着，使用剪去尖端的 P1000 移液器吸头将 TBE 凝胶悬浮液转移至滤膜装置中，并在 17,000 G 离心 30 秒。本方案用于监测酵母细胞在葡萄糖饥饿环境下Nrd1与RNA的相互作用。样品在转移至无葡萄糖培养基前进行交联，并在转移后1、2、4、8、14和20分钟分别进行交联。实验获得的放射自显影结果显示，在Nrd1预期的分子量位置有强烈的信号，代表该蛋白结合了短的放射性标记RNA，这些RNA不适合进行测序。将位于此条带上方的信号（即与较长RNA片段交联的蛋白质）进行分离。为了改进适用于哺乳动物细胞的动力学CRAC实验流程，特别设计了一个阶段，以实现对贴壁细胞培养皿的紫外照射。通过稳定标记的GFP-RBM7蛋白的交联与捕获实验，检测了该装置的效率。该交联剂能够利用254纳米紫外照射从哺乳动物细胞中回收蛋白-RNA复合物，其效率可与广泛使用的紫外照射装置相媲美。在交联过程中使用紫外透射型石英培养皿进一步提高了蛋白-RNA复合物的回收率。Nrd1的数据表明，该蛋白结合多种非编码RNA转录本，提示其参与了这些转录本的降解过程。还证明了与编码HXT6和HXT7的转录本结合，这两种基因在葡萄糖饥饿期间均上调表达。动力学CRAC技术可用于测量蛋白质与RNA在细胞发育、应激反应以及大分子复合物（如核糖体或剪接体）组装过程中的动态相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用χCRAC以高时间分辨率监测体内蛋白质-RNA相互作用动力学

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比率型双分子信标（RBMBs）可用于在活细胞中对单个工程化RNA转录本进行成像。本文中，我们描述了RBMBs的制备与纯化方法，通过微孔电穿孔将RBMBs递送至细胞，以及实时荧光成像单个RNA转录本的过程。...

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我们介绍了利用HeLa细胞研究哺乳动物细胞周期中双链RNA结合蛋白激酶RNA激活型（PKR）的RNA相互作用分子的实验方法。该方法利用甲醛交联RNA-PKR复合物，并通过免疫沉淀富集与PKR结合的RNA。这些RNA可进一步通过高通量测序或定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行分析。...

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶RNA激活剂的RNA相互作用分子

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在 Escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mRNA 的时空动力学

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外...

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

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利用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内核磁共振监测人体细胞中的蛋白质-配体相互作用

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RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法

本实验方案旨在实现对Riboglow探针进行定量的荧光寿命测量，从而建立可重复的体外、活体哺乳动物细胞以及三维细胞模型中的RNA成像工作流程。我们概述了样品制备、探针递送、数据采集以及定量分析的工作流程，以提取无偏倚的荧光寿命测量结果。...

表征 Riboglow 探针 体外 作为活体哺乳动物细胞及三维细胞模型中荧光寿命成像的基础

了解Kinetic CRAC方法用于活细胞中蛋白质-RNA相互作用的高时间分辨率研究。本方案涵盖酵母培养、紫外交联、细胞收获、蛋白质纯化及测序文库制备等关键步骤，适用于神经科学和细胞生物学研究。

使用χCRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

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