使用χCRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态
2020年5月9日
动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。
动力学CRAC可用于在前所未有的短时间尺度上研究RNA与RNA结合蛋白之间的时间关联。当与我们的交联剂结合使用时，动力学CRAC能够在数秒内对活细胞进行交联，从而减少紫外线损伤反应，并促进在分钟级分辨率下对胁迫响应的研究。
动力学CRAC是一种非常冗长的实验流程，对新手用户而言可能具有挑战性。此外，RNA操作本身也存在诸多困难。为防止RNA降解，应过滤除菌所有溶液，并确保移液器和实验台面保持清洁。
该方法的可视化演示至关重要，因为其中一些步骤并不十分直观，包括溶液中微生物的紫外交联与细胞收集，以及从凝胶中提取交联RNA的过程。对溶液中的微生物进行紫外交联时，需用酵母接种3.5升所需培养基，使初始OD 600为0.05，并在30摄氏度下以180 rpm持续振荡培养过夜。
当细胞达到所需 OD 值后，立即将 500 毫升培养物倒入 Vari-X-linker 交联剂中，并用 250 毫焦的 254 纳米紫外线照射。交联完成后，使用真空过滤装置过滤细胞。将带有过滤后细胞的膜卷起，放入标记为 T0 的 50 毫升锥形管中。将剩余细胞分别过滤到六个不同的滤膜上，然后将滤膜放入三升预热的诱导应激的培养基中，用移液器剧烈吹打混合 50 秒。在预定的时间点继续以 500 毫升体积对细胞进行交联，并将样品储存在 -80 摄氏度条件下。
为交联贴壁细胞，将含有细胞的石英培养皿转移至专用托盘中，用300毫焦的254纳米紫外线照射。立即将培养皿置于冰上。吸去培养皿中的培养基，加入10毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。用刮棒收集细胞，并转移至15毫升锥形管中。
然后在4°C条件下，以300 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。用PBS洗涤细胞后，吸除PBS，并将细胞沉淀在干冰上速冻。根据需要将样品储存于-80°C。
将离心机设置为 4 摄氏度，并为每个样品准备两排 1.5 毫升离心管用于洗脱。短暂离心带有镍珠的层析柱以去除空隙体积。然后将层析柱放入第一排洗脱管中，并向其中加入 200 微升洗脱缓冲液。
两分钟后，迅速离心柱子并将其转移至第二排管中。然后重复之前所示的洗脱步骤。完成后，将所有洗脱液收集到一个5 mL的离心管中，并加入2 µL浓度为20 mg/mL的糖原。
然后向样品中加入 100 µL 三氯乙酸，涡旋振荡 30 秒。用丙酮洗涤样品后，将其重悬于 30 µL 蛋白上样缓冲液中。接着，使用盖革计数器检测放射活性。
将样品在 65 摄氏度加热 10 分钟，然后上样至厚度为 1 毫米的 4%～12% 预制 Bis-Tris 凝胶。在 MOPS 缓冲液中以 125 伏电压电泳 90 分钟。电泳结束后，用保鲜膜包裹凝胶，并用胶带将其固定于避光暗盒内侧。
将凝胶暴露于自显影胶片后，通过剪去覆盖凝胶的保鲜膜来显影胶片，注意不要移动凝胶以免造成图像偏移。将胶片覆盖在凝胶上，切下目标条带。将凝胶切片放入一个2毫升离心管中，并用P1000移液器吸头将其碾碎。
然后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K，在55摄氏度下剧烈振荡孵育样品。将cDNA上样至预制的6% TBE胶中，以100伏电压电泳1小时，并使用合适的DNA分子量标记物对短DNA片段进行定量。电泳结束后，将凝胶放入一个密封容器中，加入足量TBE缓冲液以浸没凝胶，再加入适量SYBR Safe染料。
室温下染色15分钟。然后用新鲜的TBE缓冲液替换含SYBR的缓冲液，在轻微振荡条件下洗涤凝胶10分钟。
倒掉 TBE 缓冲液，将凝胶放入透明文件夹中。将文件夹裁剪至合适大小，用成像仪对凝胶成像。切下 175 至 400 个碱基对之间的 DNA 片段，将凝胶块放入 1.5 毫升离心管中。
用P1000移液枪枪头捣碎凝胶，并加入400微升水。然后在37摄氏度下振荡孵育一小时。将样品在干冰上冷冻10分钟。
然后在 37 摄氏度下重复孵育。将两片玻璃微纤维滤膜插入置于离心管中的滤柱内。接着，使用剪去尖端的 P1000 移液器吸头将 TBE 凝胶悬浮液转移至滤膜装置中，并在 17,000 G 离心 30 秒。
本方案用于监测酵母细胞在葡萄糖饥饿环境下Nrd1与RNA的相互作用。样品在转移至无葡萄糖培养基前进行交联，并在转移后1、2、4、8、14和20分钟分别进行交联。实验获得的放射自显影结果显示，在Nrd1预期的分子量位置有强烈的信号，代表该蛋白结合了短的放射性标记RNA，这些RNA不适合进行测序。
将位于此条带上方的信号（即与较长RNA片段交联的蛋白质）进行分离。为了改进适用于哺乳动物细胞的动力学CRAC实验流程，特别设计了一个阶段，以实现对贴壁细胞培养皿的紫外照射。通过稳定标记的GFP-RBM7蛋白的交联与捕获实验，检测了该装置的效率。
该交联剂能够利用254纳米紫外照射从哺乳动物细胞中回收蛋白-RNA复合物，其效率可与广泛使用的紫外照射装置相媲美。在交联过程中使用紫外透射型石英培养皿进一步提高了蛋白-RNA复合物的回收率。Nrd1的数据表明，该蛋白结合多种非编码RNA转录本，提示其参与了这些转录本的降解过程。
还证明了与编码HXT6和HXT7的转录本结合，这两种基因在葡萄糖饥饿期间均上调表达。动力学CRAC技术可用于测量蛋白质与RNA在细胞发育、应激反应以及大分子复合物（如核糖体或剪接体）组装过程中的动态相互作用。
概述
动力学交联与cDNA分析（Kinetic CRAC）是一种用于在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用的方法。本实验方案详细描述了酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备的各个步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 动力学CRAC技术可用于研究RNA及其结合蛋白在时间维度上的相互作用。
- 该方法可最大限度减少紫外线引起的细胞损伤反应，有助于应激反应相关研究。
- 该技术的挑战包括RNA降解以及实验流程的复杂性。
- 直观的实验演示对于理解该方法至关重要。
研究目的
- 研究活细胞中蛋白质与RNA的相互作用。
- 提供一种用于动力学CRAC的详细实验方案。
- 提高哺乳动物细胞中交联反应的效率。
使用的方法
- 酵母培养物生长与紫外线交联。
- 细胞收集与RNA提取。
- 使用镍珠进行蛋白质纯化。
- 下一代测序文库制备。
主要结果
- 在酵母中成功监测到 Nrd1 与 RNA 的相互作用。
- 开发出适用于哺乳动物细胞的紫外光透射石英培养皿。
- 利用新装置高效回收蛋白质-RNA 复合物。
- 在放射自显影中观察到预期分子量位置的强信号。
结论
- 动力学CRAC是研究RNA相互作用的有力工具。
- 该实验方案可针对多种细胞类型进行调整。
- 可视化辅助工具和精细操作对实验成功至关重要。
常见问题
行业应用价值
对蛋白质-RNA 相互作用动态进行高分辨率监测，对于降低早期发现阶段靶点验证的风险以及理解调控机制至关重要。χCRAC 实验方案能够在活细胞中精确地在时间维度上绘制 RNA 结合蛋白的相互作用图谱，从而提高对信号通路解析的预测可信度。该技术能力通过阐明细胞应激和发育过程中的分子机制作用，为研发管线的决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在生理条件和应激条件下直接测量动态的RBP-RNA相互作用。
- 通过揭示瞬时调控复合物及其形成时机，支持机制层面的风险评估。
- 通过捕获实时结合事件，提高功能靶点验证的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 有助于制备经过验证的生物系统，用于下游调节剂的筛选。
- 提供定量的、时间分辨的检测读数，以实现检测方法的标准化和可重复性。
- 可在多个时间点对化合物对RBP-RNA动态的影响进行稳健评估。
转化与临床前研究
- 通过捕捉体内快速的分子响应，与疾病相关的应激模型相一致。
- 通过随时间推移绘制调控网络，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过识别依赖于特定环境的RNA-蛋白质相互作用，为风险调整后的研发推进提供依据。
流程与工作流整合
χCRAC 通过在细胞扰动过程中实现RNA-蛋白质相互作用的高分辨率定位，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- 发现生物学：在活细胞中提供用于假设检验和通路解析的时间序列数据。
- 筛选：提供可重复的定量输出，用于评估化合物对RBP-RNA复合物的影响。
- 分析：生成基于测序的测量结果和放射自显影读数，用于比较分析。
- 转化研究：通过捕捉应激诱导的调控变化，将机制性见解与疾病模型相连接。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，可适配于酵母和哺乳动物系统，服务于多样化的研发项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化高时间分辨率的工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项或终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：通过阐明动态调控机制，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备RNA操作和交联技术的专业知识，以防止降解。
- 需要专用的紫外照射和细胞收集设备，以实现高效率。
- 需要严格的跨团队标准化，以确保样本处理和分析的可重复性。
- 通过适当的硬件修改，可适用于酵母和哺乳动物模型。
- 实验方案的复杂性和RNA稳定性是实际限制因素，需要仔细的培训和对照措施。
